HPLC法同時測定地參中3種三萜酸的含量

黃小蘭,何旭峰,周 濃,陽文武,楊 勤,王 騫,郭冬琴,*

(1.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院,三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室,重慶 404100;2.重慶市萬州食品藥品檢驗所,重慶 404100;3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)學(xué)院,重慶 404100)

地參又名蟲草參、地筍,為唇形科植物毛葉地瓜苗(LycopuslucidusTurcz. var.hirtusRegel)的干燥根莖,具有化瘀止血、益氣利水之功效,治黃疸,臨床上常用于治療急性黃疸型肝炎、濕熱型慢性肝炎[1-2],其地上部分為傳統(tǒng)藥食同源中藥材澤蘭,具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀消癰、利水消腫之功效,臨床常用于月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀血腹痛、瘡癰腫毒、水腫腹水[2]。地參主產(chǎn)于云南、重慶、山東、四川、陜西、河北及東北等地,具有較高的營養(yǎng)保健功能,是藥食兼用藥用植物,可作為蔬菜食用,其功能與冬蟲夏草相似,享有“蔬菜珍品”、“山中之王”等美譽,是我國名貴的中藥材之一[3-5]。地參在民間常制作成具有一定保健營養(yǎng)功能的休閑食品,如蜜酥地參、油炸地參、干地參、地參枸杞復(fù)合飲料、地參棗茶等[6-7]。因此,在倡導(dǎo)健康飲食潮流的今天,地參作為一種保健蔬菜,在日常食補或疾病康復(fù)中扮演著日益重要的角色,與人民健康密切相關(guān)。

研究表明,地參主要活性成分為萜類與甾體、酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油等成分[8-10],具有抗氧化、降血脂、降血糖、增強免疫功能、抗腫瘤、減肥等藥理作用[11-14]。前期研究表明,澤蘭含有白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸[9,12],而這3種三萜酸具有抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎、保肝等藥理作用[15-18],與地參的藥理作用具有一定的關(guān)聯(lián)性,可作為地參品質(zhì)評價的指標(biāo)之一。因此,測定地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸具有一定的價值和意義。

目前,對于地參地上部位即澤蘭[2]中三萜酸類化合物含量測定的文獻多集中在白樺脂酸[19]、熊果酸[20]和齊墩果酸[21]等成分,鮮見同時測定地參中3種三萜酸含量的文獻報道。本研究采用高效液相色譜法(HPLC)對不同產(chǎn)地地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸含量進行研究,以期為地參藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和產(chǎn)品開發(fā)利用提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地參 自采或委托采集于云南大理州(S1)、廣西玉林市(S2)、江蘇徐州市(S3)、重慶萬州(S4)等4個地參栽培基地,重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周游博士鑒定為唇形科植物毛葉地瓜苗(LycopuslucidusTurcz. var.hirtusRegel)的干燥根莖;白樺脂酸對照品(純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計算大于98%) 成都德思特生物技術(shù)有限公司;齊墩果酸對照品(純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計算大于98%) 成都德思特生物技術(shù)有限公司;熊果酸對照品(純度經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計算大于98%) 成都德思特生物技術(shù)有限公司;甲醇 色譜純,迪馬科技;三氟乙酸 分析純,成都科龍試劑化工廠;無水乙醇 色譜純,成都科龍試劑化工廠。

LC-20AT型高效液相色譜儀 日本島津公司;Milli-Q Advantage A10超純水機 美國Millipore公司;Sigma4-16S型高速離心機 德國Sigma公司;IKA MS3型渦旋混合器 德國IKA公司;Sartorius SQP型分析天平 德國Sartorius公司;KH-2000DB型超聲波清洗機(功率:2000 W,頻率:40 kHz) 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 地參樣品中3種三萜酸的提取

1.2.1.1 提取工藝 將干燥的地參根莖粉碎稱重,置50 mL離心管中,按比例加入乙醇溶液[22],渦旋30 s,在一定時間和功率下超聲提取[21,23],離心轉(zhuǎn)移上清液,用乙醇溶液復(fù)提2次,合并提取液,以乙醇溶液定容至刻度,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜后,HPLC檢測計算白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的含量。

1.2.1.2 單因素實驗 精密稱取地參粉末(S1)1.0 g,置100 mL具塞錐形瓶中,固定超聲波功率為300 W,提取時間30 min,探究乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%、100%)對3種三萜酸提取率的影響;固定提取溶劑為無水乙醇,提取時間30 min,探究超聲功率(100、200、300、400 W)對3種三萜酸提取率的影響;固定提取溶劑為無水乙醇,提取功率300 W,探究提取時間(15、30、45、60 min)對3種三萜酸提取率的影響;平行測定3次,研究改變某一因素對地參三萜酸的影響。分別在最佳色譜條件下進樣,進行峰面積測定,計算地參中3種三萜酸類化合物的含量。

1.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取減壓干燥至恒重的白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸對照品適量,加甲醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為1.0123、0.9918、0.9918 mg/mL的對照品貯備液,備用。

1.2.3 樣品溶液的制備 取地參粉末(過30目篩)1.0 g,精密稱量,平行3次,置50 mL離心管中,加無水乙醇15 mL,渦旋30 s,超聲提取30 min(超聲功率300 W,工作頻率40 kHz),4000 r/min離心5 min,取上清液于50 mL棕色容量瓶中,殘渣再次加入15 mL無水乙醇復(fù)提2次。合并上清液,以無水乙醇定容至刻度,搖勻,過0.22 μm微孔濾膜待測,即得。

1.2.4 色譜條件的優(yōu)化

1.2.4.1 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器分別對3種三萜酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在190～400 nm區(qū)間段進行掃描,確定3種三萜酸最佳的檢測波長。

1.2.4.2 色譜柱的選擇 以甲醇-0.03%三氟乙酸水溶液(pH=3.5)作為流動相,在柱溫30 ℃,流速0.8 mL/min條件下分別考察含碳量為8.0%、17.0%、27.0%的C18色譜柱對3種三萜酸分離度的影響。

1.2.4.3 流動相體系的選擇 在最佳色譜柱條件下,柱溫30 ℃,流速0.8 mL/min,以甲醇-水系統(tǒng)為基礎(chǔ),分別用三氟乙酸調(diào)節(jié)流動相的pH為2.5、3.5、4.5、5.5,考察不同pH對3種三萜酸分離效果的影響。

1.2.4.4 柱溫的選擇 在最佳色譜柱、pH條件下,流速0.8 mL/min,考察柱溫分別在20、25、30、35 ℃時3種三萜酸分離效果。

1.2.4.5 流速的選擇 在最佳色譜柱、pH、柱溫條件下,考察流速分別為0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL/min時3種三萜酸分離效果的影響。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線性關(guān)系、檢出限和定量限的考察 分別精密吸取1.2.2項下各對照品貯備液0.025、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL,分別置10 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,得到一系列不同質(zhì)量濃度的3種三萜酸混合對照品溶液,置于4 ℃的冰箱內(nèi),臨用前以0.22 μm微孔濾膜濾過,按照最佳色譜條件依次進樣分析,記錄色譜圖,以3種三萜酸的保留時間、理論塔板數(shù)、拖尾因子和分離度考察方法的系統(tǒng)適用性。以各對照品的峰面積積分值(y)與其相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢出限(limit of determination,LOD)為3倍信噪比,定量限(limit of quantifification,LOQ)為10倍信噪比,按照信噪比S/N=3和S/N=10確定3種三萜酸的檢出限和定量限。

1.2.5.2 精密度試驗 取同一混合對照品溶液,連續(xù)進樣6次,按最佳色譜條件測定各三萜酸的峰面積,分別計算各成分峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,以考察儀器的精密度。

1.2.5.3 重復(fù)性試驗 取地參粉末(S4)6份,按1.2.3項下方法制備樣品溶液,按最佳色譜條件測定各三萜酸的峰面積,分別計算各成分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,以考察方法的重復(fù)性。

1.2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取地參供試品溶液(S4),在室溫下密閉放置,分別在0、2、4、6、8、12 h按最佳色譜條件測定各三萜酸的峰面積,分別計算各成分含量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,以考察本樣品的穩(wěn)定性。

1.2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的地參粉末(S4)0.50 g,共6份,分別精密加入白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸對照品溶液適量,按1.2.3項下方法制備樣品溶液,按最佳色譜條件測定各三萜酸的峰面積,分別計算白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的加樣回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差,以驗證該方法的準(zhǔn)確性。

1.2.6 樣品的含量測定 分別取4批地參粉末(過30目篩)1.0 g,精密稱量,平行3份,按1.2.3項下方法制備樣品溶液,按最佳色譜條件測定并記錄色譜圖,應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別計算3種三萜酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 地參中3種三萜酸的提取條件優(yōu)化

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對地參三萜酸提取量的影響 由圖1可看出,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,地參中白樺脂酸、熊果酸的含量相應(yīng)提高,齊墩果酸含量增加趨勢不明顯,3種總?cè)扑岷砍尸F(xiàn)增加趨勢,當(dāng)提取溶劑為100%乙醇即無水乙醇時,三萜酸總含量最高。因此,本實驗選擇無水乙醇作為提取溶劑為宜。

圖1 不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取效率的影響Fig.1 Effect of different volume fractions ofalcohol on extraction efficiency

2.1.2 超聲功率對地參三萜酸提取量的影響 由圖2可看出,隨著超聲功率的增大,地參中白樺脂酸、熊果酸以及總?cè)扑岷吭黾?當(dāng)超聲功率超過300 W時,三萜酸總含量趨于平穩(wěn)。因此,本實驗選擇300 W作為提取功率。

圖2 超聲功率對提取效率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction efficiency

2.1.3 提取時間對地參三萜酸提取量的影響 由圖3可知,隨著提取時間的延長,地參中白樺脂酸、熊果酸以及總?cè)扑岷砍尸F(xiàn)出先增加后減少趨勢,當(dāng)提取時間為30 min時,三萜酸總含量最高。因此,本實驗選擇提取時間為30 min。

圖3 提取時間對提取效率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction efficiency

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 檢測波長的確定 通過對白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進行光譜掃描,結(jié)果如圖4所示,白樺脂酸在204 nm、齊墩果酸和熊果酸在205 nm處有最大吸收峰,考慮到流動相中甲醇的截止波長為205 nm,為了避免干擾[24],本方法確定210 nm為檢測波長。

圖4 白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的光譜掃描圖Fig.4 The diode array scanning spectrogram ofbetulinic acid,oleanolic acid and ursolic acid

2.2.2 色譜柱的選擇 由于被測物質(zhì)白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的分子量相當(dāng)、結(jié)構(gòu)相似、極性差異小、存在同分異構(gòu)體,比較適合在酸性條件下使用高惰性、全封端的C18色譜柱分析。由圖5可知,通過比較不同含碳量的C18色譜柱對分離度的影響,結(jié)果表明含碳量為27.0%的色譜柱Diamonsil C18(2)(5 μm,4.6 mm×250 mm)對3種三萜酸化合物具有良好的分離效果,特別是齊墩果酸和熊果酸分離度能達到1.60以上,且色譜柱Diamonsil C18(2)適用于更寬的pH范圍(1.5～9.0),耐酸性較強,更有利于3種三萜酸化合物的分離。因此,最終選擇本實驗室的Diamonsil C18(2)(5 μm,4.6 mm×250 mm)色譜柱,且通過實驗驗證Diamonsil C18(2)色譜柱的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。

圖5 不同含碳量的C18色譜柱對分離效果的影響Fig.5 Effect of C18 column with differentcarbon content on separation result注:1.白樺脂酸;2.齊墩果酸;3.熊果酸;圖6、圖7同。

2.2.3 流動相體系的選擇 由于三萜酸類化合物在水中發(fā)生弱電離,呈弱酸性,以甲醇-水為流動相反相分離白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸時,弱酸環(huán)境有利于3種物質(zhì)的分離分析。因此,水溶液的pH和甲醇比例是重要的影響因素[24-25]。由圖6可知,當(dāng)用三氟乙酸將pH調(diào)至2.5～3.5時,目標(biāo)物均能實現(xiàn)峰形尖銳對稱且分離效果良好,但pH=2.5時,基線更加平穩(wěn),保留時間適中。本方法同時還考察了流動相的比例,結(jié)果顯示選擇甲醇∶三氟乙酸水溶液(pH=2.5)=89∶11 (v∶v)作為流動相效果最佳。

圖6 不同pH對峰形和分離效果的影響Fig.6 Effects of different pH valueson peak shape and separation result

2.2.4 柱溫的選擇 通過比較不同柱溫對白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸分離度的影響發(fā)現(xiàn):柱溫在20 ℃時,白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的分離度分別為4.67、4.21、1.88;25 ℃時為4.61、4.08、1.84;30 ℃時為4.14、4.01、1.61;35 ℃時為4.05、3.51、1.43。雖然柱溫在20～30 ℃范圍內(nèi)均能實現(xiàn)良好分離,分離度大于1.50,但溫度過低會造成系統(tǒng)壓力過高,靈敏度下降。本試驗選擇25 ℃為最終柱溫。

2.2.5 流速的選擇 通過比較不同流速對齊墩果酸和熊果酸分離度的影響,結(jié)果顯示:隨著流速的降低齊墩果酸和熊果酸的分離度有所提高,但太低會導(dǎo)致峰形不夠尖銳,檢測靈敏度降低,且延長了分析時間,流速過高不利于齊墩果酸和熊果酸的分離。因此,本試驗選擇0.8 mL/min為最終流速。

2.3 混合對照品和樣品的HPLC色譜測定結(jié)果

由圖7可見,3種三萜酸能有效分離,峰形良好,且雜質(zhì)干擾少,混合對照品中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的保留時間分別為22.636、26.098、27.529 min;理論塔板數(shù)分別為13570、14186、14457,拖尾因子分別為1.009、0.952、0.987;分離度分別為4.61、4.08、1.84。樣品中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的理論塔板數(shù)分別為10619、10838、10760,拖尾因子分別為1.000、0.996、0.958,分離度分別為3.83、3.60、1.62。結(jié)果表明,3種三萜酸異構(gòu)體色譜峰拖尾因子在0.95～1.05,與相鄰色譜峰的分離度均大于1.50,各峰的理論塔板數(shù)均大于10000,系統(tǒng)適應(yīng)性良好。

圖7 混合對照品(A)、地參樣品(B)的HPLC圖Fig.7 The HPLC chromatogram of mixed reference substance(A),and sample of Lycopus lucidus Turcz. var. hirtus Regel(B)

分別以白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸峰面積積分值(y)與其相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x)進行線性回歸,得回歸方程,相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍、檢出限(LOD)和定量限(LOQ),由表1可知:白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸分別在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.9999;檢出限為5～7 ng,定量限為16～22 ng,表明方法線性范圍寬,儀器靈敏度高。

表1 3種三萜酸化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 1 Regression equation,correlation coefficient,linear range,limit of detection(LOD)and limit of quantification(LOQ)of three triterpenic acids by HPLC

2.5 精密度

白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的平均峰面積(n=6)分別為151035、225848、212479,RSD分別為0.15%、0.34%、0.34%,表明高效液相色譜儀精密度良好。

2.6 重復(fù)性

地參(S4)中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的平均含量(n=6)分別為1.684、0.312、0.750 mg/g,RSD分別為0.62%、1.79%、0.60%,表明此實驗方法的重復(fù)性較好。

2.7 穩(wěn)定性

地參(S4)中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸平均含量(n=6)分別為1.690、0.310、0.750 mg/g,RSD分別為0.95%、2.77%、1.93%,表明供試品溶液至少在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率

地參中白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸的平均回收率在100.52%～103.77%范圍內(nèi),RSD在0.99%～2.42%范圍內(nèi),符合分析要求,結(jié)果見表2。表明上述實驗方法具有較高的回收率和準(zhǔn)確度,能應(yīng)用于地參中三萜酸化合物的檢測與分析。

表2 加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 2 Average recoveries of three triterpenic acids(n=6)

2.9 地參中三萜酸類化合物含量

按標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量,分別計算地參藥材中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸的含量,結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地地參中3種三萜酸類成分測定結(jié)果Table 3 The content of three triterpenic acids in the

結(jié)果表明:4個不同產(chǎn)地地參均含有豐富的白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸,3種三萜酸含量由高到低排序為:白樺脂酸>熊果酸>齊墩果酸,白樺脂酸是其主要活性成分,其含量較高,占到總量的60%以上,這與澤蘭[19-21]中3種三萜酸成分的研究結(jié)果類似。

不同產(chǎn)地地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸含量存在一定的差異,其中重慶萬州、廣西玉林的3種三萜酸含量較高,江蘇徐州、云南大理的3種三萜酸含量較低;廣西玉林(S1)、云南大理(S2)、重慶萬州(S3)、江蘇徐州(S4)等4個產(chǎn)地地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸3種三萜酸內(nèi)在的結(jié)構(gòu)比(即成分間量的比)[26]分別為1.000∶0.083∶0.289、1.000∶0.098∶0.350、1.000∶0.183∶0.444、1.000∶0.117∶0.221,平均結(jié)構(gòu)比為1.000∶0.120∶0.326。結(jié)果顯示同一品種地參藥材因產(chǎn)地不同其三萜酸類成分量及結(jié)構(gòu)比均具有一定差異,并沒有明顯的規(guī)律,這與黃瑜等[26]對小根蒜中核苷類含量的研究結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

地參是我國特有的有著諸多獨特性的民族民間藥材,資源豐富、市場商品價格低,極具開發(fā)價值。本研究建立了同時檢測地參中白樺脂酸、齊墩果酸、熊果酸含量的HPLC法。通過單因素實驗,采用超聲波輔助無水乙醇提取地參中的三萜酸,超聲功率為300 W,提取時間為30 min,三萜酸的提取含量可達到2 mg/g以上。通過優(yōu)化,得到最佳色譜條件:色譜柱為含碳量27.0%的Diamonsil C18(2)(5 μm,4.6 mm×250 mm);流動相為甲醇-0.03%三氟乙酸水溶液(pH=2.5)(89∶11,v∶v);檢測波長為210 nm;體積流量為0.8 mL/min;進樣量20 μL;柱溫25 ℃。利用建立的方法對4組地參樣品進行HPLC分析,結(jié)果顯示:不同產(chǎn)地的地參均含有白樺脂酸、齊墩果酸和熊果酸,其中白樺脂酸含量最高占60%以上。

本研究建立的方法前處理簡單,專屬性強、定量準(zhǔn)確、線性關(guān)系良好,精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率符合要求,可用于準(zhǔn)確測定地參中三萜酸類成分的含量,適用于地參藥材、飲片及其休閑食品生產(chǎn)過程的品質(zhì)控制指標(biāo),為地參藥材資源在保健食品方面的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。