芒果炭疽菌研究進展

李其利, 卜俊燕， 唐利華， 黃穗萍， 郭堂勛， 莫賤友

(廣西農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 廣西作物病蟲害生物學重點實驗室，廣西 南寧 530007)

芒果與香蕉、柑橘、蘋果、葡萄并稱世界五大水果，有著“熱帶果王”的美譽[1]。中國芒果主要分布在廣西、海南、廣東、云南、四川、福建、貴州和臺灣8省區(qū)，2014年中國芒果種植面積17.32萬公頃， 總產(chǎn)量143.77 萬噸[2]。芒果炭疽病是芒果生長期和采后的重要病害之一，在世界芒果產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[3]，在芒果生長期，可以造成高于10%的損失。炭疽菌有明顯的潛伏侵染現(xiàn)象，田間看似無病果實，常在后熟期和貯運期發(fā)病造成爛果，嚴重影響芒果的采后貯藏，造成的經(jīng)濟損失較為嚴重，貯運期損失一般為30%～50%，嚴重的高達100%[1]。本文從芒果炭疽病的癥狀、病原分類鑒定、生物學特性、侵染特性及致病機理等方面進行綜述，為深入研究該病的發(fā)生流行規(guī)律、抗病材料的選育及該病的綜合防治提供參考。

1 芒果炭疽病的癥狀

芒果炭疽病在葉片、花序、果實和枝梢上都可發(fā)生，且癥狀較為復雜。葉片感病初期出現(xiàn)不規(guī)則的褐色病斑，伴有黃暈。病斑可繼續(xù)擴大至不規(guī)則形、圓形，呈黑褐色。多個病斑相互融合形成大病斑，甚至葉片枯死。嫩葉感病后病斑稍微突起，部分穿孔。嫩枝受害產(chǎn)生黑色斑點并上下擴展，嚴重的形成回枯癥狀，病斑以上部分枝葉壞死，病部出現(xiàn)許多小黑點?；ㄐ蚋胁『蟪霈F(xiàn)黑褐色斑點，擴展形成圓形、條形斑。感病嚴重的花序變黑枯死，花蕾脫落，枯死[4]。未熟果實感病后，產(chǎn)生黑褐色小斑點。若果柄、果蒂感病，則果實很快脫落。成熟果實感病初期產(chǎn)生黑褐色圓形斑點，隨后擴展至圓形或不規(guī)則形大病斑，中間凹陷。發(fā)病嚴重時病斑互相融合，果皮表面黑色。病部果肉初期變硬，后期變軟腐。潮濕天氣下，病部常產(chǎn)生淡紅色分生孢子堆。此外，在臺農(nóng)一號、白象牙等部分品種果實上發(fā)現(xiàn)的紅點病，最終被證實為不同癥狀的芒果炭疽病[5-6]。

2 芒果炭疽病病原學

2.1 芒果炭疽菌的分類鑒定

前人報道的芒果炭疽病的病原菌主要有兩種，一種是無性階段炭疽菌屬膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sace，另一種是尖孢炭疽菌ColletotrichumacutatumJ.H. Simmonds。膠孢炭疽菌屬于半知菌亞門，腔孢綱，黑盤孢目，炭疽菌屬(Colletotrichum)，有性階段為子囊菌門小叢殼菌Glomerellacingulata(Stenem.)Spauld. et.Schrenk，后者為小叢殼屬G.acutatum。兩者為害癥狀基本一致[7-8]，其中膠孢炭疽菌C.gloeosporioides為主要病原菌[9]。

炭疽菌分類鑒定主要采用形態(tài)學鑒定和多基因分子鑒定方法相結合，形態(tài)學鑒定是最傳統(tǒng)也最重要的區(qū)分手段。傳統(tǒng)分類學指標有菌落培養(yǎng)特征，分生孢子、附著孢的形狀、大小，以及剛毛形態(tài)特征，分生孢子梗及產(chǎn)孢細胞的形態(tài)和大小，菌核、厚垣孢子的有無和形態(tài)特征[10]。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，Damm等[11]運用核糖體轉錄間隔區(qū)序列(ITS)、肌動蛋白基因(Actin gene-ACT)、幾丁質合成酶A基因(chitin synthase A gene-CHS I)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyeeraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene-GAPDH)、β-微管蛋白基因(β-tubulin-TUB2)和histone3(HIS3)基因進行聯(lián)合建樹分析，可將形態(tài)相似炭疽菌區(qū)分開來，并發(fā)現(xiàn)了4 個新種，Crouch等[12]將ITS、Apn2、Mat1/Apn1和Sod2基因位點進行聯(lián)合分析，對形態(tài)上極難區(qū)分識別的復合群C.gramincola區(qū)分開，并引入6個新種。形態(tài)特征結合多基因系統(tǒng)學鑒定炭疽菌屬真菌已成為發(fā)展趨勢(表1)。目前用于鑒定炭疽菌的基因位點中，不同基因位點可有效區(qū)分的種類不同，其中Apmat基因位點能較好區(qū)分炭疽菌屬真菌的大部分種，特別對于膠孢炭疽復合群，其單基因系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定結果與ITS、ACT、CHS、CAL、GAPDH、TUB2基因位點的聯(lián)合分析結果一致，可有效用于膠孢炭疽復合群的種類鑒定[13]。

根據(jù)現(xiàn)在的分類情況，膠胞炭疽菌是一個復合群，可分為22個種[24]，而尖孢炭疽菌也是一個復合群，可分為31個種[25]。目前世界上已報道的芒果炭疽病的病原菌有12種(表2)。Lima等[23]從巴西東北部的芒果上分離出炭疽菌，聯(lián)合 ACT、TUB2、CAL、GAPDH、GS、ITS六個基因分析，得到芒果炭疽菌的5個種類C.asianum、C.fructicola、C.tropicale、C.dianesei、C.karstii，其中C.dianesei是一個新種。Vieira等[26]從巴西伯南布哥州芒果中分離出炭疽菌，聯(lián)合ACT、TUB2、CAL、CHS-1、GAPDH、ITS基因得到C.asianum、C.cliviae、C.dianesei、C.fructicola、C.karstii、C.tropicale、C.siamense和一個新種C.endomangiferae。Ismail等[27]聯(lián)合TUB2和HIS3基因從意大利芒果中鑒定出C.karstii、C.kahawae。Calderón等[28]聯(lián)合ACT、CHS-1、GAPDH、ITS、ApMat五個基因位點，得到C.asianum、C.siamense、C.theobromicola(syn.C.fragariae)。 國內(nèi)報道的芒果炭疽菌種類較少，對采自攀枝花市仁和區(qū)的芒果葉斑病進行分離和純化，采用傳統(tǒng)形態(tài)鑒定法及ITS序列分析法對其鑒定，確定主要為膠孢炭疽菌[29]；一種芒果果實上形成紅點癥狀的病害“芒果紅點病”，最初被認為是一種新病害，后來經(jīng)過分離鑒定證實其為膠孢炭疽菌引起的炭疽病[5-6]；廣西的芒果炭疽病主要由3種炭疽菌引起，分別為亞洲炭疽菌(C.asianum)、暹羅炭疽菌(C.siamense)和果生炭疽菌(C.fructicola)，其中亞洲炭疽菌為優(yōu)勢種群[30]。海南臺農(nóng)芒果的采后炭疽病病原菌主要也為這3種炭疽菌，但其優(yōu)勢種和各種所占比例稍有不同[29]。最近有人在廣西發(fā)現(xiàn)C.scovillei也可引起芒果炭疽病[30]。我國芒果炭疽病的病原還未獲得詳細而系統(tǒng)的研究，一般都是對部分地區(qū)、部分分離來源(果實/葉片)的芒果炭疽病病原進行鑒定。國外已報道芒果炭疽病可由多種炭疽菌引起，我國各芒果產(chǎn)區(qū)生態(tài)環(huán)境差別大、品種多樣且產(chǎn)期不一致，病原種類也可能存在顯著差異。因此，有必要對我國以上八省(或自治區(qū))不同品種、不同地理來源以及不同發(fā)病部位的炭疽病進行系統(tǒng)鑒定，為芒果炭疽病的抗病育種、發(fā)生流行規(guī)律和田間防治提供參考。

表2 國內(nèi)外已報道的芒果炭疽菌種類

2.2 生物學特性

芒果炭疽菌在培養(yǎng)特征、菌絲生長、孢子萌發(fā)等生物學特性方面表現(xiàn)出種內(nèi)多樣性[28，37-38]。芒果膠孢炭疽菌營養(yǎng)生長和孢子形成的適溫范圍分別為20～31 ℃、25～31 ℃。pH 5.0～8.0菌絲生長較好；適宜產(chǎn)孢的pH值為3.5～4.5。螢光促進菌絲生長作用最強，紅光和藍光抑制菌絲生長[37]。附著胞形成的最適溫度為30 ℃，相對濕度在100%+水膜的條件下分生孢子萌發(fā)較好。分生孢子萌發(fā)的最適pH值為3.0～7.0，附著胞形成的最適pH值為3.0～6.0。胡美姣等[8]將尖孢炭疽菌和膠孢炭疽菌兩種芒果炭疽菌的生物特性進行比較，指出尖孢炭疽菌菌絲生長、孢子萌發(fā)及產(chǎn)孢的最適溫度分別為26、24和28 ℃。膠孢炭疽菌絲生長、孢子萌發(fā)及產(chǎn)孢的最適溫度分別為28、32和28 ℃，中性及近中性條件最有利于兩種炭疽菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長，pH值為3.0時有利于尖孢炭疽產(chǎn)孢，膠孢炭疽菌在pH值為7.0時產(chǎn)孢較多。含葡萄糖、蔗糖、果糖的培養(yǎng)基適宜于膠孢炭疽菌的菌絲生長，含淀粉的培養(yǎng)基利于其產(chǎn)生分生孢子；蔗糖、果糖有利于尖孢炭疽的菌絲生長，蔗糖和麥芽糖利于其產(chǎn)生分生孢子。胡美姣等[8]比較了芒果膠孢炭疽和尖孢炭疽菌兩種之間菌絲生長、產(chǎn)孢、孢子萌發(fā)及對藥劑敏感性等方面的差異，但并未比較不同溫度對其病斑擴展的影響(表3)，而Lima等[38]比較了溫度對C.asianum、C.dianesei、C.fructicola、C.karstii和C.tropicale五種芒果炭疽菌在芒果果實上病斑擴展的影響，結果顯示不同種芒果炭疽病菌最適發(fā)病溫度在25～30 ℃，病斑隨著溫度的增加而減小。其中C.asianum和C.dianesei的最適溫度分別是29.3 ℃和29.4 ℃，C.fructicola最適溫度是27.1 ℃，C.karstii和C.tropicale最適溫度分別是26.4、25.8 ℃。由于各芒果產(chǎn)區(qū)管理水平不一致，普遍存在打保險藥、濫用農(nóng)藥的現(xiàn)象，因此導致芒果炭疽菌對多菌靈、苯菌靈、甲基硫菌靈、咪鮮胺等藥劑的敏感性存在顯著差異[39-42]。通過簡單重復序列間區(qū)(Inter simple sequence repeat，ISSR)和隨機擴增多態(tài)性DNA分析(Random Amplification Polymorphic DNA，RAPD)擴增多態(tài)性技術分析芒果炭疽菌遺傳多樣性[43-45]，發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性與芒果炭疽菌抗藥性有一定相關性[43]。監(jiān)測和分析芒果炭疽菌對殺菌劑的敏感性，可防止或減緩芒果炭疽菌對殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生，從而有效減少化學農(nóng)藥的用量。了解各地芒果炭疽菌的致病力強弱，有助于抗病材料的選育和抗病品種在田間的合理布局。然而，前人的研究多集中在芒果炭疽菌形態(tài)、致病力及遺傳多樣性等方面，很少有關于致病力變異機制的報道。

表3 不同種芒果炭疽菌生物學特性差異

注： “-”表示未測定

2.3 侵染特性

芒果炭疽病菌可在芒果枝條和爛葉等帶病組織上存活兩年以上[46]，分生孢子盤生于芒果表皮下，成熟后沖破表皮釋放分生孢子。芒果炭疽菌的分生孢子和菌絲體是該病的主要初侵染源[47]，在條件適宜時形成大量的分生孢子，分生孢子進行侵染，以菌絲體在帶病枝梢、僵果及枯枝上越冬[3,48]。病菌還可在病殘體或果園的其他寄主上越冬，待來年氣溫回升，分生孢子可通過風雨、昆蟲等方式在田間傳播，孢子萌發(fā)后可產(chǎn)生附著胞，侵染釘穿透角質層并穿透表皮細胞壁侵入寄主體內(nèi)，雖然炭疽菌在10 ℃環(huán)境下可引起芒果葉片產(chǎn)生病斑[3]，但其最適溫度范圍在20～30 ℃。張賀等[41]研究發(fā)現(xiàn)，分生孢子在12～37 ℃范圍內(nèi)可萌發(fā)，形成附著胞的適宜溫度在24～28 ℃。接種后6 h，附著胞開始形成，9～12 h是形成的高峰期；分生孢子在相對濕度90%～100%范圍均可萌發(fā)且形成附著胞。相對濕度在88.4%以上最適宜病害發(fā)生，低于86%則發(fā)病率呈下降趨勢[49]。附著胞在形成后10～12 h后開始黑化并逐漸變?yōu)楹诤稚?，這一黑褐色斑點可能是侵染釘?shù)乃谖恢茫蛘呤歉街椭参锉砻娼M織之間的連接點[50]，但Diéguez-Uribeondo等[51]認為這個點與穿透孔是隨著侵染釘?shù)男纬梢约安≡诩闹骷毎麅?nèi)的定殖生長而產(chǎn)生。該病菌主要侵染嫩梢、嫩葉、花序和果實，病菌以侵染絲的形式在果實表皮潛伏，侵染初期無明顯癥狀，果實成熟或貯運期間才逐漸表現(xiàn)癥狀[52]。分生孢子產(chǎn)生的附著胞附著力和抗性較強，對干燥、高溫、紫外線以及寄主組織表皮微生物的拮抗作用等逆境條件都具有較強的抗逆性，有利于其在寄主上長期生存。當病菌潛伏侵染到達一定程度后，是否發(fā)病主要取決于寄主植物的生理狀況[53]。因此，溫暖高濕、連續(xù)降雨，則病害迅速發(fā)展造成流行。目前世界上報道的芒果炭疽菌種類越來越多，不同芒果炭疽菌的侵染特性是否存在差異，需要進一步研究。

2.4 致病機理

芒果膠胞炭疽菌侵染植物組織的過程中，產(chǎn)生成分較為復雜的植物毒素[54-55]，參與到芒果膠胞炭疽菌侵染植物組織的過程。該毒素在病原菌侵染過程中，可改變寄主植物組織細胞膜的通透性，有利于病原菌的侵入。此外，膠胞炭疽菌還會分泌果膠裂解酶、天冬氨酰蛋白酶、谷氨酸脫氫酶等一系列與致病相關的酶類，產(chǎn)生氨使環(huán)境pH值升高，并激發(fā)與致病相關的基因[56]。目前，已發(fā)現(xiàn)不同來源的芒果炭疽菌菌株對不同品種的芒果果實和葉子致病力存在顯著差異[57]，但其致病力變異的機理還需進一步研究。韋運謝等[58-59]對芒果膠孢炭疽菌漆酶基因Lac1和Lac2的序列特征進行探究，采用同源克隆、 SEFA-PCR 和 RT-PCR 技術對Lac1基因進行擴增，并對所獲得的Lac1基因進行了序列特征和預測蛋白保守結構域的分析，也采用同源克隆和RT-PCR法獲得膠孢炭疽菌漆酶基因Lac2。Lac1和Lac2基因具備真菌漆酶基因家族的序列特征，推測Lac1和Lac2基因可能與芒果炭疽菌的致病性有關。進一步研究表明漆酶基因Lac1，不僅影響致病性，而且影響病原菌的菌絲生長、分生孢子、附著胞的形成、色素沉著、黑色素生物合成、胞外水解酶的分泌及外源營養(yǎng)的利用等[60]。隨后，采用相同的方法克隆了芒果炭疽病菌小柱孢酮脫水酶基因SCD1[61]，內(nèi)切葡聚糖酶基因CgEg1B等基因[62]、谷氨酸轉運蛋白基因Cgglt1[63]，分析其序列特征、推測了其蛋白的保守結構域，并構建了敲除載體，但其基因的功能還需進一步驗證。芒果膠孢炭疽中與致病相關的基因還有很多，如何快速挖掘與致病相關基因，并研究其功能是需要進一步探討的問題。

3 展 望

炭疽菌屬真菌分類與鑒定常用的方法即傳統(tǒng)形態(tài)學分類、分子生物學分類、次生代謝特異性等。每種分類方法都各有裨益，需采用多相分類，將形態(tài)學鑒定、多基因分子鑒定、次生代謝產(chǎn)物分析等方法相結合鑒定炭疽菌屬真菌，從而提高分類的準確率。對于膠孢炭疽復合群(C.gloeosporioidesspecies complex)，由于Apmat單基因鑒定結果與多基因聯(lián)合分析鑒定結果一致，在通過ITS初步確定為膠孢炭疽菌后，可優(yōu)先考慮使用Apmat進行分子鑒定。目前世界上報道的芒果炭疽病的病原菌有12種：C.asianum、C.fructicola、C.siamense、C.tropicale、C.dianesei、C.karstii、C.scovillei、C.grossum、C.cliviae、C.endomangiferae、C.kahawae、C.theobromicola(syn.C.fragariae)，中國已經(jīng)報道的芒果炭疽病病原有4種：C.asianum、C.fructicola、C.siamense、C.scoville。然而，前人一般都是對我國部分地區(qū)的芒果炭疽病的病原菌進行分類鑒定。因此，全面了解我國芒果炭疽病的病原種類及優(yōu)勢種群，明確其致病力分化情況，可為深入研究該病的發(fā)生流行規(guī)律、抗病材料的選育和抗病品種在田間的合理布局提供參考；對我國芒果炭疽病菌的抗藥性進行系統(tǒng)分析，可防止或減緩芒果炭疽菌對殺菌劑抗藥性的產(chǎn)生，從而有效減少化學農(nóng)藥的用量，也是研究芒果炭疽病綠色防控新策略、新方法和新藥劑的基礎。中國不同地區(qū)芒果炭疽病病原菌是否只有已報道的4種，其優(yōu)勢病原菌是否一致，這些不同種炭疽菌在生物學特性、侵染特性等方面是否存在差異？芒果炭疽病菌有潛伏侵染特性，如何快速檢測芒果炭疽病菌不同種類，并研究其帶菌情況與病害發(fā)生的關系，可為該病防治提供參考。中國不同地理來源的芒果炭疽菌致病力存在較大差異，其致病力變異與地理來源是否存在關聯(lián)，致病力分化及擴散的分子機制如何？都是需要進一步研究的問題。此外，國內(nèi)外關于芒果炭疽菌致病機理的報道較少，今后需要進一步加強其致病機理研究，為芒果炭疽病的綠色防控提供參考。