放線菌分類地位的變遷及其系統(tǒng)學(xué)研究最新進展

李文均， 焦建宇

(1.中山大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510275；2.中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所 中國科學(xué)院干旱區(qū)生物地理與生物資源重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

典型的放線菌是一類革蘭陽性、高(G+C)mol%含量的細(xì)菌，因其菌落呈放線狀而得名。放線菌作為與人類生產(chǎn)和生活極為密切的微生物類群，其強大的代謝活性為人們所共識[1-2]。隨著大量免疫抑制劑、抗惡性細(xì)胞增殖、殺蟲劑、抗生素[3]等醫(yī)療實用組分在放線菌自然代謝產(chǎn)物中的發(fā)現(xiàn)，放線菌已經(jīng)成為新藥發(fā)現(xiàn)的主要來源[4]。放線菌作為細(xì)菌域最大的譜系之一，其門下物種繁多。隨著放線菌類群的逐漸增多，對放線菌系統(tǒng)學(xué)進行研究，解析物種之間的相互關(guān)系顯得十分必要。本文以放線菌系統(tǒng)學(xué)研究進展為主線，主要介紹放線菌系統(tǒng)學(xué)的研究方法、發(fā)展簡史、最新進展及未來的發(fā)展方向，為放線菌資源研究和開發(fā)利用提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 放線菌系統(tǒng)學(xué)的研究方法

從方法學(xué)的角度來講，放線菌系統(tǒng)學(xué)的研究方法與其他原核微生物一樣，經(jīng)歷了三個階段。

第一階段是建立在形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)上的，主要根據(jù)基內(nèi)菌絲和氣生菌絲的有無，基絲的顏色，色素的有無及顏色，孢子的有無、形狀及表面結(jié)構(gòu)等形態(tài)學(xué)特征來對放線菌的各個類群進行區(qū)分。大部分放線菌都能產(chǎn)生基內(nèi)菌絲，基內(nèi)菌絲再分化為氣生菌絲，而后形成孢子[5-6]，但有些放線菌不產(chǎn)生氣生菌絲因而也沒有孢子；部分放線菌的基內(nèi)菌絲呈單支，有的會形成分支，還有的基內(nèi)菌絲會很發(fā)達[7]；有些放線菌孢子直接在基內(nèi)菌絲形成，如Micromonospora、Micropolyspora和Thermoactinomycetes；而更多類群的孢子是由氣生菌絲分化形成，如Streptomyces。不同類群的放線菌，其孢子的形態(tài)存在差別，如平滑的、疣狀的、多毛的或者褶皺的等等[8]。放線菌之間所產(chǎn)孢子鏈的長度不一樣，如Micromonospora、Salinispora、Thermomonospora、Saccharomonospora和Promicromonospora只產(chǎn)生單個孢子，而Microbispora的孢子成對出現(xiàn)；Actinomadura、Saccharopolyspora、Sporicthya和一些Nocardia能產(chǎn)生較短的孢子鏈；Streptomyces、Nocardioides、Kitasatospora、Streptoverticillium和一些Nocardia孢子鏈上的孢子數(shù)可以達到100多個；而Frankia則能形成孢子囊。此外，放線菌還能產(chǎn)生各種顏色的色素，如紅色、藍色、橙色、橘色、棕色等，色素的產(chǎn)生會由于菌株的不同，培養(yǎng)基的不同以及培養(yǎng)時間的不同而發(fā)生不同的變化[9]，色素是區(qū)別放線菌類群的一個重要指標(biāo)，同時也是提高自身生存能力和競爭能力的有效策略。

第二階段建立在細(xì)胞化學(xué)特征上。這階段微生物的細(xì)胞化學(xué)成份如肽聚糖、脂肪酸、極性脂、醌以及細(xì)胞水解液糖組分被用來區(qū)分放線菌類群。脂肪酸的類型在不同屬之間有明顯差異，細(xì)菌脂肪酸鏈的碳原子數(shù)在2～90之間變化，但通常只有C10到C24的脂肪酸具有系統(tǒng)分類學(xué)意義。目前脂肪酸的鑒定主要借助于美國MIDI公司研制和開發(fā)的商品化Sherlock微生物鑒定系統(tǒng)。全細(xì)胞水解液糖組成對屬以上級別放線菌的劃分具有重要意義，根據(jù)全細(xì)胞水解液糖的不同，放線菌可被劃分為五種不同的類型。醌型主要有甲基萘醌和泛醌兩種類型，大多數(shù)細(xì)菌含有其中的一種，或者兩者都有，但放線菌類群普遍只有甲基萘醌[10]。肽聚糖對放線菌屬以上級別的劃分具有重要的意義，四肽鏈上第3位氨基酸的種類及肽橋中甘氨酸的有無都是用來對放線菌進行區(qū)別的重要指標(biāo)。

第三階段則是建立在分子特征上。這一階段主要是根據(jù)16S rRNA基因分析、DNA的堿基組成、特征性核苷酸及DNA-DNA雜交結(jié)果對放線菌類群進行區(qū)分?；谶@些分子特征，很多之前根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進行分類的放線菌被重新分類。然而近年來隨著測序技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的微生物有了基因組序列，基因組序列的出現(xiàn)又為微生物系統(tǒng)學(xué)帶來了新的挑戰(zhàn)與機遇。

經(jīng)過以上三階段的發(fā)展，放線菌系統(tǒng)學(xué)從理論和方法手段上都實現(xiàn)了質(zhì)的飛躍?，F(xiàn)代放線菌系統(tǒng)學(xué)形成了以基因組信息或16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育基礎(chǔ)之上，將表型研究、細(xì)胞化學(xué)特征研究和分子特征研究結(jié)合在一起，使得放線菌系統(tǒng)學(xué)研究越來越完善，越來越規(guī)范化。

2 放線菌系統(tǒng)學(xué)發(fā)展簡史

自1875年Cohn首次從人的淚腺中分離并報道1株絲狀病原菌——鏈絲菌以來，放線菌被人類所認(rèn)識和利用的研究歷史已有近145年。因絕大多數(shù)放線菌具有發(fā)育良好的菌絲體，19世紀(jì)以前人們曾將放線菌歸于真菌。隨著科學(xué)的發(fā)展及新技術(shù)的應(yīng)用，人們的認(rèn)識逐漸深入，才將放線菌列入細(xì)菌?？死骼锬峥品?Krassil′nikov)首先將放線菌列入植物界、原生植物門、裂殖菌綱。后有人認(rèn)為把無真正細(xì)胞核的放線菌歸于植物界不妥，因此將其列入動物界和植物界之外的原生生物界(Protista)內(nèi)。1968年Murray提出原核生物界(Prockaryotae)和真核生物界(Eucaryotae)之后，放線菌被歸于原核生物界。1978年，Gibbens和Murray根據(jù)細(xì)胞壁的有無和細(xì)胞壁的性質(zhì)建議將原核生物界分為薄壁菌門(Gracilicutes)，包括革蘭陰性細(xì)菌；厚壁菌門(Tenericutes)，包括革蘭陽性細(xì)菌；疵壁菌門(Mendosicutes)，包括無肽聚糖細(xì)胞壁的細(xì)菌；柔膜菌門(Mollicutes)，包括無細(xì)胞壁的枝原體類細(xì)菌，而放線菌被包括在厚壁菌門中。在1989年出版的《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》(Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology)中，放線菌被劃分在原核生物界，厚壁菌門，分枝菌綱(Thallobacteria)，放線菌目(Actinomycetales)。1987年，Woese通過對500多種生物的16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，提出了著名的生命三域?qū)W說，即真細(xì)菌域(Eubacteria)、古細(xì)菌域(Archaebacteria)和真核生物域(Eucaryota)。1990年，Woese等人通過rRNA及RNA聚合酶(RNA polymerase)分子結(jié)構(gòu)特征和序列的比較發(fā)現(xiàn)核苷酸分子的結(jié)構(gòu)和序列比表型更能揭示生命的進化關(guān)系，將地球上的生命分為三個基本類群，正式建立了三域分類系統(tǒng)，并將生物分類的最高等級命名為域(domain)。生命三域分別為古菌域(Archaea)、細(xì)菌域(Bacteria)和真核生物域(Eucarya)，每個域包含兩個或多個界(kingdom)，而放線菌當(dāng)時所屬的厚壁菌門歸于細(xì)菌域。

放線菌作為細(xì)菌域最大的微生物類群之一[11]，門下物種繁多、分類系統(tǒng)不穩(wěn)定，導(dǎo)致建立適用于放線菌門層級的分類系統(tǒng)是一個十分具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。1997年，Stackebrandt等[12]首次對放線菌綱下的物種以層級分類的方式進行系統(tǒng)地整理，并將放線菌綱分為5個亞綱，分別是Acidimicrobiadae、Actinobacteridae、Coriobacteridae、Rubrobacteridae和Sphaerobacteridae。隨后，在2004年將Sphaerobacteridae亞綱從放線菌綱中剔除，并歸類到綠彎菌門下[13]。5年后，隨著放線菌物種的逐漸增多，放線菌的分類單元開始快速擴展，Zhi XY[14]等在基于16S rRNA基因數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對放線菌類群進行重新整理，將另外放線菌的4個亞綱細(xì)分為5個目，其中包括Acidimicrobiales、Actinomycetales、Bifidobacteriales、Coriobacteriales和Rubrobacterales。隨著Nitriliruptoridae亞綱在2010年提出，此時，放線菌綱下共有5個亞綱[15]。在之后的幾年里，《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》簡化了微生物的系統(tǒng)層級關(guān)系，將亞綱、亞目提升到了綱和目的分類級別，并于2012年將放線菌綱下的亞綱(Actinobacteridae、Acidimicrobiadae、Coriobacteridae、Nitriliruptoridae和Rubrobacteridae)提升到了綱的水平(Actinobacteria、Acidimicrobiia,Coriobacteriia、Nitriliruptoria和Rubrobacteria)；此時，放線菌綱Actinobacteria僅包括先前Actinobacteridae下的類群[16]。此外，4個科(Conexibacteraceae、Patulibacteraceae、Solirubrobacteraceae和Thermoleophilaceae)從Rubrobacteria綱剝離出來，被再分類到一個新的綱Thermoleophilia。至此，放線菌門下純培養(yǎng)的類群包括Acidimicrobiia、Actinobacteria、Coriobacteriia、Nitriliruptoria、Thermoleophilia和Rubrobacteria6個綱(見圖1)。

圖1 基于基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的放線菌系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of Actinobacteria based on genomic information

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，基因組信息逐漸成為推斷物種之間進化關(guān)系、更新原核微生物分類系統(tǒng)不可缺少的重要證據(jù)[17]。近年來，越來越多的物種基于基因組系統(tǒng)學(xué)分析方法被再分類，例如Gupta等[18]將Mycobacterium再分類，重新歸類出了Mycobacillus、Mycobacteroides、Mycolicibacter和Mycolicibacterium四個新屬；Montero-Calasanz等[19]將Klenkia屬從Geodermatophilus剝離出來；Sen等[20]同樣通過基因組信息，將“Frankiales”目分類為包括Frankiales在內(nèi)的4個新目(Frankiales、Acidothermales、Geodermatophilales和Nakamurellales)；Nouioui等[21]基于基因組信息進行的系統(tǒng)發(fā)育分析，將100多個放線菌物種進行再分類，并提出了2個新目、8個新科、15個新屬。這些研究，顯示出了基于基因組序列進行的系統(tǒng)進化分析對于解決放線菌重分類問題的應(yīng)用前景。盡管越來越多的放線菌物種通過基因組系統(tǒng)學(xué)分析被再分類，然而到目前為止，仍有大量放線菌沒有可用的基因組序列，也就限制了基于基因組數(shù)據(jù)對放線菌部分類群的再分類應(yīng)用。例如，由于Friedmenniellaendophytica和Friedmenniellaluteola沒有基因組序列，導(dǎo)致Friedmenniella屬下的所有物種被再分類到Microlunatus屬的過程中，F(xiàn).endophytica和F.luteola既沒有被鑒定為Friedmenniella屬的模式菌株，也沒有被再分類到Microlunatus屬。然而這并不是個例，同樣的情況出現(xiàn)在Lechevalieriarhizosphaerae、Lysinimicrobiumsediminis、Verrucosisporaendophytica、Verrucosisporasonchi和Zimmermannellaalba等?；蚪M數(shù)據(jù)的缺失將導(dǎo)致這些物種在現(xiàn)有的分類系統(tǒng)中被逐漸遺忘。此外，盡管一些類群如Actinocatenispora、Aquipuribacter、Gaiella、Phytomonospora和Ornithinicoccus不論在系統(tǒng)發(fā)育位置還是表型上都與近緣物種差異明顯，但由于沒有適當(dāng)?shù)幕蚪M信息的支撐，很難將它們再分類到一個適宜的分類地位上。近年來，以基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)對原核微生物類群進行系統(tǒng)學(xué)分析已經(jīng)逐漸成為不可阻擋的勢頭，然而目前已測序的放線菌模式菌株僅占全部放線菌模式菌株的不到50%。盡管Genomic Encyclopedia of Bacteria and Archaea (GEBA)項目和一些研究單位正在對合格發(fā)表的微生物類群基因組進行測序，然而想要獲得全部物種的基因組數(shù)據(jù)仍需數(shù)十年的努力。目前來講，很難完全依賴基因組數(shù)據(jù)將放線菌進行重新整理，構(gòu)建完整放線菌系統(tǒng)學(xué)藍圖。

3 放線菌系統(tǒng)學(xué)研究的最新進展

近年來，通過基因組系統(tǒng)學(xué)的方法已經(jīng)開始對放線菌類群進行重新分類[20-21]，然而由于缺乏基因組數(shù)據(jù)，部分物種并未被再分類到相關(guān)類群。例如Friedmanniella、Lechevalieria、Lysinimicrobium和Verrucosispora分別被重新整合到Microlunatus、Lentzea、Demequina和Micromonospora下，但由于屬內(nèi)部分物種缺少基因組數(shù)據(jù)，因而并未被完全重新分類。近期，Salam等[22]通過16S rRNA基因及基因組系統(tǒng)進化分析，將放線菌物種進行再分類，將放線菌門下的物種類群重新整理為46個目、79個科、425個屬(表1)。其中包括新目16個、新科10個。最主要的再分類類群集中在Micrococcales目和Frankiales目等。此外，本研究通過系統(tǒng)進化關(guān)系和相對進化距離對Gaiellales目進行再分類，將其作為目的分類級別歸類于Thermoleophilia。同時，根據(jù)16S rRNA基因系統(tǒng)進化樹，對先前遺漏的分類單元進行重新合并。此外，本研究提議將放線菌綱的拉丁文Actinobacteria這一不合命名法規(guī)的名稱，依據(jù)ICNP中的法則8將其修訂為Actinomycetia。放線菌系統(tǒng)學(xué)的更新見表1。

表1 放線菌門屬及其以上等級分類

續(xù)表1-1

續(xù)表1-2

續(xù)表1-3

續(xù)表1-4

續(xù)表1-5

續(xù)表1-6

續(xù)表1-7

續(xù)表1-8

4 放線菌系統(tǒng)學(xué)研究的發(fā)展方向

微生物系統(tǒng)學(xué)的過去時是一部由方法學(xué)的革新而推動分類系統(tǒng)演變的科學(xué)史，其未來也將伴隨著方法學(xué)的更新和物種認(rèn)知的加深而逐步發(fā)展?；蚪M學(xué)發(fā)展至今，測序技術(shù)已經(jīng)從早期的一代測序技術(shù)Sanger測序[23]，步入到新一代測序技術(shù)的時代：包括了第二代測序技術(shù)(Next-Generation Sequencing, NGS)，以及目前已投入使用的基于單細(xì)胞測序為特點的第三代DNA測序技術(shù)[24]。新一代測序技術(shù)的發(fā)展，已將人們帶到了真正高通量、低成本的測序時代。這些技術(shù)的發(fā)展，從根本上改變了人類對于生命藍圖的認(rèn)識方式，并且推動了基因組學(xué)的分支學(xué)科及其他相關(guān)學(xué)科的興起。放線菌物種基因組的逐漸覆蓋及積累，將引領(lǐng)著放線菌系統(tǒng)學(xué)研究逐漸步入后基因組時代，并有望通過基因組數(shù)據(jù)對放線菌系統(tǒng)學(xué)的研究方法提供新的理論或方法。

隨著宏基因組和單細(xì)胞測序的普及，越來越多的未培養(yǎng)微生物類群被發(fā)現(xiàn)。2016年，Jilian F. Banfield課題組通過現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫的基因組以及宏基因組分裝得到的基因組數(shù)據(jù)，通過16個核糖體蛋白序列，構(gòu)建生命之樹，極大地擴展了我們對微生物多樣性的認(rèn)知[25]。之后，Parks等人通過將1 500多個宏基因組進行分析，獲得了近8 000個UBA (Uncultivated Bacteria and Archaea)基因組草圖，并以此為基礎(chǔ)，重新構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，從基因組層面上擴展了生命之樹[26]。這些研究，在刷新我們對生命之樹認(rèn)知的同時，同樣也擴展了放線菌物種多樣性。近年來，越來越多的科研工作者提議針對未培養(yǎng)微生物類群重新構(gòu)建一個新的分類系統(tǒng)，以此對其基因組進行更加深入的了解[27]。隨著組學(xué)時代的到來，越來越多的未培養(yǎng)放線菌類群基因組從環(huán)境樣品直接獲得，基因組數(shù)據(jù)的增加極大程度地擴展了其物種多樣性，然而很少有研究關(guān)注未培養(yǎng)放線菌類群的進化地位和生物學(xué)功能。那么未培養(yǎng)放線菌物種進化地位是如何的、是否有我們尚未認(rèn)知的高級分類單元、是否有一些新奇特的代謝功能，以及如何通過多組學(xué)的研究方式指導(dǎo)未培養(yǎng)放線菌類群進行富集分離？這些問題都將是未來值得探討的重點。