自主運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)Aβ降解酶調(diào)控Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積的機(jī)制研究

余鋒 賈芳芳 徐波 張憲亮

摘 要：目的：探析β-淀粉樣蛋白（β-amyloid， Aβ）降解酶在自主運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)APP/PS1轉(zhuǎn)基因（Tg-APP/PS1）小鼠海馬Aβ沉積過程中的作用機(jī)制。方法：C57系Tg-APP/PS1小鼠和C57系野生小鼠各34只分別隨機(jī)分為Tg-APP/PS1自主運(yùn)動(dòng)組（TE， n=17），Tg-APP/PS1安靜對(duì)照組（TC， n=17），野生自主運(yùn)動(dòng)組（E， n=17）和野生安靜對(duì)照組（C， n=17）。TE組和E組小鼠從3月齡開始，除給予日常飲食和飲水，施以16周自主運(yùn)動(dòng)，TC組和C組小鼠僅給予正常飲食、飲水。實(shí)時(shí)定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)海馬Aβ降解酶腦啡肽酶（neprilysin， NEP）、胰島素降解酶（insulin degrading enzyme， IDE）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme， ACE）、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶（endothelin-converting enzyme， ECE）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9， MMP-9）和纖溶酶（Plasmin， PL）的mRNA表達(dá)水平，Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NEP、IDE、ACE和MMP-9的蛋白表達(dá)，免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Aβ斑塊沉積情況。結(jié)果：1）16周自主運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了Tg-APP/PS1小鼠海馬NEP和IDE mRNA表達(dá)的極顯著性上調(diào)（P<0.01），促進(jìn)了ACE、MMP-9和PL mRNA表達(dá)的顯著性上調(diào)（P<0.05）;2） 16周自主運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了Tg-APP/PS1小鼠海馬IDE蛋白表達(dá)極顯著性上調(diào)（P<0.01），促進(jìn)了NEP、ACE和MMP-9的蛋白表達(dá)顯著性上調(diào)（P<0.05）;3） 16周自主運(yùn)動(dòng)顯著性下調(diào)了Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積（P<0.01）。結(jié)論：自主運(yùn)動(dòng)可通過上調(diào)海馬內(nèi)Aβ降解酶的基因和蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制Tg-APP/PS1小鼠海馬內(nèi)的Aβ沉積。

關(guān)鍵詞：自主運(yùn)動(dòng);阿爾茨海默病;APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠;Aβ沉積;Aβ降解酶

中圖分類號(hào)：G804.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-2076（2020）06-0072-09

Abstract：Objective： To observe the effects and mechanism of Aβ degradation enzyme on the hippocampal Aβ deposition in transgenic mice of Alzheimers disease （AD） after 16 weeks voluntary wheel running. Methods： 34 Male Tg-APP/PS1 mice and 34 wild type mice of three-month-old C57BL/6 strain were randomly divided into Tg-APP/PS1 voluntary wheel running group （TE， n=17）， Tg-APP/PS1 quiet control group （TC， n=17）， wild type voluntary wheel running group （E， n=17） and wild type quiet control group （C， n=17）. Mice in group TE and group E were subjected to wheel running with ad libitum access to food and water for 16 weeks from 3 months of age. Mice in group TC and group C were subjected to food and water ad libitum， without exercise. Real-time RT-PCR test was used to detect mRNA level of Aβ degradation enzyme， including NEP， IDE， ACE， ECE， MMP-9 and PL. Western blot test was used to detect protein level of NEP， IDE， ACE and MMP-9. Immunohistochemistry test was used to determine hippocampal Aβ deposition. Results： 1） After 16 weeks voluntary wheel running， the mRNA expression of NEP and IDE were very significant up-regulated （P<0.01）， and the mRNA expression of ACE， MMP-9 and PL were significant up-regulated （P<0.05） in the hippocampus of Tg-APP/PS1 mice. 2） After 16 weeks voluntary wheel running， the protein expression of IDE was very significant up-regulated （P<0.01）， and the protein expression of NEP， ACE， MMP-9 were significant up-regulated （P<0.05） in the hippocampus of Tg-APP/PS1 mice. 3） After 16 weeks voluntary wheel running， the Aβ deposition in the hippocampus of Tg-APP/PS1 mice was very significant down-regulated （P<0.01）. Conclusion： Voluntary wheel running decreased the deposition of Aβ by promoting the expression of Aβ degradation enzyme in the hippocampus of Tg-APP/PS1 mice.

Key words：voluntary wheel running; Alzheimers disease; Tg-APP/PS1 mice; Aβ deposition; Aβ degradation enzyme

認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶是腦的重要高級(jí)功能，決定著人類認(rèn)識(shí)自然和改造社會(huì)的深刻程度。腦的認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力的增齡性減弱，是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的重要?dú)w因。阿爾茨海默?。ˋlzheimers disease， AD）是一種腦的認(rèn)知下降和學(xué)習(xí)記憶損害相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，被稱為世界第一大神經(jīng)退行性疾病。AD主要的病理標(biāo)志是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白（β-amyloid， Aβ）沉積產(chǎn)生老年斑（senile plaque， SP），tau蛋白過度磷酸化形成神經(jīng)纖維纏結(jié)及由Aβ沉積和tau蛋白過度磷酸化所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞的缺失等[1]。其中，Aβ沉積是AD發(fā)病的主要病因之一。Aβ具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，能誘導(dǎo)腦組織的免疫炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞的異常凋亡、氧化應(yīng)激損傷、誘導(dǎo)鈣離子穩(wěn)態(tài)以及導(dǎo)致線粒體的能量供應(yīng)系統(tǒng)功能紊亂，致使神經(jīng)細(xì)胞異常死亡和神經(jīng)系統(tǒng)的退行性病變[2]。

正常腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生和降解呈動(dòng)態(tài)平衡，故不會(huì)沉積。AD腦內(nèi)Aβ的產(chǎn)生和清除之間的平衡被打亂，Aβ不能被及時(shí)清除，而在神經(jīng)細(xì)胞外聚積，導(dǎo)致其沉積，進(jìn)而引發(fā)一系列神經(jīng)毒性和病理學(xué)改變，阻礙神經(jīng)細(xì)胞正常生理功能的發(fā)揮。正常情況下腦內(nèi)生成的Aβ主要是通過三種方式清除（如圖1）：即經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Aβ降解酶的降解清除、血腦屏障中Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)出腦清除和小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)其進(jìn)行吞噬降解清除[2]，三種清除方式中Aβ降解酶占主導(dǎo)作用。研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)的Aβ降解酶包括腦啡肽酶（neprilysin， NEP）、胰島素降解酶（insulin degrading enzyme， IDE）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-converting enzyme， ACE）、內(nèi)皮素轉(zhuǎn)化酶（endothelin-converting enzyme， ECE）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9， MMP-9）和纖溶酶（Plasmin， PL）等主要幾種。

隨著對(duì)AD風(fēng)險(xiǎn)防控意識(shí)的增強(qiáng)及其病癥臨床實(shí)踐和實(shí)驗(yàn)研究的逐步深入，人們對(duì)AD病理干預(yù)手段的認(rèn)識(shí)也在改變，開始由對(duì)病癥治療向積極預(yù)防轉(zhuǎn)變。體育科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)常參與體育運(yùn)動(dòng)或體力活動(dòng)可提高老年人的認(rèn)知功能[4-6]，降低AD的患病風(fēng)險(xiǎn)[7-9]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)干預(yù)可預(yù)防和改善AD病理，其機(jī)制涉及運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)Aβ沉積的減少[4， 10-16]，抑制tau蛋白的過度磷酸化[17-19]，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化[18， 20-21]、緩解神經(jīng)細(xì)胞死亡[22-24]和神經(jīng)炎癥[13， 25]等生物學(xué)機(jī)制。其中，運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)Aβ沉積的研究居多，運(yùn)動(dòng)可通過調(diào)節(jié)Aβ生成相關(guān)分泌酶的表達(dá)或活性來抑制Aβ的生成[10， 14， 26-27]，通過抑制APP的表達(dá)水平來抑制Aβ的產(chǎn)生[12， 28-29]等。但目前并未發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)作為獨(dú)立影響因素的研究證明其可通過調(diào)節(jié)Aβ降解酶進(jìn)而降低Aβ沉積，僅有的Maesako等[30]結(jié)合飲食控制和運(yùn)動(dòng)干預(yù)的研究及Lazarov等[31]通過內(nèi)設(shè)跑輪運(yùn)動(dòng)裝置豐富環(huán)境干預(yù)的研究表明：運(yùn)動(dòng)結(jié)合其他干預(yù)方式可促進(jìn)NEP與IDE的表達(dá)減少腦內(nèi)Aβ沉積。關(guān)于運(yùn)動(dòng)干預(yù)通過介導(dǎo)ACE、ECE、MMP-9和PL等幾種降解酶而調(diào)節(jié)Aβ沉積，預(yù)防和緩解AD的研究，以及運(yùn)動(dòng)干預(yù)作為獨(dú)立因素調(diào)控Aβ降解酶介導(dǎo)AD病理的研究均未見報(bào)道，相關(guān)機(jī)制更缺乏深入研究。本研究擬探討16周自主運(yùn)動(dòng)能否通過上調(diào)Aβ降解酶的表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積，解釋自主運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)腦Aβ沉積的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與材料

從南京生物醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模式研究所選購(gòu)3月齡C57系A(chǔ)PP/PS1轉(zhuǎn)基因雄性小鼠34只（體重19.56±1.48 g）與3月齡野生型C57系小鼠34只（體重20.24±1.02 g），單獨(dú)飼養(yǎng)。小鼠飼料、墊料購(gòu)自上海斯萊康公司，自由飲水和飲食，墊料定期更換。飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象分組與干預(yù)方案

將APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)組（TE）和對(duì)照組（TC），將野生C57小鼠亦隨機(jī)分為運(yùn)動(dòng)組（E）和對(duì)照組（C）。其中，TE組和E組小鼠除給予正常飲食和飲水之外，為其提供自主跑輪裝置，使其進(jìn)行16周的自主運(yùn)動(dòng)（如圖2、圖3）。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量實(shí)驗(yàn)（RT-PCR）

運(yùn)動(dòng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束24小時(shí)后，每組隨機(jī)選取12只實(shí)驗(yàn)小鼠麻醉、斷頸處死，取海馬組織迅速置于液氮保存，后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱冷凍待測(cè)。

所有實(shí)驗(yàn)小鼠海馬組織取完后，每組取6只小鼠海馬組織于冰上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，按照Invitrogen Trizol法提取總RNA，采用Toyobo Fsq101反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)相關(guān)基因相對(duì)含量[14]。各目的基因和內(nèi)參基因的引物序列如下表（引物設(shè)計(jì)與合成均由上海生工生物公司完成）。

1.4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）

每組取剩余的6只小鼠海馬組織于冰上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，剪碎放入研磨管中，按照Beyotime P0013 Western及RAP裂解液說明書進(jìn)行操作。采用8%分離膠電泳，通過Millipore ECL超敏試劑盒顯影和Alpha FC2型凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行冷光掃膜。所有抗體購(gòu)于CST公司，采用Flour Chem FC2軟件分析圖像灰度值，冷光掃膜。實(shí)驗(yàn)所用抗體購(gòu)于CST和Abcam公司，使用Flour Chem FC2軟件對(duì)所捕捉圖像進(jìn)行灰度值分析，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行。

1.5 免疫組化實(shí)驗(yàn)（Immunohistochemistry）

運(yùn)動(dòng)干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束24小時(shí)后，每組余下5只小鼠按0.1ml/20 g體重的劑量經(jīng)腹腔注射1.5%的戊巴比妥納麻醉，剪開腹腔至胸腔，暴露出心臟，從心臟左心室尖處灌注0.9%的生理鹽水（4℃）沖洗血液，至大鼠肝臟發(fā)白、流出液基本無血后，換成4%的多聚甲醛溶液（4℃）繼續(xù)灌注，至頭、四肢均已僵硬后迅速斷頭取腦，于-80℃冰箱保存。采用OCT包埋劑進(jìn)行冰凍包埋，于冰凍切片機(jī)切片，厚度為20 μm。先后通過小鼠Aβ抗兔單克隆抗體（I抗，1∶200）和兔抗小鼠IgG抗體（II抗，1∶400）孵育切片。每只小鼠取6張切片，各隨機(jī)取相應(yīng)海馬區(qū)的2個(gè)視野進(jìn)行分析。采用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液染色，于顯微鏡下觀察。Aβ沉積陽性免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色或棕褐色，集中分布于胞漿及核膜周圍，呈斑塊狀，計(jì)算其在所選視野中的面積百分比，百分比值高，Aβ蛋白表達(dá)多，反之則少。實(shí)驗(yàn)所用抗體購(gòu)自CST和Abcam公司，具體實(shí)驗(yàn)步驟參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

采用SPSS 18.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件、Image J圖像處理軟件、GraphPad繪圖分析軟件以及Excel 2010辦公軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，組間比較采用采用單因素分析法（One-Way ANOVA），事后檢驗(yàn)采用LSD 法。記P<0.05為具有顯著性差異，記P<0.01 為具有極顯著性差異。

2 結(jié)果分析

2.1 各組小鼠海馬Aβ降解酶 mRNA表達(dá)的比較

與C組相比，TC組小鼠海馬NEP、IDE和ECE mRNA表達(dá)均極顯著性降低（P<0.01），ACE、MMP-9和PL mRNA表達(dá)均顯著性降低（P<0.05）。與TC組相比，TE組小鼠海馬NEP和IDE mRNA表達(dá)均極顯著性上調(diào)（P<0.01），ACE、MMP-9和PL mRNA表達(dá)均顯著性上調(diào)（P<0.05），ECE mRNA表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，但兩組間無顯著性差異。與E組相比，TE組小鼠海馬NEP、IDE、ACE和PL mRNA表達(dá)均顯著性降低（P<0.05），ECE mRNA表達(dá)極顯著性降低（P<0.01），TE組小鼠海馬MMP-9 mRNA表達(dá)呈下調(diào)趨勢(shì)，但兩組之間不具有顯著性差異。與C組相比，E組小鼠海馬NEP mRNA表達(dá)極顯著性上調(diào)（P<0.01），ECE mRNA表達(dá)顯著性上調(diào)（P<0.05），而IDE、ACE 、MMP-9和PL mRNA表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)，但兩組間不具有顯著性差異（如表2、圖4）。

2.2各組小鼠海馬Aβ降解酶蛋白表達(dá)的比較

與C組相比，TC組小鼠海馬NEP、IDE和ACE蛋白表達(dá)顯著性降低（P<0.05），MMP-9蛋白表達(dá)極顯著性降低（P<0.01）。與TC組相比，TE組小鼠海馬NEP、ACE和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著性上調(diào)（P<0.05），IDE蛋白表達(dá)極顯著性上調(diào)（P<0.01）。與E組相比，TE組小鼠海馬NEP和ACE蛋白表達(dá)均呈下降趨勢(shì)，但兩組間無顯著性差異，TE組小鼠海馬IDE和MMP-9蛋白表達(dá)均顯著性降低（P<0.05）。與C組相比，E組小鼠海馬NEP、ACE和 MMP-9蛋白表達(dá)均有上調(diào)趨勢(shì)，但兩組間無顯著性差異，而E組小鼠海馬IDE蛋白表達(dá)顯著性上調(diào)（P<0.05）（如表3、圖5）。

2.3 各組小鼠海馬Aβ沉積的比較

與C組相比，TC組小鼠海馬Aβ沉積的面積百分比極顯著性上調(diào)（P<0.01）;與TC組相比，TE組小鼠海馬Aβ沉積的面積百分比極顯著性降低（P<0.01）;與E組相比，TE組小鼠海馬Aβ沉積的面積百分比顯著性上調(diào)（P<0.05）;與C組相比，E組小鼠海馬Aβ沉積的數(shù)量顯著性降低 （P<0.05）（如表4、圖6）。

3 討論

本研究所選用的APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠是通過表達(dá)人類突變型基因PS1（DeltaE9）和小鼠與人類APP（APPSwe）基因嵌合體的雙轉(zhuǎn)基因小鼠，自南京大學(xué)——南京生物醫(yī)藥研究院的模式動(dòng)物研究所引進(jìn)，該小鼠相關(guān)的基因型為Tg（APPswe，PSEN1dE9）85Dbo，其種源來自美國(guó)的Jackson實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。研究發(fā)現(xiàn)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在4月齡時(shí)腦內(nèi)便可發(fā)現(xiàn)老年斑的出現(xiàn)，在6月齡時(shí)則可在大腦皮層及海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)Aβ的沉積，Aβ沉積與AD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的年齡密切相關(guān)[32]。與同品系野生型小鼠相比，在10～12月齡時(shí)可出現(xiàn)行為學(xué)的空間記憶能力缺陷[33]，因此，APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型是研究腦的功能紊亂性疾病，特別是AD相關(guān)疾病最為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。在AD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生長(zhǎng)的適當(dāng)年齡進(jìn)行干預(yù)是控制Aβ沉積的重要靶點(diǎn)。研究[34]發(fā)現(xiàn)，Tg-APP/PS1小鼠在6-7月齡腦內(nèi)開始出現(xiàn)Aβ沉積。Liu等[12]從3月齡開始對(duì)Tg-APP/PS1小鼠的進(jìn)行跑臺(tái)干預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)5個(gè)月的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)抑制了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ沉積和tau蛋白過磷酸化，表明從3月齡起對(duì)Tg-APP/PS1小鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)干預(yù)可以達(dá)到調(diào)控AD病理的作用。本研究從3月齡對(duì)Tg-APP/PS1小鼠施加運(yùn)動(dòng)干預(yù)，7月齡提取腦組織，符合運(yùn)動(dòng)干預(yù)Aβ沉積的生理?xiàng)l件。

3.1 自主運(yùn)動(dòng)對(duì)Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ降解酶的影響

3.1.1 自主運(yùn)動(dòng)對(duì)Tg-APP/PS1小鼠海馬NEP和IDE表達(dá)的調(diào)控

NEP和IDE是研究最多也是最重要的兩種Aβ降解酶，受到大量關(guān)注。研究[35-36]發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)NEP水平和Aβ表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞外淀粉樣斑塊沉積的程度之間關(guān)系密切。對(duì)NEP基因敲除小鼠和其他Aβ降解酶基因敲除小鼠比較發(fā)現(xiàn)，NEP基因敲除小鼠腦內(nèi)Aβ40和Aβ42的水平均顯著增加[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)，Tg-APP/PS1小鼠海馬NEP mRNA表達(dá)低于野生小鼠，但兩者之間差異不顯著，Tg-APP/PS1小鼠海馬NEP蛋白表達(dá)則顯著低于野生小鼠，說明Tg-APP/PS1小鼠NEP基因轉(zhuǎn)錄水平與正常小鼠無差異，但其蛋白表達(dá)低于野生小鼠。16周自主運(yùn)動(dòng)上調(diào)了Tg-APP/PS1小鼠海馬NEP mRNA和蛋白水平，說明自主運(yùn)動(dòng)可有效促進(jìn)Tg-APP/PS1小鼠海馬NEP的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)。研究[39]發(fā)現(xiàn)，AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)IDE mRNA和蛋白表達(dá)受Aβ40和Aβ42表達(dá)的調(diào)控，二者呈正相關(guān)性變化。而Tg2576小鼠腦內(nèi)IDE的表達(dá)在Aβ斑塊周圍顯著升高，且腦內(nèi)IDE的蛋白表達(dá)隨小鼠年齡的增大呈上升的趨勢(shì)[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，Tg-APP/PS1小鼠海馬IDE mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于野生小鼠，說明Tg-APP/PS1小鼠在IDE的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上均存在缺陷性;而16周自主運(yùn)動(dòng)后，Tg-APP/PS1小鼠海馬IDE mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加，說明自主運(yùn)動(dòng)可有效抵抗Tg-APP/PS1小鼠海馬IDE表達(dá)的下降;運(yùn)動(dòng)對(duì)野生小鼠海馬IDE mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)作用不顯著，但運(yùn)動(dòng)上調(diào)了野生小鼠海馬IDE蛋白表達(dá)，說明自主運(yùn)動(dòng)可上調(diào)野生小鼠海馬IDE的蛋白翻譯，促進(jìn)腦內(nèi)合成較多的IDE，有助于腦內(nèi)Aβ產(chǎn)生和清除動(dòng)態(tài)平衡的維持。

先前對(duì)運(yùn)動(dòng)干預(yù)AD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)NEP和IDE影響的研究并不多見，僅有兩篇研究報(bào)道了自主運(yùn)動(dòng)或內(nèi)設(shè)自主跑輪裝置的豐富環(huán)境干預(yù)對(duì)這兩種Aβ降解酶的調(diào)節(jié)作用，所得結(jié)論尚不具代表性，此亦本實(shí)驗(yàn)選擇研究運(yùn)動(dòng)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ降解酶進(jìn)行干預(yù)的主要原因。如Maesako等[30]給予APP轉(zhuǎn)基因小鼠高脂飲食，同時(shí)采用20周的自主運(yùn)動(dòng)干預(yù)，發(fā)現(xiàn)自主運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了該小鼠腦內(nèi)的NEP的活性增加進(jìn)而抑制了Aβ沉積。Lazarov等[31]發(fā)現(xiàn)，5個(gè)月自主運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了Tg-APP/PS1小鼠海馬NEP和IDE的蛋白表達(dá)，抑制了Aβ沉積。Adlard等[10]發(fā)現(xiàn)1個(gè)月的自主運(yùn)動(dòng)降低了TgCRND8小鼠APP 蛋白片段（α-CTF和β-CTF），但未改變海馬和皮質(zhì)內(nèi)的Aβ40和Aβ42表達(dá)，NEP與IDE的mRNA和蛋白表達(dá)亦未見顯著變化，其原因可能與1個(gè)月的運(yùn)動(dòng)時(shí)間較短有關(guān)，這也是本研究采用16周中長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)干預(yù)的直接原因，較長(zhǎng)時(shí)程的運(yùn)動(dòng)可能起到重復(fù)刺激的效果，能夠強(qiáng)化腦對(duì)運(yùn)動(dòng)干預(yù)的適應(yīng)性變化。

3.1.2 自主運(yùn)動(dòng)對(duì)Tg-APP/PS1小鼠海馬ACE和MMP-9表達(dá)的調(diào)控

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tg-APP/PS1小鼠海馬ACE mRNA和蛋白表達(dá)均顯著低于野生對(duì)照組小鼠;Tg-APP/PS1小鼠海馬MMP-9 mRNA表達(dá)較野生小鼠下調(diào)，但不具有顯著性差異，Tg-APP/PS1小鼠海馬MMP-9蛋白表達(dá)顯著低于野生小鼠;16周自主運(yùn)動(dòng)顯著上調(diào)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ACE和MMP-9的 mRNA和蛋白表達(dá)。提示，Tg-APP/PS1小鼠海馬內(nèi)ACE和MMP-9的表達(dá)被抑制，而16周自主運(yùn)動(dòng)可促進(jìn)ACE 和MMP-9的表達(dá)。ACE和MMP-9也是重要的Aβ降解酶，可協(xié)同NEP和IDE對(duì)Aβ的降解，促進(jìn)對(duì)Aβ的清除。ACE水平和Aβ沉積誘導(dǎo)AD發(fā)病之間顯著相關(guān)，研究[41]發(fā)現(xiàn)，ACE可通過降解Aβ多肽內(nèi)天冬氨酸第7位點(diǎn)到絲氨酸第8位點(diǎn)的Aβ蛋白。腦內(nèi)ACE的增多可促進(jìn)對(duì)Aβ的降解，而ACE抑制劑可阻斷其對(duì)體外培養(yǎng)的Aβ降解[42]。MMP-9可在離體或在體條件下降解Aβ沉積[43]。外源性MMP-9可直接作用于α-分泌酶的APP降解位點(diǎn)，降低體外的Aβ多肽，而且外源性MMP-9可在離體或在體條件下降解聚積的Aβ纖維[44]。過表達(dá)MMP-9基因的轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮質(zhì)內(nèi)APP的降解產(chǎn)物sAPPα水平顯著升高，突觸分枝的密度顯著增加[45]，表明MMP-9的表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)對(duì)Aβ的降解清除。

3.1.3 自主運(yùn)動(dòng)對(duì)Tg-APP/PS1小鼠海馬ECE和PL表達(dá)的調(diào)控

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生小鼠相比，Tg-APP/PS1小鼠海馬ECE mRNA表達(dá)顯著降低，而16周自主運(yùn)動(dòng)未能上調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬ECE mRNA表達(dá)，但運(yùn)動(dòng)干預(yù)上調(diào)了野生小鼠海馬ECE mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠海馬PL mRNA表達(dá)與野生小鼠相比亦顯著下調(diào)，16周自主運(yùn)動(dòng)上調(diào)了轉(zhuǎn)基因小鼠海馬PL mRNA表達(dá)，但對(duì)野生小鼠海馬PL mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)并不顯著。本實(shí)驗(yàn)表明，Tg-APP/PS1小鼠海馬內(nèi)ECE和PL基因表達(dá)均受到轉(zhuǎn)基因造模的影響而被抑制，16周自主運(yùn)動(dòng)未能有效上調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬內(nèi)ECE基因表達(dá)，但上調(diào)了PL基因表達(dá)。ECE和PL也參與了腦內(nèi)Aβ的降解過程，對(duì)調(diào)節(jié)腦內(nèi)Aβ水平具有積極作用。體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組的ECE可在3個(gè)位點(diǎn)降解合成的Aβ40，產(chǎn)生Aβ1-16、Aβ1-17、Aβ1-19以及Aβ20-40等Aβ片段[46]。ECE基因缺陷小鼠腦內(nèi)Aβ40和Aβ42 表達(dá)均顯著上調(diào)[47]。PL在AD發(fā)病過程中其含量及其活性亦處于較低水平，在離體條件下抑制PL可增強(qiáng)Aβ聚積所導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞損傷[48]，而腦內(nèi)PL增多可促進(jìn)Aβ的降解[49]。

目前運(yùn)動(dòng)科學(xué)領(lǐng)域尚未發(fā)現(xiàn)通過運(yùn)動(dòng)干預(yù)介導(dǎo)AD實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)ACE、MMP9、ECE和PL等的文獻(xiàn)可供參考，因此，本研究探討自主運(yùn)動(dòng)對(duì)Tg-APP/PS1小鼠海馬中ACE、MMP9、ECE和PL等Aβ降解酶的影響，是一種探索性研究，有望為今后該領(lǐng)域的研究提供參考。

3.2 自主運(yùn)動(dòng)對(duì)Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積的影響

免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與野生小鼠相比，Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積較為密集，所占面積百分比顯著大于野生小鼠。與其對(duì)照組比較，Tg-APP/PS1運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬Aβ沉積顯著減少，提示16周主運(yùn)動(dòng)能夠有效抑制Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ的沉積。與野生運(yùn)動(dòng)組小鼠相比，Tg-APP/PS1運(yùn)動(dòng)組小鼠海馬Aβ沉積和Aβ沉積數(shù)量上均顯著性增多，表明16周自主運(yùn)動(dòng)雖然能夠顯著抑制Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積，但由于轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)APP與PS1基因[26]的過表達(dá)導(dǎo)致海馬Aβ沉積顯著增多，可能在一定程度上抵消了運(yùn)動(dòng)干預(yù)的獲益，導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)組轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ沉積僅下調(diào)到野生對(duì)照組小鼠的水平。大量研究表明，Aβ沉積可誘導(dǎo)腦神經(jīng)元的退行性病理改變，損害腦的認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力。Adlard等[10]發(fā)現(xiàn)，5個(gè)月自主運(yùn)動(dòng)降低了TgCRND8小鼠海馬的Aβ沉積。Cracchiolo等[50]發(fā)現(xiàn)，7個(gè)半月自主運(yùn)動(dòng)和相同時(shí)間內(nèi)設(shè)跑輪的豐富環(huán)境干預(yù)降低了Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積。Yuede等[51]發(fā)現(xiàn)，自主運(yùn)動(dòng)和跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)均促進(jìn)了Tg2576轉(zhuǎn)基因小鼠海馬Aβ沉積。Liu等[12]發(fā)現(xiàn)，5個(gè)月跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)降低了Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ沉積和Aβ40與Aβ42的蛋白表達(dá)。Llort等[20]發(fā)現(xiàn)5周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)降低了3xTg-AD小鼠海馬Aβ42/Aβ40的比值，但運(yùn)動(dòng)干預(yù)后該小鼠海馬區(qū)的Aβ斑塊沉積與對(duì)照組小鼠相比無顯著變化。Ke等[11]發(fā)現(xiàn)，4周短期跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)下調(diào)了Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ的表達(dá)，但免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)對(duì)海馬Aβ沉積的調(diào)節(jié)作用不顯著。綜上研究表明，運(yùn)動(dòng)干預(yù)可降低實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)的Aβ沉積，且長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)干預(yù)效果更佳。16周自主運(yùn)動(dòng)下調(diào)了Tg-APP/PS1小鼠海馬Aβ的沉積與上文所述運(yùn)動(dòng)促進(jìn)了Aβ降解酶的表達(dá)具有直接聯(lián)系，說明自主運(yùn)動(dòng)可通過上調(diào)Aβ降解酶的表達(dá)，促進(jìn)其對(duì)Aβ的降解，進(jìn)而下調(diào)轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的Aβ沉積。

4 結(jié)論

本研究表明Tg-APP/PS1小鼠海馬內(nèi)主要的Aβ降解酶的mRNA和蛋白表達(dá)較同月齡野生型小鼠顯著性降低，其海馬Aβ沉積顯著性增加;而16周的自主運(yùn)動(dòng)顯著性上調(diào)了Tg-APP/PS1小鼠海馬內(nèi)Aβ降解酶的mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)了海馬Aβ沉積。提示：自主運(yùn)動(dòng)可能通過促進(jìn)腦內(nèi)Aβ降解酶的表達(dá)，進(jìn)而抑制Aβ沉積，改善AD病理。

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