木香烴內酯對人乳腺癌SK-BR-3細胞增殖、遷移和凋亡的影響及機制研究

馬強　熊書　苗加偉　陳潔　周海英　羅嬌　楊貞妮　孫厚良　鄧雪松

中圖分類號 R737.9;R965.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）11-1342-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.10

摘 要 目的：研究木香烴內酯對乳腺癌SK-BR-3細胞增殖、遷移和凋亡的影響及機制。方法：取對數生長期的SK-BR-3細胞，分別加入不同濃度（10、20、30、40、50 μmol/L）的木香烴內酯作用24、48、72 h，采用CCK-8法檢測細胞的增殖抑制率。將細胞分為空白對照組和木香烴內酯10、20、30 μmol/L濃度組，采用Hoechst 33258熒光染色法觀察細胞形態(tài)及凋亡情況，并計算細胞凋亡率;采用細胞劃痕試驗檢測細胞的遷移能力，并計算遷移率;采用Western blotting法檢測細胞中B淋巴細胞瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和分裂型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）蛋白的相對表達水平。結果：木香烴內酯對SK-BR-3細胞具有顯著的增殖抑制作用（P<0.05或P<0.01），且呈現濃度和時間依賴趨勢?？瞻讓φ战M細胞輪廓清晰、形態(tài)規(guī)則、貼壁較好;與空白對照組比較，木香烴內酯10、20、30 μmol/L濃度組細胞數量明顯減少，細胞結構松散、體積縮小、間隙變大，且多數細胞輪廓消失、變圓，貼壁不良;細胞遷移率和Bcl-2蛋白的相對表達水平均顯著降低，細胞凋亡率和Bax、Caspase-3及Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達水平均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結論：木香烴內酯能抑制人乳腺癌SK-BR-3細胞增殖和遷移，誘導其凋亡，其作用機制可能與上調Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3表達，下調Bcl-2表達有關。

關鍵詞 木香烴內酯;人乳腺癌SK-BR-3細胞;增殖;遷移;凋亡;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of costunolide on the proliferation， migration and apoptosis of breast cancer SK-BR-3 cells and its mechanism. METHODS： SK-BR-3 cells in logarithmic growth period were collected and cultured with different concentrations （10， 20， 30， 40， 50 μmol/L） of costunolide for 24， 48， 72 h. Inhibitory rate of costunolide on cell proliferation was detected with CCK-8. The cells were divided into blank control group and costunolide group （10， 20， 30 μmol/L）. Hoechst 33258 fluorescence was used to observe the morphology and apoptosis of cells， and apoptotic rate of cells were calculated. Cell scratch test was used to detect the migration ability of cells and calculate the migration rate. Western blotting was used to detect the relative expression level of Bcl-2， Bax， Caspase-3 and Cleaved Caspase-3 in cells. RESULTS： The proliferation of SK-BR-3 cells were significantly inhibited by costunolide （P<0.05 or P<0.01）， and it shows a trend of concentration and time dependence. In the blank control group， cells possessed clear contour， regular shape and good adherence. Compared with blank control group， the number of cells were decreased significantly in 10， 20， 30 μmol/L costunolide groups， the cell structure was loose， the volume was reduced， and the gap became larger， and most of the cell contour disappeared and became round， the cell adherence was poor; cell migration rate and Bcl-2 protein relative expression level were decreased significantly， while apoptosis rate and the relative expression level of Bax， Caspase-3 and Cleaved Caspase-3 protein were significantly increased （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Costunolide can inhibit the proliferation and migration， and induce apoptosis of human breast cancer SK-BR-3 cells， mechanism of which? may be through up-regulating the expression of Bax， Caspase-3 and Cleaved Caspase-3 while down-regulating the expression of Bcl-2.

KEYWORDS? ?Costunolide; Human breast cancer SK-BR-3 cells; Proliferation; Migration; Apoptosis; Mechanism

乳腺癌是女性癌癥病死率最高的疾病，我國乳腺癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位列第1位[1-2]。引起乳腺癌的危險因素有很多，包括遺傳因素、激素水平異常、吸煙史和飲酒史[3]。乳腺癌的發(fā)病機制仍然是未知的，其治療一般采用化療、放療和生物免疫治療，但目前尚無明確的治療靶點[4]。此外，目前使用的治療方案也存在著許多副作用[3]。因此，近年來學者們致力于發(fā)現具有治療乳腺癌潛力的新靶點藥物。相關研究發(fā)現，從中藥中分離提取的天然產物可作為抗癌新藥的重要來源，目前已有大量植物化學成分被成功地用于治療各種癌癥和其他疾病[5-7]。

木香烴內酯是從傳統(tǒng)中藥木香中提取的一種倍半萜內酯，研究發(fā)現，其具有抗炎、抗真菌、抗癌等多種生物活性[8]。另有相關研究報道證實，木香烴內酯可通過融合基因介導的信號傳導和轉錄激活因子5（Bcr/Abl-Stat5）途徑促進伊馬替尼誘導的慢性髓性白血病細胞凋亡[9];其可通過調節(jié)核轉錄因子（NF-κB）信號通路誘導肝癌HepG2細胞的凋亡[10];此外，其也被證明可以抑制人肺鱗癌SK-MES-1細胞的細胞周期進程[11]。但目前木香烴內酯是否對乳腺癌細胞具有抗癌活性尚不清楚，基于此，筆者采用CCK-8法檢測木香烴內酯對人乳腺癌SK-BR-3細胞增殖的影響，采用細胞劃痕試驗檢測其對該細胞遷移能力的影響，采用Hoechst 33258熒光染色法觀察其對該細胞凋亡的影響，采用Western blotting法檢測其對該細胞中B淋巴細胞瘤因子2（Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）和分裂型Caspase-3（Cleaved Caspase-3）蛋白表達的影響，以期研究木香烴內酯對SK-BR-3細胞增殖、遷移、凋亡的影響及其作用機制，為治療乳腺癌的新藥開發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Allegra -64R型臺式高速冷凍離心機（美國Beckman公司）;ELx800型酶標儀（美國Bio-Tek公司）;MCO-15AC型細胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）;ChemiDoc Touch型化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）;DMi8A型熒光倒置顯微成像系統(tǒng)（德國Leica公司）;JA2003J型電子分析天平（寧波凱諾儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

木香烴內酯（成都曼思特生物科技有限公司，批號：A0302，純度：≥99%）;DMEM高糖培養(yǎng)基（批號：C11995500BT）、胰酶（批號：25200-056）、胎牛血清（批號：A3160802）、青霉素-鏈霉素溶液（批號：15140-122）均購自美國Gibco公司;CCK-8試劑盒（美國APExBIO公司，批號：K1018）;二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司，批號：D2650）;Hoechst 33258染色液（批號：C0021）、4%多聚甲醛（批號：P1110）均購自北京索萊寶科技有限公司;蛋白酶抑制劑（PMSF，批號：ST506）、磷酸酶抑制劑（批號：P1051）、RIPA細胞裂解液（批號：P0013K）、BCA蛋白定量試劑盒（批號：P0012）均購自上海碧云天生物技術有限公司;彩色預染蛋白Marker（批號：P9001）、ECL化學發(fā)光顯色液（批號：P10100）均購自蘇州新賽美生物科技有限公司;兔抗 Caspase-3一抗（批號：380189）、兔抗Cleaved Caspase-3一抗（批號：341052）、兔抗Bax一抗（批號：612259）、兔抗Bcl-2一抗（批號：310004）及兔抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗（批號：384404）均購自成都正能生物技術有限責任公司;辣根過氧化物酶（HRP ）標記山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（英國Abcam公司，批號：ab6789）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細胞

人乳腺癌 SK-BR-3細胞系（編號：20161202-04）購自上海中喬新舟生物技術有限公司，課題組前期對該細胞系抽提的DNA進行STR位點及性別基因Amelogenin檢查，結果顯示完全匹配，可進行后續(xù)研究。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

將凍存的SK-BR-3細胞接種于含12%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 μg/mL鏈霉素的 DMEM高糖培養(yǎng)基（即完全培養(yǎng)基）中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同），每2～3 d更換培養(yǎng)液 1 次，待細胞長滿培養(yǎng)瓶底部80%～90%時進行傳代，取對數生長期細胞進行相關試驗。

2.2 木香烴內酯對SK-BR-3細胞增殖的影響考察

取對數生長期的SK-BR-3細胞，加入完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，按 5×103個/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL。將細胞在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，分為空白對照組（含細胞但不含藥物）和木香烴內酯10、20、30、40、50 μmol/L濃度組（濃度設置參考相關文獻[12-14]）?？瞻讓φ战M加入完全培養(yǎng)基100 μL，木香烴內酯給藥組分別加入終濃度為 10、20、30、40、50 μmol/L的木香烴內酯培養(yǎng)液，每孔總體積為200 μL，每組設 5 個復孔。藥物分別作用24、48、72 h后，每孔加 10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育 4 h后，采用酶標儀于450 nm 波長下測定各孔吸光度（OD）值，計算細胞增殖抑制率[細胞增殖抑制率（%）=（空白對照組OD值-試驗組OD值）/空白對照組OD值×100%]。

2.3 木香烴內酯對SK-BR-3細胞凋亡的影響考察

取對數生長期的SK-BR-3細胞，以1×104個/孔的密度接種于12孔板中，每孔加入1 mL完全培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，將細胞分為空白對照組和木香烴內酯10、20、30 μmol/L濃度組[前期試驗發(fā)現木香烴內酯高濃度下（40～50 μmol/L）細胞大量死亡漂浮，貼壁細胞較少，故選擇10、20、30 μmol/L進行試驗]。空白對照組加入完全培養(yǎng)基1 mL，試驗組分別加入終濃度為10、20、30 μmol/L的木香烴內酯培養(yǎng)液，每組設5個復孔，然后培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)基，于4 ℃下用4%多聚甲醛溶液固定30 min;用PBS洗滌細胞2次，每次3～5 min;加入500 μL Hoechst 33258染色液，室溫避光染色10 min，吸除染色液，用PBS洗滌2次，每次3～5 min;然后置于倒置熒光顯微鏡下觀察，每孔隨機選擇5個視野拍照。鏡下可見，凋亡細胞的熒光強度比正常細胞要高，且細胞核會出現致密的濃染或呈碎塊狀致密濃染。利用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0計數凋亡細胞數和細胞總數，并計算細胞凋亡率[細胞凋亡率（%）=凋亡細胞數/細胞總數×100%]。

2.4 木香烴內酯對SK-BR-3細胞遷移的影響考察

取對數生長期的SK-BR-3細胞，以5×105個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2 mL完全培養(yǎng)基，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞完全鋪滿，然后用200 μL移液槍槍頭在單層細胞上作“一”字劃痕。隨后用PBS洗滌2次，對漂浮細胞和損傷細胞進行清洗和去除，之后將細胞分為空白對照組和木香烴內酯10、20、30 μmol/L濃度組?？瞻讓φ战M加入無血清培養(yǎng)液2 mL，木香烴內酯給藥組分別加入終濃度為 10、20、30 μmol/L的木香烴內酯培養(yǎng)液，每組設3個復孔。細胞在培養(yǎng)0、24、48 h后用倒置顯微鏡觀察其愈合情況并拍照。利用Image J V1.8.0軟件分析并計算細胞的遷移率[細胞遷移率（%）=（0 h劃痕面積-培養(yǎng)后劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%]。

2.5 木香烴內酯對SK-BR-3細胞中Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved Caspase-3蛋白表達的影響考察

采用Western blotting法進行檢測。取對數生長期的SK-BR-3細胞，以 1×107個/瓶的密度接種于細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，將細胞分為空白對照組和木香烴內酯10、20、30、40 μmol/L濃度組（增加40 μmol/L濃度組以反映凋亡相關蛋白表達水平的變化趨勢）?？瞻讓φ战M加入3 mL完全培養(yǎng)基，試驗組分別加入終濃度為 10、20、30、40 μmol/L的木香烴內酯培養(yǎng)液，每組設3個復瓶，分別培養(yǎng)48 h。收集各組細胞，加入預先配制的RIPA細胞裂解液（內含1%的PMSF及1%磷酸酶抑制劑）100 μL，于冰上裂解30 min后，于4 ℃下以13 500? ? r/min離心10 min，提取總蛋白，用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。取蛋白變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳，然后轉膜，以5%脫脂奶粉在4 ℃封閉12 h;TBST緩沖液清洗，然后加入兔抗Caspase-3、Bax、Bcl-2 、Cleaved Caspase-3、GAPDH一抗（1 ∶ 1 000），于4 ℃下孵育過夜;TBST 緩沖液清洗，加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗（1 ∶ 2 000），室溫孵育 3 h;TBST 緩沖液清洗，用 ECL顯色劑顯色，利用化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光并拍照。運用 Quantity One V4.6.6圖像分析軟件檢測條帶的灰度值，以GAPDH為內參，計算各目的蛋白相對表達水平。

2.6 統(tǒng)計學分析

采用 GraphPad Prism 6.0軟件對數據進行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 木香烴內酯對SK-BR-3細胞增殖的影響

與空白對照組比較，木香烴內酯作用24、48、72 h時，各藥物濃度組細胞的增殖抑制率均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且呈明顯的濃度和時間依賴趨勢。木香烴內酯在10、20、30 μmol/L濃度下作用48 h后，表現出較為明顯的細胞增殖抑制作用，故選擇10、20、30? ? ? ?μmol/L作用48 h進行后續(xù)試驗。各組細胞增殖抑制率測定結果見表1。

3.2 木香烴內酯對SK-BR-3細胞凋亡的影響

空白對照組細胞輪廓清晰、形態(tài)規(guī)則、細胞質飽滿、貼壁較好。與空白對照組比較，木香烴內酯10、20、30? ?μmol/L濃度組細胞數量明顯減少、結構松散、體積縮小、間隙變大，且多數細胞輪廓消失、皺縮變圓，貼壁不良;隨木香烴內酯濃度的增加，細胞凋亡率顯著升高（P<0.05或P<0.01）。各組細胞形態(tài)學顯微圖見圖1，細胞凋亡率測定結果見圖2。

3.3 木香烴內酯對SK-BR-3細胞遷移的影響

與空白對照組比較，木香烴內酯10、20、30 μmol/L濃度組細胞遷移率顯著降低（P<0.05或P<0.01），且呈現濃度和時間依賴趨勢。各組細胞遷移情況顯微圖見圖3，細胞遷移率測定結果見圖4。

3.4 木香烴內酯對SK-BR-3細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

與空白對照組比較，木香烴內酯10、20、30、40 μmol/L濃度組細胞中Caspase-3、Bax及Cleaved Caspase-3蛋白的相對表達水平均顯著升高，Bcl-2蛋白的相對表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中凋亡相關蛋白表達電泳圖見圖5，蛋白相對表達水平測定結果見圖6。

4 討論

木香烴內酯是一種含有α-亞甲基-γ-內酯環(huán)結構的倍半萜內酯，該結構能與含有巰基的酶及其功能性蛋白酶發(fā)生反應，進而干擾細胞的代謝過程，從而發(fā)揮多種藥理活性[15-16]。據報道，木香烴內酯在10～50 μmol/L濃度范圍內對多種腫瘤細胞的增殖有較強的抑制作用[12-14]。因此，在本研究中，選擇終濃度為10、20、30、40、50 μmol/L的木香烴內酯進行細胞增殖試驗，考察其對人乳腺癌SK-BR-3細胞的增殖抑制作用。結果顯示，木香烴內酯對SK-BR-3細胞具有明顯的增殖抑制作用，且呈濃度和時間依賴趨勢。此外，利用細胞劃痕試驗分析木香烴內酯對SK-BR-3細胞遷移能力的影響，結果顯示，木香烴內酯能有效抑制細胞遷移，并亦呈濃度和時間依賴趨勢。

致癌作用在人體內的過程比較復雜，目前認為可能是通過癌基因和轉錄活性的改變影響細胞增殖和細胞凋亡[17]。在許多腫瘤疾病中，細胞增殖和細胞凋亡之間的平衡變化發(fā)揮著重要的作用[18]。細胞死亡包括自噬、凋亡和壞死3種類型[19]。其中，細胞凋亡在生物體的進化、內環(huán)境的穩(wěn)定以及多個系統(tǒng)的發(fā)育中起著至關重要的作用，尤其在癌癥的發(fā)展上[20-21]。因此，誘導細胞凋亡也成為了許多抗癌治療的共同目標[22]。據研究報道，木香烴內酯可誘導多種腫瘤細胞凋亡[23]。本研究采用Hoechst 33258染色法觀察細胞凋亡并計算凋亡率，結果顯示，不同濃度木香烴內酯作用后，細胞均出現明顯的核固縮及碎裂等凋亡現象，且隨著木香烴內酯濃度的增加，細胞的凋亡率顯著升高，提示木香烴內酯可誘導SK-BR-3細胞凋亡。

目前，臨床上大多數常用抗癌藥物的主要抗癌機制為激活凋亡途徑以殺死癌細胞[24]。研究表明，細胞凋亡是通過哺乳動物細胞的內源或外源性凋亡途徑發(fā)生的[25]，其中，線粒體途徑在內源性凋亡過程中起著重要作用，被認為與癌細胞凋亡有關[26]。其中，線粒體凋亡途徑受Bcl-2家族蛋白控制，該家族蛋白包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，兩者分別具有抑制或促進細胞凋亡的作用[27];此外，這些蛋白也是線粒體凋亡途徑的關鍵調節(jié)因子，通過調節(jié)線粒體膜通透性以控制線粒體凋亡[28]。Caspase家族蛋白在誘導細胞凋亡中也起著關鍵作用，并參與細胞凋亡的最終途徑，其中Caspase-3是細胞凋亡的關鍵蛋白酶，當其被激活時，可促進Caspase-3的剪切，進而觸發(fā)下游細胞凋亡的級聯(lián)反應，誘發(fā)細胞凋亡[29]。因此，本研究檢測了木香烴內酯對SK-BR-3細胞凋亡途徑關鍵調控因子Bax、Bcl-2、Caspase-3及Cleaved Caspase-3表達的影響，結果顯示，木香烴內酯可上調Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表達，下調Bcl-2的表達。

綜上所述，木香烴內酯能抑制SK-BR-3細胞的增殖和遷移，誘導其凋亡，且這種作用隨著木香烴內酯濃度的增加而增強;其機制與上調Bax、Caspase-3和Cleaved Caspase-3的表達，下調Bcl-2的表達有關。在后續(xù)研究中，可對木香烴內酯的藥理作用及分子機制進行深入挖掘，以期為其臨床應用提供參考。

參考文獻

[ 1 ] GUO R，SI J，XUE JY，et al. Changing patterns and survival improvements of young breast cancer in China and SEER database，1999-2017[J]. Chin J Cancer Res，2019，31（4）：653-662.

[ 2 ] JEMAL A，BRAY F，CENTER MM，et al. Global cancerstatistics[J]. CA Cancer J Clin，2011，6（2）：169-190.

[ 3 ] ELUMALA P，GUNADHARIN DN，SENTHILKUMAR K，et al. Induction of apoptosis in human breast cancer cells by nimbolide through extrinsic and intrinsic pathway[J]. Toxicol Lett，2012，215（2）：131-142.

[ 4 ] TAN PQ，ZHONG YM，HU ZY，et al. Size distributions，PAHs and inorganic ions of exhaust particles from a heavy duty diesel engine using B20 biodiesel with different exhaust aftertreatments[J]. Energy，2017.DOI：10. 1016/j.energy.2017.09.122.

[ 5 ] PATEL DK，KUMAR R，LALOO D，et al. Natural medicines from plant source used for therapy of diabetes mellitus：an overview of its pharmacological aspects[J]. Asian Pac J Trop Med，2012，2（3）：239-250.

[ 6 ] WU T，GENG J，GUO W，et al. Asiatic acid inhibits lung cancer cell growth in vitro and in vivo by destroying mitochondria[J]. Acta Pharm Sin B，2017（1）：73-80.

[ 7 ] LUO W，LIU Y，ZHANG J，et al. Andrographolide inhibits the activation of NF-κB and MMP-9 activity in H3255 lung cancer cells[J]. Exp Ther Med，2013（6）：743-746.

[ 8 ] 石小燕，劉嶸.木香烴內酯誘導卵巢癌細胞凋亡機制研究[J].現代中西醫(yī)結合雜志，2018，27（8）：27-30.

[ 9 ] HONG C，HE XL，YANG CH. Costunolide promotes imatinib-induced apoptosis in chronic myeloid leukemia cells via the Bcr/Abl-Stat5 pathway[J]. Phytother Res，2018，32（9）：1764-1769.

[10] WANG Y，ZHANG X，ZHAO L，et al. Costunolide protects lipopolysaccharide/d-galactosamine-induced acute liver injury in mice by inhibiting NF-κB signaling pathway[J]. J Surg Res，2017. DOI：10.1016/j.jss.2017.06.083.

[11] HUA P，ZHANG G，ZHANG Y，et al. Costunolide induces G1/S phase arrest and activates mitochondrial-mediated apoptotic pathways in SK-MES 1 human lung squamous carcinoma cells[J]. Oncol Lett，2016，11（4）：2780-2786.

[12] ZHANG C，LU T，WANG GD，et al. Costunolide，an active sesquiterpene lactone，induced apoptosis via ROS-mediated ER stress and JNK pathway in human U2OS cells[J]. Biomed Pharmacother，2016. DOI：10.1016/j.biopha. 2016.03.031.

[13] 王桂明，史棟棟，彭章曉，等.木香烴內酯誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡作用機制的研究[J].分析化學，2015，43（5）：61-67.

[14] WANG Z，ZHAO X，GONG XG. Costunolide induces lung adenocarcinoma cell line A549 cells apoptosis through ROS （reactive oxygen species）-mediated endoplasmic reticulum stress[J]. Cell Biol Int，2016，40（3）：289-297.

[15] SARASWATI S，ALHAIDER AA，ABDELGADIR AM. Costunolide suppresses an inflammatory angiogenic response in a subcutaneous murine sponge model[J]. APMIS，2018，126（3）：257-266.

[16] ALVES，JOSE CF. A review on the chemistry of eremanthine：a sesquiterpene lactone with relevant biological activity[J]. J Cheminform，2011，42（36）：1-35.

[17] RAMASAMY K，AGRWAL R. Multitargeted therapy of cancer by silymarin[J]. Cancer Lett，2008，269（2）：352- 362.

[18] 陳莉媚，金彤，寧春桃，等.加味四君子湯對H22肝癌小鼠的抑瘤作用和免疫功能的影響[J].南方醫(yī)科大學學報，2019，39（2）：121-128.

[19] DOLKA I，KROL M，SAPIERZYNSKI R. Evaluation of apoptosis-associated protein （Bcl-2，Bax，cleaved caspase-3 and p53） expression in canine mammary tumors：an immunohistochemical and prognostic study[J]. Res Vet Sci，2016.DOI：10.1016/j.rvsc.2016.02.004.

[20] ZHOU N，ZHANG Y，ZHANG X，et al. Exposure of tumor-associated macrophages to apoptotic MCF-7 cells promotes breast cancer growth and metastasis[J]. Int J Mol Sci，2015，16（12）：11966-11982.

[21] MEHDI TA，NECDET S，MUSTAFA T. Anti Wnt-1 monoclonal antibodys conjugated with gold nanoparticles，induced apoptosis on MCF-7 breast cancer cell lines[J]. J Nano Res，2019.DOI：10.4028/www.scientific.net/JNano R.58.1.

[22] FOUZ N，AMID A，HASHIM HY. Gene expression analysis in MCF-7 breast cancer cells treated with recombinant bromelain[J]. Appl Biochem Biotechnol，2014，173（7）：1618-1639.

[23] RASUL A，DI J，MILLIMOUNO FM，et al. Reactive oxygen species mediate isoalantolactone-induced apoptosis in human prostate cancer cells[J]. Molecules，2013.DOI：10. 3390/molecules18089382.

[24] LAU A，WANG Y，CHIU JF. Reactive oxygen species：current knowledge and applications in cancer research and therapeutic[J]. J Cell Biochem，2008，104（2）：657-667.

[25] HENGARTNER MO. The biochemistry of apoptosis[J]. Nature，2000，407（6805）：770-776.

[26] LANG LH，ZHU S，ZHANG H，et al. A natural phenylpropionate derivative from Mirabilis himalaica inhibits cell proliferation and induces apoptosis in HepG2 cells[J]. Bioorg Med Chem Lett，2014，24（23）：5484-5488.

[27] GROSS A. Bcl-2 family proteins as regulators of mitochondria metabolism[J]. Biochim Biophys Acta，2016.DOI：10.1016/j.bbabio.2016.01.017.

[28] CAMPBELL KJ，TAIT SWG. Targeting Bcl-2 regulated apoptosis in cancer[J]. Open Biol，2018.DOI：10.1098/rsob.180002.

[29] KO HM，JOO SH，JO JH，et al. Liver-wrapping，nitric oxide-releasing nanofiber downregulates cleaved caspase-3 and Bax expression on rat hepatic ischemia-reperfusion injury[J]. Transplant Proc，2017，49（5）：1170-1174.

（收稿日期：2020-03-14 修回日期：2020-04-05）

（編輯：唐曉蓮）