PAR-1受體拮抗劑及激活劑對apoE基因敲除小鼠血清CRP、IL-18和IL-10的影響

華光耀,張小勇,黃超龍,劉曉劍,邱敏,張國奇,李金花,李巧汶

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院，廣東 清遠(yuǎn) 511500)

以動脈粥樣硬化(atherosclemsis，AS) 為重要病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病在全球范圍內(nèi)有較高的發(fā)病率與死亡率，其導(dǎo)致的疾病是發(fā)達(dá)國家第一位的死亡原因，是威脅人類健康的主要疾病之一[1]。AS是以富含脂肪的斑塊在大動脈壁聚積為特征的系統(tǒng)疾病，其發(fā)生的病理生理過程極其復(fù)雜，尚未完全清楚，目前主要觀點包括炎性反應(yīng)學(xué)說、血栓形成學(xué)說、脂質(zhì)浸潤學(xué)說等。目前大部分學(xué)者越來越重視炎性反應(yīng)學(xué)說，認(rèn)為炎性反應(yīng)在AS的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后中均發(fā)揮重要作用。

蛋白酶激活受體-1(protease activated receptors, PAR-1)屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，與炎性反應(yīng)密切關(guān)系[2-4]。研究發(fā)現(xiàn)，PAR-1的表達(dá)與粥樣硬化斑塊、易損斑塊密切關(guān)系[5]。研究證實，PAR-1 拮抗劑作為新興的抗血小板藥物，在急性冠脈綜合癥的治療中有明確的療效[6-8]。但目前大部分關(guān)于 PAR-1 拮抗劑的研究集中在其抑制動脈內(nèi)血栓形成的作用，對其對機(jī)體炎性反應(yīng)的影響研究尚缺乏。本研究擬采用apoE-/-小鼠致AS模型，予PAR-1受體拮抗劑atopaxar及激活劑SFLLRN進(jìn)行干預(yù)，觀察小鼠炎性指標(biāo)(IL-18、IL-10、CRP)的變化，探討PAR-1受體對機(jī)體炎性的影響及意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選取清潔級6-8周齡雄性apoE-/-小鼠64只 (購自常州卡文斯實驗動物有限公司)，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點實驗室，給予高脂飼料(含膽固醇1.2%，脂肪18%)喂養(yǎng)。喂養(yǎng)12周后，完全隨機(jī)抽取4只apoE-/-小鼠，行血清血脂及主動脈病理學(xué)檢查，觀察apoE-/-AS模型建立是否成功。將余下成模后的60只apoE-/-小鼠隨機(jī)分成6組(n=6)：空白對照組(B組)、陰性對照組(N組)、低劑量atopaxar組(AI組)、高劑量atopaxar組(AII組)、低劑量SFLLRN組(SI組)及高劑量SFLLRN組(SII組)。每組小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由攝取飲用水及高脂飼料。

1.2 給藥方案

①空白對照組(B組)：高脂飲食；②陰性對照組(N組)：高脂飲食+淀粉片 20 mg/Kg qd；③低劑量atopaxar組(AI組)：高脂飲食+低劑量atopaxar 10 mg/Kg qd；④高劑量Atopaxar組(AII組)：高脂飲食+高劑量atopaxar 20 mg/Kg qd；⑤低劑量SFLLRN組(SI組)：高脂飲食+SFLLRN 10 mg/Kg qd；⑥高劑量SFLLRN組(SII組)：高脂飲食+SFLLRN 20 mg/Kg qd。每天上午給藥1次，灌胃給藥，持續(xù)8周。

1.3 標(biāo)本的收集及檢測

1.3.1收集 給藥實驗滿8周后，處死動物并取材，分別取血及主動脈等組織。采用戊巴比妥氣體麻醉小鼠，心臟穿刺取血，采血約0.8-1.0 mL，離心分離血清，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2采用ELISA法測定血清CRP、IL-18和IL-10水平(試劑盒購自上海BlueGene公司)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠血清CRP、IL-18和IL-10水平的變化

與B組相比，N組CRP、IL-18和IL-10均無明顯差異(均為P>0.05)；AI組CRP、IL-18和IL-10均顯著升高(P<0.05)；AII組CRP和IL-10均顯著升高(P<0.05)，IL-18無明顯差異(P>0.05)，相比于AI組，AII組CRP和IL-18顯著降低(P<0.05))，IL-10顯著升高(P<0.05)；SI組CRP、IL-18和IL-10均顯著升高(P<0.05)；SII組CRP、IL-18和IL-10均顯著升高(P<0.05)，相比于SI組，SII組CRP和IL-18顯著升高(均為P<0.001)，IL-10顯著降低(P<0.05)。與N組相比，AI組CRP和IL-10顯著升高(P<0.05)，IL-18有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；AII組CRP和IL-18無明顯差異(均為P>0.05)，IL-10顯著升高(P<0.05)；SI組和SII組CRP、IL-18和IL-10均顯著升高(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 各組小鼠血清CRP、IL-18和IL-10水平的比較

圖1 各組小鼠血清CRP、IL-18和IL-10水平的比較

2.2 各組小鼠血清IL-18/IL-10比值比較

與B組相比，N組、AI組和AII組IL-18/IL-10無明顯差異(均為P>0.05)，相比于AI組，AII組IL-18/IL-10有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；SI組、SII組IL-18/IL-10均顯著升高(P<0.05)，相比于SI組，SII組IL-18/IL-10顯著升高(P<0.05)。與N組相比，AI組IL-18/IL-10無明顯差異(P>0.05)；AII組IL-18/IL-10顯著降低(P<0.05)；SI組、SII組IL-18/IL-10均顯著升高(P<0.05)，見表1、圖1。

2.3 小鼠血清CRP與IL-18的相關(guān)性分析

小鼠血清CRP與IL-18呈正相關(guān)(r=0.941，P<0.05) ，見圖2。

圖2 小鼠血清CRP與IL-18相關(guān)性分析

3 討論

1992年經(jīng)基因敲除技術(shù)成功培育的apoE-/-小鼠，高脂飲食后可形成AS模型，該模型幾乎包含了AS所有階段的病變，是現(xiàn)今研究AS最好的模型之一[9]。本實驗中，6-8周齡apoE-/-小鼠經(jīng)12周高脂高膽固醇飼料飼養(yǎng)后，主動脈內(nèi)膜可見大量的AS斑塊及不同時期的AS病變，表明實驗動物AS模型復(fù)制成功。

現(xiàn)已有研究證實，在AS發(fā)生發(fā)展的過程中，炎性反應(yīng)貫穿其中，并扮演著重要的角色[10]。蛋白酶激活受體-1是參與凝血和炎性反應(yīng)兩大過程的關(guān)鍵一環(huán)，Schoergenhofer C等研究表明抑制PAR-1受體可顯著降低凝血及炎性反應(yīng)[11]。本實驗中，AII組小鼠血清CRP、IL-18較AI組顯著降低。IL-18已被證實作為一種促炎性因子參與AS病變?nèi)^程，血清IL-18升高可增加動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性[12]，經(jīng)證實CRP與IL-18水平呈正相關(guān)，可見atopaxar可通過降低血清IL-18而具有一定的抵抗AS斑塊不穩(wěn)定性的作用，并能下調(diào)炎性反應(yīng)發(fā)揮抗AS進(jìn)展的作用。試驗中AI組CRP、IL-18較對照組顯著升高，考慮為atopaxar劑量偏低，對PAR-1受體拮抗程度不足，隨著atopaxar劑量增大，CRP和IL-18呈下降趨勢，達(dá)到降低機(jī)體炎性反應(yīng)的效果。IL-10作為機(jī)體內(nèi)重要的抗炎性因子，可通過抑制多種促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、下調(diào)細(xì)胞黏附分子表達(dá)和抑制免疫反應(yīng)等，可發(fā)揮抗AS的作用[13-14]。本研究結(jié)果表明，AI、AII組IL-10較對照組顯著升高，且AII較AI組IL-10明顯升高。提示了atopaxar可通過對促炎性因子及抗炎性因子的調(diào)節(jié)，降低機(jī)體的炎性反應(yīng)，可能發(fā)揮抑制AS病變進(jìn)程的作用。

SI、SII組小鼠血清CRP、IL-18及IL-18/IL-10較對照組均顯著升高，研究證實[13]，IL-18/IL-10比值能較客觀地反應(yīng)機(jī)體炎性/抗炎性系統(tǒng)的動態(tài)平衡狀態(tài)，其比值增大表明炎性/抗炎性失衡以及炎性反應(yīng)的增強(qiáng)，二者平衡失調(diào)可能是促使AS病變進(jìn)展的重要原因，這表明SFLLRN可能通過升高血清炎性因子水平，加重機(jī)體促炎性因子/抗炎性因子平衡系統(tǒng)失調(diào)，發(fā)揮促進(jìn) AS病變進(jìn)程的作用。且PAR-1受體激活劑SFLLRN的給藥量越大，小鼠血清CRP、IL-18及IL-18/IL-10越高，IL-10越低，這表明PAR-1受體的激活程度增大，可加重炎性/抗炎性失衡，造成炎性反應(yīng)的增強(qiáng)，從而促使AS病變的進(jìn)展。另外，AII組IL-18/IL-10較AI組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與樣本量少、atopaxar組間增加劑量不夠及atopaxar實驗組設(shè)置少有關(guān)，這有待于后續(xù)加大樣本量、增加組間遞增劑量和增加atopaxar實驗組以進(jìn)一步論證。

綜上所述，拮抗PAR-1受體可降低機(jī)體炎性反應(yīng)，提示其可能抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，而激活PAR-1受體可上調(diào)炎性反應(yīng)，提示其可能抑制動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。 本研究表明，PAR-1受體在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可能是抗動脈粥樣硬化中的重要藥物靶點。