利用液液萃取降低莫西克汀雜質(zhì)含量的研究

何勇崴，岳光

(北大醫(yī)藥重慶大新藥業(yè)股份有限公司，重慶 400714)

莫西克汀(moxidectin)是一種新型的抗寄生蟲(chóng)藥(圖1)，是由鏈霉素進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，純化后再進(jìn)行半合成得到的一種，成分單一的大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)。CAS號(hào)為113507-06-5，分子量為639.83，其外觀為白色或類(lèi)白色無(wú)定形粉末，屬于第三代阿維菌素類(lèi)藥物[1]。

對(duì)牛輻射食道口線蟲(chóng)(Oesophagostomum radiatum)和Trichurrisdiscolor(未命名)線蟲(chóng)等第三階段幼蟲(chóng)的驅(qū)殺率達(dá)98%。在綿羊體內(nèi)，耐伊維菌素(Ivermectin，IVM)的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)對(duì)莫西克汀敏感[2]。莫西克汀對(duì)豬體內(nèi)的消化道線蟲(chóng)、肺線蟲(chóng)和體外寄生蟲(chóng)都有良好的驅(qū)殺效果[3]。

莫西克汀和其它大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)驅(qū)蟲(chóng)藥的不同之處在于，它是單一成分，有著更高的驅(qū)蟲(chóng)活性和長(zhǎng)效、安全等特性，且極低劑量下就有很強(qiáng)的抗線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物等體外寄生蟲(chóng)活性[4]，目前生產(chǎn)廠商有美國(guó)諾華公司和日本三共公司。

圖1 莫西克汀

目前生產(chǎn)上對(duì)于莫西克汀純化工藝，除了少數(shù)使用高壓制備柱分離外，主要還是采用樹(shù)脂或者硅膠為填料的常壓/低壓柱層析[5-6]。在進(jìn)行色譜分離的時(shí)候?qū)κ章?、純度影響最大的三個(gè)雜質(zhì)為A、E、F雜質(zhì)(圖2)。歐洲藥典9.0版對(duì)其成品中的含量要求為，HPLC檢測(cè)A雜質(zhì)含量≤1.5%，E+F雜質(zhì)含量≤1.7%[7]。但是我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中意外的發(fā)現(xiàn)，在兩種不相溶的溶劑同時(shí)存在的時(shí)候，溶劑中莫西克汀和那3個(gè)雜質(zhì)之間的組分比例發(fā)生了很大的變化，可以嘗試?yán)秒s質(zhì)和莫西克汀在溶劑中分配系數(shù)的不同來(lái)進(jìn)行分離，降低這3個(gè)雜質(zhì)在莫西克汀中的含量。

圖2 莫西克汀A雜質(zhì)、F雜質(zhì)、E雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式[7]

1 材料、儀器和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

莫西克汀粗品由北大醫(yī)藥重慶大新藥業(yè)股份有限公司提供，顏色為淺黃色無(wú)定型粉末，為了現(xiàn)象更明顯，選擇收集了采用柱色譜層析分離過(guò)程中A、E、F較高的部分混合制作的粗品。

1.1.2 化學(xué)試劑

HPLC用的甲醇和乙腈均為色譜純，為國(guó)藥集團(tuán)“沃凱”牌；液/液平衡使用的溶劑甲醇、甲苯、二氯甲烷、庚烷均為分析純，購(gòu)置于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；莫西克汀標(biāo)準(zhǔn)品為北大醫(yī)藥大新藥業(yè)股份有限公司提供。

1.1.3 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備

島津高壓液相TL-2010；上海滬析RWD5頂置攪拌機(jī)實(shí)驗(yàn)室電動(dòng)攪拌機(jī)；500mL梨型玻璃分液漏斗；金壇DF101B集熱式磁力攪拌器恒溫水浴鍋電動(dòng)攪拌器。

1.2 莫西克汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

準(zhǔn)確稱取莫西克汀標(biāo)準(zhǔn)品0.02516g(標(biāo)準(zhǔn)品ID號(hào)：177790，含量94.8%，產(chǎn)品編號(hào)：Y0000772)，置于25mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度線，配制成質(zhì)量濃度為954μg/mL的莫西克汀標(biāo)準(zhǔn)母液，然后再依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.48、1.91、9.54、14.31、19.08、28.62μg/mL的莫西克汀標(biāo)準(zhǔn)溶液，將莫西克汀標(biāo)準(zhǔn)溶液在以下色譜條件下進(jìn)樣檢測(cè)。色譜柱：Waters Nova Pak C18 4μm，Φ3.9mm×150mm；流動(dòng)相：稱取乙酸銨約7.7g于400mL純化水中，然后使用冰醋酸將溶液調(diào)節(jié)至pH4.8，然后加入600mL的乙腈，混勻，過(guò)濾并脫氣，即得；流速：2.5mL/min；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：242nm；柱溫：50℃。以莫西克汀標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 不同組成的兩相溶劑對(duì)莫西克汀和雜質(zhì)組分的分離效果

1.3.1 不同溶劑之間的相互溶解性

考慮到生產(chǎn)經(jīng)常使用的溶劑，所以考慮到經(jīng)濟(jì)性、毒性、安全性以及產(chǎn)品的溶劑殘留問(wèn)題，選擇了甲苯、二氯甲烷、正庚烷為非極性相，分別和甲醇的不同濃度的水溶液組成的極性相溶劑，進(jìn)行液液萃取。為了保證最大的分離效果，組成的兩相應(yīng)該有最小的互溶度?？紤]到莫西克汀在甲醇溶液中的溶解度，所以考慮含有30%～50%甲醇的甲醇溶液。分別將甲苯等體積和50%甲醇溶液，40%甲醇溶液，30%甲醇溶液混合，同樣方法進(jìn)行二氯甲烷、正庚烷的實(shí)驗(yàn)，考察甲醇溶液和實(shí)驗(yàn)的非極性相的互溶情況。

1.3.2 在常溫下非極性溶劑中莫西克汀的溶解度

根據(jù)上面實(shí)驗(yàn)選定的非極性溶劑，考察此溶劑在常溫20～25℃下對(duì)莫西克汀的溶解性，取10mL選定溶劑于15mL的具塞磨口比色管內(nèi)。緩慢向其中加入莫西克汀的固體粉末，密閉磨口塞情況下不斷震動(dòng)溶解，直到有少許溶解不完后停止加入粗品，計(jì)量加入的粗品總量。再多次少量添加溶劑溶解，直到粗品剛剛?cè)芙馔耆?，?jì)量添加的溶劑量，通過(guò)這種方式計(jì)算得到一個(gè)大概的溶劑對(duì)莫西克汀的溶解度。

1.3.3 正交對(duì)比不互溶的兩相溶劑中莫西克汀和雜質(zhì)的分配效果

根據(jù)優(yōu)選的非水溶性溶劑，進(jìn)行30%、40%、50%甲醇溶液的平衡萃取實(shí)驗(yàn)。每種濃度的甲醇溶液和非水溶性溶劑進(jìn)行四次平衡萃取。檢測(cè)每次萃取后，甲醇溶液和非水溶性溶劑中的色譜純度和莫西克汀的單位變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 莫西克汀的標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以莫西克汀標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，峰面積為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其回歸方程:y=0.0001X+0.1450，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999。該標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示莫西克汀在線性范圍0.48～28.98μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線能準(zhǔn)確地得到莫西克汀的實(shí)際質(zhì)量濃度(圖4)。

2.2 不同組成的兩相溶劑對(duì)莫西克汀和雜質(zhì)組分的分離效果

2.2.1 不同溶劑之間的相互溶解性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明和甲醇溶液互溶性最小的是庚烷，其次是二氯甲烷，互溶性最好的是甲苯。所以選擇庚烷做為液液萃取相的非極性相。

2.2.2 在常溫下溶劑中莫西克汀的溶解度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在20～25℃環(huán)境下，正庚烷對(duì)莫西克汀粗品的大致溶解度為8.3g/L。但是考慮到在大生產(chǎn)環(huán)境下能夠保證粗品的完全溶解，將庚烷溶解莫西克汀粗品的量調(diào)整到7.5～7g/L比較合理。

2.2.3 對(duì)比不互溶的兩相溶劑中莫西克汀和雜質(zhì)的分配效果

如表1、2、3、4所示，通過(guò)四次萃取，使用等體積的30%、40%、50%甲醇溶液萃取粗品的庚烷溶解液后，A雜質(zhì)的含量水平均降低到了1.5%以下，E+F雜質(zhì)的含量水平均降低到了0.5%以下。雜質(zhì)降低幅度最大的是50%甲醇水溶劑組，但是庚烷單次萃取收率和總萃取收率是最低的。綜合收率因素，30%甲醇溶液萃取組是效果最好的。最佳的萃取次數(shù)是三次。

圖4 莫西克汀標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 30%甲醇溶液和庚烷的液液萃取平衡含量變化

表2 40%甲醇溶液和庚烷的液液萃取平衡含量變化

表3 50%甲醇溶液和庚烷的液液萃取平衡含量變化

表4 三種濃度甲醇溶液和庚烷液液萃取的收率

3 討論

目前生產(chǎn)上用常壓柱層析純化的主要填料是苯乙烯-聚乙烯苯系大孔樹(shù)脂或無(wú)定型硅膠。由于處理量的要求，樹(shù)脂用量大、層析柱高，為了保證層析流速，層析填料只能采用大顆粒填料。例如代表性大孔樹(shù)脂日本三菱的HP20，其平均粒徑250μm；無(wú)定型硅膠一般為粒徑180～220μm，這兩者很難做到表1、2、3中液液萃取后庚烷相中A雜質(zhì)、E+F雜含量水平。要到達(dá)同等水平，只能使用更細(xì)的填料，例如粒徑50μm大小中壓填料和粒徑20μm大小制備柱填料來(lái)再次精制，這需要付出高昂的成本—這體現(xiàn)在昂貴的填料價(jià)格和設(shè)備價(jià)格，較低的上柱量，使用大量的有機(jī)溶媒和回收帶來(lái)的高能耗、大量污水。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果讓我們看到了另外一種使用較少成本代價(jià)達(dá)到降低雜質(zhì)的目的方法。

本實(shí)驗(yàn)只對(duì)抗生素生產(chǎn)中常用的幾種溶劑進(jìn)行了初步篩選，確定了以30%甲醇溶液和庚烷進(jìn)行液液萃取。該方法可能不是最優(yōu)的結(jié)果，但是該方法過(guò)程操作簡(jiǎn)單，對(duì)生產(chǎn)設(shè)備要求不高，絕大部分生產(chǎn)線不用改造即可使用。使用溶媒毒性低，來(lái)源廣泛，價(jià)格不高。綜合這些因素考慮，此方法是一個(gè)比較好的選擇。

實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在30%、40%、50%甲醇溶液和溶解粗品的庚烷溶劑進(jìn)行萃取的過(guò)程中都存在幾個(gè)現(xiàn)象：

(1)隨著萃取次數(shù)的增加，萃取甲醇溶液層中莫西克汀和雜質(zhì)的含量，與被萃取的庚烷層中莫西克汀和雜質(zhì)的含量，趨于一致，暗示對(duì)雜質(zhì)沒(méi)有了明顯的選擇性；(2)隨著萃取次數(shù)的增加，萃取甲醇溶液中莫西克汀的含量在逐步增加，說(shuō)明甲醇溶液對(duì)產(chǎn)品的溶解度加大，但是到最后趨于一致；(3)A雜質(zhì)，E和F雜質(zhì)最初在甲醇溶液萃取液中的含量較高，隨著萃取次數(shù)的增加，含量急劇降低，最后趨于和莫西克汀的含量形成一個(gè)固定的比值。

這些現(xiàn)象暗示，在庚烷和甲醇溶液組成的兩相液/液萃取體系中，除去莫西克汀及雜質(zhì)組分參與了分配平衡外，可能還有紫外檢測(cè)不到的物質(zhì)參與了系統(tǒng)的分配平衡，是它改變了系統(tǒng)對(duì)莫西克汀和雜質(zhì)的分配情況導(dǎo)致了萃取初期表現(xiàn)出了對(duì)A、E、F雜質(zhì)的特異性選擇。隨著萃取次數(shù)的增多，其對(duì)系統(tǒng)分配平衡的影響在減弱，最終兩相系統(tǒng)的萃取平衡趨于一致。因此這種未知物質(zhì)可能為我們提供一個(gè)思路，即嘗試找到起同樣效果的一種溶劑或者混合溶劑，通過(guò)在液/液萃取平衡中添加這種溶劑來(lái)實(shí)現(xiàn)每次都是特異性萃取的效果，這樣既降低了萃取中莫西克汀的損耗，也提高了雜質(zhì)的去除效率。因此在后續(xù)工作中，我們會(huì)嘗試去尋找和驗(yàn)證這種溶劑，繼續(xù)提高莫西克汀的收率。