基因編輯新技術(shù)CRISPR-Cas系統(tǒng)研究及應(yīng)用進(jìn)展

康細(xì)林，儲丹丹，單斌,*

(1 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，昆明 650032；2 云南省檢驗醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實驗室，昆明 650032；3 云南省實驗診斷研究所，昆明 650032)

1 CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介

1.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展

CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)從發(fā)現(xiàn)到功能的確定共經(jīng)歷了20余年的時間，近年來其基本結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制逐漸得到闡明。CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌長期進(jìn)化過程中抵御噬菌體入侵和外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)移而形成的一種獲得性免疫系統(tǒng)，該系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)最早可追溯到1987年，日本的Ishino等[3]研究團(tuán)隊在大腸埃希菌的堿性磷酸酶基因中觀察到一個29bp的重復(fù)序列，這一發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時并沒有引起人們的關(guān)注，但隨后更多的研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)菌和古細(xì)菌中廣泛存在這種重復(fù)序列。直到2002年將其正式命名為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)[4-6]，同時CRISPR相關(guān)蛋白也得以命名[2]。2005年，三組生物信息學(xué)團(tuán)隊報道了CRISPR中的間隔DNA序列與入侵細(xì)菌的外源核酸序列相符合，推測C RIS PR系統(tǒng)在微生物免疫中可能起了作用[7-9]。2007年，Barrangou等[10]的研究證實，CRISPR系統(tǒng)可以從噬菌體基因組上取得新的間隔序列，從而獲取相應(yīng)的免疫能力。2010年CRISPR的基本功能和機(jī)制變得清晰。2011年，Charpentier團(tuán)隊發(fā)表了完整的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，預(yù)測了其在基因組工程中極大的潛在價值[11]。2012年，由RNA介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)CRISPR-Cas9(CRISPR/CRISPRassociate 9)開始發(fā)展起來[12-13]。2013年，兩項研究同時實現(xiàn)從嗜熱鏈球菌和釀膿鏈球菌中設(shè)計Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)，并完成在哺乳動物細(xì)胞中的基因組編輯[14-16]。從此作為新一代的基因編輯技術(shù)，CRISPR技術(shù)具有廣闊的發(fā)展空間和應(yīng)用前景[14]。

1.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

CRISPR-Cas系統(tǒng)主要由前導(dǎo)序列(Leader sequence,LS)、CRISPR基因座及CRISPR相關(guān)基因 (CRISPR-associated gene,Cas gene)組成(見圖1)。前導(dǎo)序列位于CRISPR第一個重復(fù)序列的上游，大約200～500bp，其序列中富含AT[17]，在CRISPR-Cas系統(tǒng)中扮演為新間隔序列獲得提供識別位點(diǎn)[18]和轉(zhuǎn)錄時啟動子的角色[19]。CRISPR基因座是由長度相似的重復(fù)序列和間隔序列排列而成的CRISPR陣列，重復(fù)序列長度約為21～48bp，其序列存在二重對稱性，即可以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，重復(fù)次數(shù)可多達(dá)250次，是Cas蛋白的結(jié)合區(qū)域[4,20]。間隔序列是高度可變的序列，具有豐富的多樣性，間隔序列長度與細(xì)菌種類和CRISPR位點(diǎn)有關(guān)，長度一般為20～72bp[20]。該序列與噬菌體或質(zhì)粒序列存在高度同源性[3,21]，甚至有一些間隔序列與噬菌體基因組序列完全一致[22]，這 表明間隔序列來源于噬菌體基因組。每個重復(fù)序列與間隔序列構(gòu)成一個CRIS PR單位，數(shù)個CRISPR單位構(gòu)成CRISPR陣列。CRISPR相關(guān)基因是靠近CRISPR基因座附近的一組高度保守基因群，其所編碼的Cas蛋白，包含核酸內(nèi)切酶、解旋酶以及與核糖核酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，能夠識別外源DNA，通過位點(diǎn)特異性的切割將入侵DNA切斷[23]。

1.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的分類

根據(jù)CRISPR-Cas系統(tǒng)中Cas蛋白參與作用與功能不同，Makarova等[25]將CRISPR-Cas系統(tǒng)分為以下三種類型：即I型、II型和III型。I型CRISPR-Cas系統(tǒng)中起主要作用的是Cas3基因，它編碼的Cas 3蛋白具有解旋酶活性及DNA酶活性，是干擾階段起主要作用的酶[26]。II型 CRISPR-Cas 系統(tǒng)起主要作用的是Cas9基因，該系統(tǒng)可以分為3個亞型，即具有Cas2附加基因的Ty pe II-A系統(tǒng)、具有Cas4附加基因的Type II-B系統(tǒng)和無附加基因的Type II-C系統(tǒng)[25]。而III型 CRISPR-Cas系統(tǒng)可編碼聚合酶和RAMP分子，分為兩個亞型，即可識別靶DNA序列的Type III-A系統(tǒng)和識別RNA的Type III-B系統(tǒng)。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)結(jié)構(gòu)模式圖 [24]

1.4 CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制

CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制可歸納為：“適應(yīng)”、“表達(dá)”和“干擾”三個階 段。

在適應(yīng)階段CRISPR-Cas系統(tǒng)獲得新的間隔序列。當(dāng)噬菌體或質(zhì)粒進(jìn)入含有CRISPR-Cas系統(tǒng)的細(xì)菌和古細(xì)菌中時，宿主體內(nèi)的CRISPR相關(guān)蛋白質(zhì)復(fù)合體與噬菌體或質(zhì)粒DNA的原型間隔序列 毗鄰基序(protospacer adjacent motifs，PAM)進(jìn)行結(jié)合，將與PAM毗鄰的一段DNA序列作為候選的原型間隔序列(protospacer)，然后在相關(guān)蛋白的作用下[27]，將原型間隔序列整合至前導(dǎo)序列與第一個重復(fù)序列之間，形成一個新的間隔序列，從而使得CRISPR基因座中存在該噬菌體或質(zhì)粒的序列信息，為細(xì)菌的獲得性免疫奠定了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

在表達(dá)階段CRISPR-Cas系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)生成熟的CRISPR R NA(crRNA)。當(dāng)噬菌體或質(zhì)粒再次入侵時，CRISPR-Cas系統(tǒng)的前導(dǎo)序列發(fā)揮“啟動子”樣的功能啟動轉(zhuǎn)錄并轉(zhuǎn)錄出一段序列特異的CRISPR RNA前體(pre-crRNA)，經(jīng)加工剪接成為成熟的crRNA。該加工過程是由Cas蛋白催化的，不同CRISPR-Cas系統(tǒng)中參與該催化過程的Cas蛋白不同[23]。

在干擾階段CRISPR-Cas系統(tǒng)實現(xiàn)對靶基 因的裂解。pre-crRNA在Cas蛋白的作用下被加工為成熟的crRNA。后者與Cas蛋白結(jié)合形成蛋白復(fù)合物，該蛋白復(fù)合物中crRNA的間隔序列識別入侵的噬菌體或質(zhì)粒的核酸序列并與之互補(bǔ)結(jié)合，隨后對外源DNA或RNA的特定位 點(diǎn)進(jìn)行切割，使得外源核酸的序列因其完整性受到破壞而無法在宿主體內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制[28-30]。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用進(jìn)展

近年來，隨著人們對CRISPR-Cas系統(tǒng)認(rèn)識的不斷加深，CRISPR-Cas系統(tǒng)因其操作較簡單、編輯效率較高、成本較低、耗時較短而被廣泛運(yùn)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、工業(yè)、生物工程、醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域。

[7] 潘立友,李彩榮,陳理強(qiáng).斷層夾持型不規(guī)則工作面沖擊地壓成因與防控[J].煤炭科學(xué)技術(shù),2018,46(10):45-50.

2.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因編輯中的應(yīng)用

朱健康實驗室利用CRISPR-Cas系統(tǒng)在擬南芥和水稻中實現(xiàn)了基因組的突變，突變效率為5%～48%[31]。有人曾設(shè)想在發(fā)酵工程中，利用CRISPR-Cas系統(tǒng)的“免疫功能”來抵抗噬菌體的感染，即在工業(yè)用菌的CRISPR序列中插入與目的噬菌體同源的間隔序列。關(guān)于這個設(shè)想，目前已經(jīng)申報了國際專利(2007025097)。2012年Doudn研究小組首先利用釀膿鏈球菌的CRISPR-Cas系統(tǒng)和人工合成的crRNA序列對體外的DNA進(jìn)行精確切割，并且把crRNA：tracrR NA復(fù)合物改造成單鏈向?qū)У腞NA嵌合體，后者同樣可以用來指導(dǎo)Cas9蛋白在特定位點(diǎn)剪切雙鏈DNA[32]。有研究小組發(fā)現(xiàn)將Cas9、crRNA、tracrRNA三者構(gòu)建于同一個質(zhì)粒上轉(zhuǎn)染可對293T細(xì)胞的特定位點(diǎn)進(jìn)行精確切割[14]。隨后有很多研究團(tuán)隊在人、小鼠和斑馬魚等細(xì)胞中利用 CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行基因組的編輯[15,33-34]。2013年Cong等[14]首次報道利用CRIS PR-Cas9系統(tǒng)對人293T細(xì)胞的EMXl和PVALB基因以及小鼠Nem2A細(xì)胞的Th基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變，該文章同時報道了哺乳動物細(xì)胞內(nèi)crRNA的成熟不需要細(xì)菌的RNaseⅢ。由此可見，CRISPR-Cas系統(tǒng)作為基因編輯工具的一種，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于很多領(lǐng)域。

2.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因表達(dá)中的應(yīng)用

除了將CRISPR-Cas系 統(tǒng)作為基因工具外，科學(xué)家還將其改造為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的工具。Bikard等[35]將Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)域(RuvC、HNH)突變后形成不能裂解目標(biāo)DNA但能結(jié)合目標(biāo)DNA的dCas9蛋白，發(fā)現(xiàn)當(dāng)dCas9蛋白結(jié)合到基因啟動子的不同區(qū)域時能抑制轉(zhuǎn)錄的起始或延伸。同時作者還發(fā)現(xiàn)將RNA聚合酶(RNAP)的ω亞基與Cas9蛋白的融合體結(jié)合至啟動子的上游區(qū)域能達(dá)到轉(zhuǎn)錄激活的目的。隨后，有研究團(tuán)隊在真核生物細(xì)胞內(nèi)源性基因上進(jìn)一步證實了dCas9蛋白對基因表達(dá)的調(diào)控作用[36-37]。這說明改變Cas蛋白的結(jié)構(gòu)域或?qū)⑥D(zhuǎn)錄激活亞基結(jié)合至Cas蛋白能將CRISPR-Cas系統(tǒng)改造成基因表達(dá)調(diào)控工具。

2.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)在細(xì)菌領(lǐng)域的應(yīng)用

2.3.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌分型

目前發(fā)現(xiàn)在40%已測序的細(xì)菌中存在CRISPRCas系統(tǒng)。在細(xì)菌進(jìn)化過程中，CRISPR序列中間隔序列的插入和剔除使得CRISPR位點(diǎn)具有極高的多態(tài)性。利用適當(dāng)?shù)囊颬CR擴(kuò)增CRISPR位點(diǎn)，測序后獲得CRISPR序列。通過分析CRISPR位點(diǎn)中間隔序列的組成和排列順序，可以用于細(xì)菌分型。因此，CRISPR也可作為細(xì)菌分型的理想位點(diǎn)，且目前已有研究者利用這一原理對細(xì)菌進(jìn)行分型。例如基于CRISPR的分子分型在結(jié)核桿菌領(lǐng)域的應(yīng)用有近20年的歷史，為結(jié)核桿菌的區(qū)域性分布和暴發(fā)流行研究提供有力的分析手段。Kamerbeek等[38]于1997年利用CRISPR-Cas系統(tǒng)創(chuàng)建了“spacer oligotyping”(恒間隔序列譜系分型)或“Spoligotyping”(恒間隔點(diǎn)陣分型)分型方法，目前以CRISPR位點(diǎn)多態(tài)性為基礎(chǔ)的恒間隔點(diǎn)陣分型是應(yīng)用較為廣泛的分型方法。這種分型方法已成為結(jié)核分枝桿菌分型的標(biāo)準(zhǔn)方法之一；法國的研究者對783株沙門菌進(jìn)行了研究，證明CRISPR對于沙門菌是一種高分辨力和實用的分型方法，對檢測沙門菌感染和暴發(fā)有重要作用。Liu等[39]在沙門菌的分型研究過程中建立了一種新的MLST分型方法；基于CRISPR的空腸彎曲桿菌的分子分型始于2003年[40]，研究者用CRISPR位點(diǎn)對184株空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)分型，發(fā)現(xiàn)74%的樣本中存在典型的CRISPR位點(diǎn)，對其進(jìn)行分型的結(jié)果表明其分辨率與擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分析(amplifi ed fragment length po lymorphism，AFLP)和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequencetyping，MLST)相近[41]。Louwen[42]于2013年將空腸彎曲桿菌分子分型從CRISPR擴(kuò)展到了Cas蛋白的多態(tài)性。

2.3.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌進(jìn)化分析

在細(xì)菌與噬菌體等外源DNA的斗爭過程中，新的間隔序列的插入使細(xì)菌獲得了對噬菌體等的免疫。研究發(fā)現(xiàn)新間隔序列的插入是有規(guī)律的，其總是插入前導(dǎo)序列和其原來臨近的重復(fù)序列之間，而被剔除的間隔序列通常位于CRISPR位點(diǎn)3'端的尾隨序列[22]。CRISPR位點(diǎn)間隔序列的變化，在一定程度上記錄了細(xì)菌在不同時期、不同環(huán)境中遭遇外源DNA攻擊的歷史。因此，CRISPR位點(diǎn)間隔序列的特點(diǎn)可以反映細(xì)菌的進(jìn)化歷程，有助于研究不同細(xì)菌之間的親緣關(guān)系。Philippe等[22]通過對嗜熱鏈球菌CRISPR位點(diǎn)間隔序列的組成情況分析，從而推導(dǎo)出不同嗜熱鏈球菌的親緣關(guān)系；Pourel等[9]通過建立CRISPR的進(jìn)化模型，推測出了鼠疫桿菌祖先基因序列中CRISPR位點(diǎn)的序列情況；崔玉軍等[43]通過CRISPR位點(diǎn)分析建立了鼠疫菌的進(jìn)化模型，從而推斷鼠疫菌的主要傳播路線及傳播方式。

2.3.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌的毒性和耐藥性

有研究顯示化膿鏈球菌攜帶的間隔序列數(shù)與菌株帶有的前嗜菌體數(shù)成反比[44]。Bikard等[45]構(gòu)建了以致病性肺炎鏈球菌中的莢膜基因為靶標(biāo)的CRISPRCas系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論是在體外還是體內(nèi)感染實驗中，該系統(tǒng)都能有效阻止含有莢膜基因的質(zhì)粒進(jìn)入無毒菌株從而抑制了毒力的傳播。Bikard還構(gòu)建了以受體菌染色體上一段耐藥基因為靶標(biāo)的CRISPRCas系統(tǒng)，將含有該系統(tǒng)的質(zhì)粒導(dǎo)入受體菌后導(dǎo)致了細(xì)菌的死亡。有研究表明CRISPR-Cas系統(tǒng)還能通過限制質(zhì)粒結(jié)合而控制藥物抗性基因在致病菌之間的擴(kuò)散[46]。

2.3.4 CRISPR-Cas系統(tǒng)與細(xì)菌的防御作用

1987年，在研究大腸埃希菌K12參與堿性磷酸酶iap酶時，人們發(fā)現(xiàn)在iap基因的下游存在29nt的重復(fù)序列，它被5個32nt的非重復(fù)序列所間隔。它們存在于40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中。Jansen和Mojica將包含上述間隔重復(fù)序列的微生物基因組位點(diǎn)命名為CRISPR。同時，CRISPR關(guān)聯(lián)基因(Cas)被發(fā)現(xiàn)高度保守，且往往與CRISPR重復(fù)元件結(jié)合。II型CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)只需要一個Cas9蛋白來切割DNA雙鏈，這使得它易于改造。

Horvath團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列決定靶標(biāo)特異性，而Cas酶控制間隔序列的獲得和噬菌體防御。原始間隔序列相鄰元件(PAM)可能介導(dǎo)II型Cas9核酸酶切割DNA，基于這一推測，Moineau團(tuán)隊通過證明噬菌體基因組PAM序列的突變可規(guī)避CRISPR的干擾，證實了PAM序列的重要性。另外，對I型和II型來說，CRISPR的直接重復(fù)序列不含有PAM，從而阻止CRISPR系統(tǒng)的自我切割。

2010年前后，兩項研究描述了天然II型CRISPR系統(tǒng)的功能機(jī)制，闡述了它的基本組成。首先，Moineau團(tuán)隊通過對嗜熱鏈球菌的遺傳學(xué)研究揭示了Cas9是Cas基因簇中唯一介導(dǎo)靶DNA切割的酶。接著，Charpentier團(tuán)隊揭示了II型CRISPR系統(tǒng)中crRNA的生物發(fā)生和加工過程中一個關(guān)鍵的成分—一種非編碼的反式激活crRNA(tracrRNA)，它與crRNA雜交以促進(jìn)RNA介導(dǎo)的Cas9靶向。這個雙RNA雜交復(fù)合物，與Cas9及內(nèi)源的RNA酶III一起，是將CRISPR轉(zhuǎn)錄并加工為成熟的crRNA所必需的。這兩項研究表明，至少有3個元件(Cas9、成熟crRNA和tracrRNA)是重構(gòu)II型CRISPR核酸酶系統(tǒng)所必需的。

2011年，Siksnys團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)II型CRISPR位點(diǎn)可以從嗜熱鏈球菌移植到大腸埃希菌且重現(xiàn)CRISPR干擾功能。2012年，Charpentier、Doudna和Siksnys 3個團(tuán)隊的研究表明，純化的Cas9在體外可以通過crRNA介導(dǎo)來切割DNA。進(jìn)一步地，一種將crRNA和tracrRNA融合而得的單向?qū)NA(sgRNA)被證明可以成功地介導(dǎo)體外源DNA切割。

2.4 CRISPR-Cas系統(tǒng)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用

2.4.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)在疾病模型構(gòu)建中的應(yīng)用

Wang等[47]將Cas9的mRNA及兩種不同的導(dǎo)向RNA直接注射入小鼠的受精卵細(xì)胞中，獲得了兩種基因同時缺陷的小鼠，并且效率高達(dá)80%，大大簡化了基因敲除鼠的形成過程，縮短了疾病模型鼠的產(chǎn)生周期。由于模擬人類血管性血友病的大鼠模型不能很好地完全概括人類血管性血友病的特點(diǎn)，而豬血管的大小及結(jié)構(gòu)與人類的血管很相似，因此，有人利用CRISPR-Cas系統(tǒng)成功構(gòu)建了更能代表人類血管性血友病的特點(diǎn)的豬模型[48]。目前有人已經(jīng)成功地在細(xì)胞HEK293和其他生理相關(guān)的細(xì)胞中構(gòu)建了染色體易位導(dǎo)致的肺腺癌模型、一系列因染色體插入而導(dǎo)致肺腺癌的細(xì)胞系[49]、急性髓系白血病以及肉瘤模型[50]。

2.4.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)在疾病治療中的應(yīng)用

隨著CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因編輯領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，它為基因疾病的治療提供了很好的前景。眾所周知，人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)在治療一些人類的遺傳疾病方面很有前景[51-52]。CRISPRCas系統(tǒng)與iPS聯(lián)合利用能為某些疾病的治療提供有效的治療方法，例如用iPS細(xì)胞治療人類的鐮刀型貧血癥，可以將病人的皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，然后利用CRISPR-Cas9突變型的切口酶來介導(dǎo)同源重組修復(fù)突變的血紅蛋白基因，再將修復(fù)的iPS細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為造血干細(xì)胞移植到病人體內(nèi)。目前，人們在動物模型中實現(xiàn)了利用CRISPR-Cas系統(tǒng)來修正疾病的突變位點(diǎn)，例如2013年Wu等[53]在大鼠的胚胎中用CRISPR-Cas系統(tǒng)修正了能導(dǎo)致大鼠白內(nèi)障的Crygc基因的一個突變結(jié)構(gòu)域后發(fā)現(xiàn)這些大鼠的白內(nèi)障得以解除。因此，人們推測該系統(tǒng)可能在腫瘤及重大傳染病的治療中發(fā)揮重要作用。除了在疾病模型的構(gòu)建及疾病治療方面的應(yīng)用外，該系統(tǒng)在藥物的研發(fā)和制造方面也可能發(fā)揮重要作用。

3 結(jié)語

CRISPR-Cas系統(tǒng)作為細(xì)菌在適應(yīng)噬菌體攻擊所進(jìn)化而成的 “免疫系統(tǒng)”，在抵御外來入侵時發(fā)揮重要作用。到目前為止，CRISPR位點(diǎn)在很多細(xì)菌和古生物菌中都有發(fā)現(xiàn)，這種結(jié)構(gòu)普遍的存在于細(xì)菌及古生物菌中，證明該位點(diǎn)對于細(xì)菌的生存進(jìn)化有著舉足輕重的作用，因此成為眾多科學(xué)家研究的重點(diǎn)。基于其類似RNA干擾的作用，人們對它的應(yīng)用不僅僅局限于原核生物，目前CRISPR-Cas系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、醫(yī)學(xué)衛(wèi)生事業(yè)等諸多領(lǐng)域。CRISPR-Cas系統(tǒng)除了可以用作基因編輯工具外，還可以通過對其改造而作為基因表達(dá)調(diào)控工具。但不可否認(rèn)的是CRISPR-Cas系統(tǒng)作為一種新型的基因編輯工具，其自身也存在一定的問題，其中最主要的問題就是脫靶效應(yīng)。因此，如何降低操作過程中的脫靶率，成為了更好利用該系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的關(guān)鍵因素。隨著對CRISPR-Cas系統(tǒng)地深入研究，CRISPR-Cas系統(tǒng)將會在更多的領(lǐng)域發(fā)揮更重要的作用。