昆蟲(chóng)氣味受體研究技術(shù)及其在林業(yè)昆蟲(chóng)中的應(yīng)用研究進(jìn)展*

申思凡 張 真 孔祥波 劉 福 張?zhí)K芳

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100091)

嗅覺(jué)在昆蟲(chóng)的生存和種群繁衍過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，昆蟲(chóng)通過(guò)嗅覺(jué)感受器識(shí)別周圍環(huán)境中的氣味分子，并將這些化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)電信號(hào)，從而調(diào)節(jié)自身的生物學(xué)過(guò)程。隨著昆蟲(chóng)行為學(xué)、生物化學(xué)、分子生物學(xué)和昆蟲(chóng)電生理技術(shù)的發(fā)展，昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)反應(yīng)機(jī)制研究不斷深入。研究發(fā)現(xiàn)，氣味結(jié)合蛋白(odorant binding protein, OBP)、氣味受體(odorant receptor, OR)、氣味降解酶(odorant degrading enzyme, ODE)、化學(xué)感受蛋白(chemosensory protein, CSP)、感覺(jué)神經(jīng)元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)等多種蛋白質(zhì)都參與了氣味識(shí)別過(guò)程，其中昆蟲(chóng)嗅覺(jué)感受的第一個(gè)步驟由存在于化感器腔內(nèi)的氣味結(jié)合蛋白完成，它與氣味分子結(jié)合，并將其運(yùn)送至嗅覺(jué)神經(jīng)末梢(Vogtetal., 1999)，而氣味受體介導(dǎo)的氣味分子與嗅覺(jué)感受器內(nèi)的神經(jīng)元的專一性結(jié)合是嗅覺(jué)識(shí)別的重要基礎(chǔ)(Vosshalletal., 2000; Benton, 2006)。因此，氣味受體研究是闡明昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制的重要部分，吸引眾多昆蟲(chóng)學(xué)家不斷探索，目前已經(jīng)取得了較為深入的研究結(jié)果。前人已對(duì)氣味受體(包括普通氣味受體、信息素氣味受體和非典型氣味受體)的功能，與G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor, GPCR)的聯(lián)系，分子進(jìn)化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等做了總結(jié)(喬奇等， 2008； 張春香等， 2011； 俞明明等， 2011； 尹淑艷等， 2013； Zhangetal., 2014)。筆者基于昆蟲(chóng)氣味受體研究的已有結(jié)果，從其發(fā)現(xiàn)、特征、基因功能研究方法幾個(gè)方面逐層總結(jié)了昆蟲(chóng)氣味受體的功能和分子機(jī)制； 并著重分析了林業(yè)昆蟲(chóng)氣味嗅覺(jué)識(shí)別和氣味受體研究的進(jìn)展和不足，以期為林業(yè)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制研究提供參考。

1 OR基因的發(fā)現(xiàn)歷史

1991年氣味受體家族在大鼠(Rattusnorvegicus)嗅覺(jué)上皮細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)(Bucketal., 1991)； 1992年人類氣味受體也被找到(Parmentieretal., 1992)； 隨后斑點(diǎn)叉尾鮰(Lctaluruspunctatus)等脊椎動(dòng)物的氣味受體基因通過(guò)同源克隆的方式得到(Ngaietal., 1993)； 1995年，通過(guò)全基因組測(cè)序的方法篩選到秀麗隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditiselegans)的氣味受體家族(Troemeletal., 1995)。之后，Clyne(1999)首次在果蠅中鑒定到第一個(gè)昆蟲(chóng)氣味受體家族。后人不斷對(duì)果蠅氣味受體進(jìn)行研究，其家族也逐漸擴(kuò)大，共鑒定到62個(gè)受體基因(Vosshalletal., 2000; Jonesetal., 2005)。之后，岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)(Hilletal., 2002)、家蠶(Bombyxmori)(Sakuraietal., 2004; Wanneretal., 2007)、意大利蜜蜂(Apismellifera)(Robertsonetal., 2006)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(Bohbotetal., 2007)全基因組測(cè)序成功，分別鑒定得到79、48、170、131個(gè)OR基因。

2 OR基因的結(jié)構(gòu)和分類

昆蟲(chóng)氣味受體是位于嗅覺(jué)感受神經(jīng)元樹(shù)突上的膜蛋白，由一個(gè)基因家族所編碼，與脊椎動(dòng)物或線蟲(chóng)的氣味受體的基因序列同源性較低。目前，果蠅OR基因研究最為透徹，雖然對(duì)鱗翅目家蠶(Wanneretal., 2007)、煙芽夜蛾(Heliothisvirescens)(Soquesetal., 2010)，雙翅目岡比亞按蚊(Meijerinketal., 2001)、果蠅(Kielyetal., 2007)、瓜實(shí)蠅(Bactroceracucurbitae)(申建梅等， 2011)等，膜翅目意大利蜜蜂(Wanneretal., 2007)等昆蟲(chóng)也進(jìn)行了一些研究，但研究的目標(biāo)昆蟲(chóng)尚集中在一些具有重要經(jīng)濟(jì)或醫(yī)學(xué)意義的昆蟲(chóng)種類上，如家蠶和煙芽夜蛾等。

昆蟲(chóng)OR由300～500個(gè)氨基酸組成，N端沒(méi)有信號(hào)肽序列； 昆蟲(chóng)氣味受體的結(jié)構(gòu)與具有7個(gè)跨膜區(qū)域的脊椎動(dòng)物的GPCR類似，但是不同于GPCR的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，其N端位于細(xì)胞內(nèi)且C端位于細(xì)胞外(Bentonetal., 2006)。昆蟲(chóng)的OR基因可以分為2類，一類是編碼功能氣味受體的基因，這類基因在不同昆蟲(chóng)間的同源性較低，另一類基因在不同昆蟲(chóng)間較為保守(Larssonetal., 2004)，與傳統(tǒng)的氣味受體不同，這類基因不感受氣味分子，而是作為一種共表達(dá)受體基因，與傳統(tǒng)氣味受體一起識(shí)別氣味分子(Dobritsaetal., 2003)。這類受體最初在果蠅中被鑒定出來(lái)，被命名為Or83b (Vosshalletal., 2000)，后來(lái)又在不同的昆蟲(chóng)中鑒定出了Or83b的同源受體，如岡比亞按蚊(Pittsetal., 2004)、埃及伊蚊(Meloetal., 2004)、煙芽夜蛾(Kriegeretal., 2003)等，當(dāng)時(shí)被命名為不同的名字。為了方便交流，同時(shí)由于不同昆蟲(chóng)之間的這類基因同源性很高，所以目前已被統(tǒng)稱為Orco(Odorant receptor co-receptor)(Vosshalletal., 2011)。

Orco是將傳統(tǒng)OR定位于樹(shù)突膜所必需的(Stengletal., 2013)。Orco與傳統(tǒng)的氣味受體通過(guò)保守的C末端區(qū)域相互作用形成OR-Orco復(fù)合物，這一新的配體門(mén)控離子通道，當(dāng)Orco被基因打靶或RNA干擾沉默時(shí)，昆蟲(chóng)會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的嗅覺(jué)缺陷。闡明Orco在昆蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別中的作用機(jī)制可能為開(kāi)發(fā)基于昆蟲(chóng)嗅覺(jué)行為干擾的新型害蟲(chóng)防治措施提供依據(jù)。Orco中的大多數(shù)氨基酸殘基在昆蟲(chóng)序列中保守性很好。Jones等(2005)利用GAL4-UAL系統(tǒng)，將與果蠅Orco基因直系同源的地中海實(shí)蠅(Ceratitiscapitata)、岡比亞按蚊和美洲棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpazea)的Orco基因在突變果蠅品系的相應(yīng)嗅覺(jué)感受神經(jīng)元(olfactory sensory neuron, OSN)中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因果蠅可以恢復(fù)其相應(yīng)的嗅覺(jué)功能。Mitsuno等(2008)也得出了相應(yīng)的結(jié)論，他們?cè)趯?duì)小菜蛾(Plutellaxylostella)、黏蟲(chóng)(Mythimnaseparata)和瓜絹螟(Diaphaniaindica)相應(yīng)的OR進(jìn)行功能測(cè)試的時(shí)候，將與之共注射的自身表達(dá)的Orco基因換成了家蠶的Orco基因，發(fā)現(xiàn)其對(duì)氣味分子的感受譜不變，顯示出了Orco基因的高度保守性。

3 OR基因功能研究主要方法

目前，對(duì)OR基因的研究，主要集中于鑒定表達(dá)及功能方面。關(guān)于鑒定，常用的方法有原位雜交(Grosse-Wildeetal., 2010)、RT-PCR(Mitsunoetal., 2008)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(Zhangetal., 2014)、甚至基因組測(cè)序(Mckennaetal., 2016)； 表達(dá)量研究一般通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction, Q-PCR)或者轉(zhuǎn)錄組測(cè)序檢測(cè)各個(gè)氣味受體基因在各個(gè)組織中的表達(dá)量(Patchetal., 2009; Zhangetal., 2017)。由于OR屬于膜蛋白，其功能研究主要依賴于幾種膜蛋白表達(dá)系統(tǒng)，如HEK293細(xì)胞(Grosse-Wildeetal., 2007)、 爪蟾卵母細(xì)胞體外表達(dá)系統(tǒng)(Mitsunoetal., 2008)、 果蠅空神經(jīng)元系統(tǒng)(Montagnéetal., 2012)等。同時(shí)，RNAi (RNA interference)與Crispr/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated sequence)系統(tǒng)也逐漸在OR功能研究中得到應(yīng)用(Zhuetal., 2013; Lietal., 2016)。

3.1 爪蟾卵母細(xì)胞體外表達(dá)系統(tǒng)

非洲爪蟾(Xenopuslaevis)的卵母細(xì)胞是應(yīng)用最早的基因功能表達(dá)體系之一。Gurdon等(1981)首次將純化的DNA注射到爪蟾卵母細(xì)胞獲得了正確的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，其應(yīng)用又有進(jìn)一步的擴(kuò)展。Mitsuno等(2008)將小菜蛾、黏蟲(chóng)、瓜絹螟OR1和其Orco的cRNA共同注射到爪蟾卵母細(xì)胞中，成功表達(dá)，隨后利用雙電極電壓鉗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了3個(gè)OR對(duì)7種氣味分子的反應(yīng)，小菜蛾對(duì)Z11-16:Ald的反應(yīng)最強(qiáng)，黏蟲(chóng)對(duì)Z11-16:Ac的反應(yīng)最強(qiáng)，瓜絹螟對(duì)E11-16:Ald的反應(yīng)最強(qiáng)。該技術(shù)在昆蟲(chóng)OR功能研究中得到了廣泛的應(yīng)用，完成了多種昆蟲(chóng)OR功能鑒定，如玉米螟(Ostrinianubilalis)(Wanneretal., 2010)、棉鈴蟲(chóng)(Helicoverpaarmigera)和煙青蟲(chóng)(Heliothisassulta)(Jiangetal., 2014; Caoetal., 2016)、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)(Liuetal., 2013; Liuetal., 2014)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)(Zhangetal., 2013; 2015)等。

3.2 其他異源細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

HEK293細(xì)胞是一個(gè)很常用的研究外源基因功能的細(xì)胞株。Grosse-Wilde等(2007)將煙芽夜蛾的OR13受體在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)，并通過(guò)鈣離子成像的方法檢測(cè)到了氣味分子刺激時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化； 發(fā)現(xiàn)其對(duì)主要的性信息素組分Z11-16:Ald反應(yīng)最強(qiáng)，對(duì)其他幾種氣味分子也可以產(chǎn)生反應(yīng)，推測(cè)OR13可能為性信息素受體。

Sf9細(xì)胞是草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞，是一種昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。Jordan等(2009)鑒定了蘋(píng)淡褐卷葉蛾(Epiphyaspostvittana)的3個(gè)OR基因，鈣離子成像結(jié)果顯示EpOR1和EpOR3都能識(shí)別植物產(chǎn)生的一系列萜類和苯甲酸酯，EpOR1對(duì)水楊酸甲酯最敏感，這是花卉氣味的常見(jiàn)成分，也是植物受到昆蟲(chóng)和病原體侵襲時(shí)產(chǎn)生的重要信號(hào)化合物，EpOR3能很好地識(shí)別單萜檸檬醛，并引發(fā)驅(qū)避雌性飛蛾排卵的活性； 而EpOR2與黑腹果蠅的共同受體Orco是直系同源的。

3.3 果蠅空神經(jīng)元系統(tǒng)

果蠅是研究復(fù)雜生物過(guò)程中遺傳和細(xì)胞生物學(xué)通路的一個(gè)重要模型，用分子遺傳學(xué)方法構(gòu)建UAS/GAL4系統(tǒng)可以將任何基因在果蠅的特定組織和細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。Montagné等(2012)將灰翅夜蛾(Spodopteralittoralis)的性信息素受體OR6成功在果蠅體內(nèi)表達(dá)，并通過(guò)單感記錄檢測(cè)其對(duì)氣味分子產(chǎn)生的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其對(duì)Z9, E12-14:OAc反應(yīng)最強(qiáng)。之后，de Fouchier等(2017)首次系統(tǒng)分析了鱗翅目灰翅夜蛾的全部OR基因，將47個(gè)候選OR基因成功表達(dá)30個(gè)，其中的17個(gè)OR基因成功找到了氣味配體。每個(gè)OR都存在于相應(yīng)的OSN中，對(duì)表達(dá)相應(yīng)氣味受體的OSN進(jìn)行功能分析，結(jié)果顯示其對(duì)氣味的識(shí)別與OR基因?qū)馕兜淖R(shí)別一致，表明果蠅空神經(jīng)元系統(tǒng)的可信度很高。隨后對(duì)已驗(yàn)證功能的OR基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，最基礎(chǔ)的譜系表現(xiàn)了低的平均遺傳距離，它們對(duì)芳香烴最敏感，其次是萜烯類受體，而脂肪族受體屬于具有最高平均遺傳距離的OR譜系。這表明芳香族化合物的受體首先出現(xiàn)并且在鱗翅目進(jìn)化過(guò)程中更加保守，而萜烯和脂肪族化合物的受體最近出現(xiàn)并且進(jìn)化得更快(特別是脂肪族受體，包括信息素受體)。其中，SlitOR36是一個(gè)例外，該受體對(duì)所有活性配體均表現(xiàn)出高響應(yīng)閾值，表明其關(guān)鍵配體仍有待確定。

3.4 RNAi與Crispr/Cas9系統(tǒng)在OR中的應(yīng)用

RNAi是一種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制，由雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA)進(jìn)入細(xì)胞形成的。Zhu等(2013)克隆了熱帶家蚊(Culexquinquefasciatus)2個(gè)氣味受體基因，OR37和OR99，分別對(duì)4-甲基苯酚和4-乙基苯酚有反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)證明產(chǎn)卵期的雌蚊在含有這2種信息素的容器里的產(chǎn)卵量明顯高于只有水的容器； 將CquiOR37/99-dsRNA，β-galactosidase-dsRNA或水分別注射到蛹的血淋巴中，Q-PCR分析顯示個(gè)體差異，但CquiOR37/99-dsRNA處理的家蚊中CquiOR37和CquiOR99轉(zhuǎn)錄物水平顯著降低，注射水的雌蚊和用對(duì)照基因處理的雌蚊在含有4-乙基苯酚的盤(pán)中比在水盤(pán)中產(chǎn)生更多的卵，而CquiOR37/99-dsRNA處理的雌蚊產(chǎn)生正常數(shù)量的卵，但不能區(qū)別于對(duì)照組； 該研究首次將4-乙基苯酚的特異性氣味受體與熱帶家蚊的產(chǎn)卵增加聯(lián)系起來(lái)。

基因組編輯是基因功能分析的重要工具，并表現(xiàn)出了在害蟲(chóng)防治方面的潛在應(yīng)用。與鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)和類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription-activator-like effector nuclease, TALEN)相比，Crispr/Cas系統(tǒng)能夠更精確，更高效地進(jìn)行基因組編輯，并且更加便于實(shí)施?；贑rispr/Cas9系統(tǒng)的昆蟲(chóng)功能基因組學(xué)研究為害蟲(chóng)防治提供了新思路，不僅應(yīng)用于模式昆蟲(chóng)(如飛蝗、家蠶等)，在非模式昆蟲(chóng)[如蘋(píng)果蠹蛾(Cydiapomonella)等]中也得到了成功應(yīng)用。Li等(2016)使用Ⅱ型Crispr/Cas系統(tǒng)成功設(shè)計(jì)gRNA (guide RNA)的靶序列破壞編碼氣味受體共受體(Orco)的基因并檢查氣味受體途徑在東亞飛蝗(Locustamigratoria)中的作用，為蝗蟲(chóng)功能遺傳學(xué)研究和害蟲(chóng)管理產(chǎn)生功能喪失突變體提供了一種簡(jiǎn)單而有效的方法。Liu等(2017)敲除了家蠶的Orco基因，獲得了純合突變體，單感記錄顯示這種純合突變體的觸角對(duì)家蠶的2種性信息素蠶蛾醇和蠶蛾醛均沒(méi)有反應(yīng)。成蟲(chóng)的交配試驗(yàn)結(jié)果顯示，Orco突變體無(wú)法響應(yīng)野生雌蛾釋放的性信息素，交配行為明顯受損； 幼蟲(chóng)的取食試驗(yàn)結(jié)果顯示，Orco突變體表現(xiàn)出對(duì)桑葉的選擇缺陷。綜上，Orco基因的敲除嚴(yán)重破壞了家蠶的嗅覺(jué)系統(tǒng)，這項(xiàng)研究為昆蟲(chóng)嗅覺(jué)系統(tǒng)提供了新見(jiàn)解，也為農(nóng)林復(fù)合害蟲(chóng)防治提供了范例。Garczynski等(2017)發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果蠹蛾的OR1基因被靶向敲除后，突變雌性的繁殖力受到了嚴(yán)重的影響。

4 林業(yè)類害蟲(chóng)的嗅覺(jué)識(shí)別分子機(jī)制

嗅覺(jué)感受的分子機(jī)制研究將為農(nóng)林害蟲(chóng)防治提供新的線索，目前在重要農(nóng)林害蟲(chóng)中的OR鑒定和功能研究情況如表1所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，林業(yè)害蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制和OR的研究還處于起步階段，大部分還限于OR等嗅覺(jué)基因的鑒定，功能分析等深入研究則較少。以下是幾種較為重要的森林害蟲(chóng)嗅覺(jué)機(jī)制的研究情況。

4.1 鞘翅目害蟲(chóng)

白蠟窄吉丁(Agrilusplanipennis)在東北亞(中國(guó)、日本、朝鮮、蒙古)、美國(guó)、加拿大及俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)等均有分布，在國(guó)內(nèi)分布于黑龍江、吉林、遼寧、河北、北京、天津、臺(tái)灣等地(楊忠岐等， 2018)，嚴(yán)重危害我國(guó)北方重要的用材樹(shù)種水曲柳(Fraxinusmandshurica)和園林綠化樹(shù)種絨毛白蠟(Fraxinusvelutina)。2013年，Mamidala等(2013)首次對(duì)白蠟窄吉丁的觸角進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，得到了9個(gè)OBP基因、2個(gè)OR基因、1個(gè)SNMP基因和134種氣味/異生素降解酶，包括細(xì)胞色素P450、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶、酯酶等； 并通過(guò)Q-PCR揭示了這些基因在不同發(fā)育階段雌雄體內(nèi)的發(fā)育和性別偏向的表達(dá)模式。

Mitchell等(2012)對(duì)胡桃胭脂天牛(Meyacyllenecaryae)的轉(zhuǎn)錄組分析得到了57個(gè)0R基因，并利用爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對(duì)其中的3個(gè)OR基因進(jìn)行了功能測(cè)定，其中OR3對(duì)(S)-2-甲基-1-丁醇敏感，OR5對(duì)2-苯乙醇敏感，OR20對(duì)(2S，3R)-2,3-己二醇敏感。

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)是危害樹(shù)木生長(zhǎng)的蛀干害蟲(chóng)，在我國(guó)陜西、寧夏、內(nèi)蒙古、河南、山東、湖南、湖北、遼寧、吉林等地發(fā)生十分嚴(yán)重，近年來(lái)在新疆、西藏等西部偏遠(yuǎn)地方也已被發(fā)現(xiàn)，每年都造成大量的木材損失，是一種重要的林業(yè)害蟲(chóng)(楊忠岐等， 2018)。2016年，McKenna等(2016)完成了光肩星天牛的基因組測(cè)序與注釋工作，并進(jìn)行了基因表達(dá)分析，Hu等(2016)也對(duì)光肩星天牛進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，鑒定得到42個(gè)OBP基因、12個(gè)CSP基因、14個(gè)信息素降解酶(pheromone degrading enzyme, PDE)基因、1個(gè)ODE基因、37個(gè)OR基因、11個(gè)味覺(jué)受體(gustatory receptor, GR)基因、2個(gè)SNMP基因和4個(gè)離子型受體(ionotropic receptor, IR)基因，并通過(guò)CSP基因和PBP基因在觸角中的正確表達(dá)，證明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的真實(shí)性。Mitchell等(2017)在此基礎(chǔ)上，鑒定得到了120個(gè)OR基因、1個(gè)Orco基因和11個(gè)可能的OR基因。昆蟲(chóng)行使嗅覺(jué)功能時(shí)，表達(dá)OR基因的嗅覺(jué)感受神經(jīng)元(OSN)通過(guò)其軸突連接大腦觸角葉，相同OSN類型的軸突匯聚在同一個(gè)嗅覺(jué)小球中，將信號(hào)傳遞給大腦。OSN軸突的數(shù)量多少?zèng)Q定了嗅覺(jué)小球的大小，這同時(shí)又可以反映出昆蟲(chóng)接受氣味信息的多少。這項(xiàng)研究將基因組學(xué)與神經(jīng)解剖學(xué)聯(lián)系起來(lái)，對(duì)氣味受體及其配體從一個(gè)新的角度進(jìn)行了詮釋。

云杉八齒小蠹(Ipstypographus)和中歐山松大小蠹(Dendroctonusponderosae)均為重要的針葉樹(shù)害蟲(chóng)，通過(guò)聚集信息素來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)宿主的入侵行為，在此過(guò)程中嗅覺(jué)起著重要的作用。Andersson等(2013)對(duì)這2種小蠹蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，在云杉八齒小蠹中找到了15個(gè)OBP基因、6個(gè)CSP基因、3個(gè)SNMP基因、43個(gè)OR基因、6個(gè)GR基因和7個(gè)IR基因，在中歐山松大小蠹中找到了31個(gè)OBP基因、11個(gè)CSP基因、3個(gè)SNMP基因、49個(gè)OR基因、2個(gè)GR基因和15個(gè)IR基因。對(duì)這幾種蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，只有OR蛋白具有明顯的譜系特異性，這表明可能OR與感官特異性、特異生態(tài)位的適應(yīng)和化學(xué)信息素的共享等聯(lián)系更緊密。

表1 農(nóng)林類害蟲(chóng)氣味受體鑒定和功能研究情況

續(xù)表1 Continued

分類目科Classification物種Species氣味受體ORname基因表達(dá)系統(tǒng)Gene expression system參考文獻(xiàn)ReferencesHeliothis subflexa黏蟲(chóng)Mythimna separate甜菜夜蛾Spodoptera exigua斜紋夜蛾Spodoptera litura灰翅夜蛾Spodoptera littoraliOR13,15Soques et al., 2010OR6,14,15,16Vásquez et al., 2011OR6,13,14,16XoWang et al., 2011OR12XoCao et al., 2016OR13,15Soques et al., 2010OR6,14,15,16Vásquez et al., 2011OR1,3XoMitsuno et al., 200860 OR genesLiu et al., 201771 OR genesChang et al., 2017OR2張逸凡等, 2011S.exiOR6,11,13,16XoLiu et al., 2013OR18劉程程等, 2013OR3XoLiu et al., 201410 OR genesLiu et al., 201564 OR genesZhang et al., 2018OR2陳茜等, 2011OR12,19,44,51XoZhang et al., 2013OR18Zheng et al., 2014S.litOR6,11,13,16XoZhang et al., 2015OR1Zhang et al., 201726 OR genesLi et al., 2015S.litt OR6DENESMontagne et al., 201236 OR genesJacquin et al., 201247 candidate ORsXode Fouchier et al., 2017鞘翅目Coleoptera吉丁甲科Buprestidae葉甲科Chrysomelidae天?？艭erambycidae小蠹科Scolytidae白蠟窄吉丁Agrilus planipennis紫榆葉甲Ambrostoma quadriim-pressum胡桃胭脂天牛Meyacyllene caryae光肩星天牛Anoplophora glabrip-ennis云杉八齒小蠹Ips typographus中歐山松大小蠹Dendroctomus pondero-sae紅脂大小蠹Dendroctonus valens云南切梢小蠹Tomicus yunnanensisOrco and OR64Mamidala et al., 201318 OR genesWang et al., 201657 OR genesMitchell et al., 201237 OR genesHu et al., 2016132 OR genesMckenna et al., 2016132 OR genesMitchell et al., 201743 OR genesAndersson et al., 201349 OR genesAndersson et al., 201322 OR genesGu et al., 20159 OR genesLiu et al., 2018

①Xo:爪蟾卵母細(xì)胞Xenopus oocyte; HEK:HEK293細(xì)胞HEK293 cell; DENES:果蠅空神經(jīng)元系統(tǒng)Drosophila empty neuron expression system.

紅脂大小蠹(Dendroctonusvalens)對(duì)油松(Pinustabulaeformis)造成嚴(yán)重的危害，原產(chǎn)北美； Gu等(2015)對(duì)紅脂大小蠹的轉(zhuǎn)錄組分析得到了可能的21個(gè)OBP基因、6個(gè)CSP基因、4個(gè)SNMP基因、22個(gè)OR基因、4個(gè)GR基因和3個(gè)IR基因。小蠹科中，在紅脂大小蠹中鑒定得到的OR基因比云杉八齒小蠹和中歐山松大小蠹中都少，但是系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，紅脂大小蠹的嗅覺(jué)基因大部分與中歐山松大小蠹的嗅覺(jué)基因聚類。在北美，紅脂大小蠹和中歐山松大小蠹的生境相似，共享相似的宿主揮發(fā)物、信息素?fù)]發(fā)物以及非宿主揮發(fā)物，這可能解釋在系統(tǒng)發(fā)育分析中2種小蠹大部分聚類的現(xiàn)象。

云南切梢小蠹(Tomicusyunnanensis)分布于我國(guó)西南部，對(duì)松林造成了嚴(yán)重的危害。Liu等(2018)對(duì)云南切梢小蠹的3個(gè)發(fā)育階段(幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng))的化學(xué)感受基因做了差異表達(dá)分析，并找到了45個(gè)OBP基因、12個(gè)CSP基因、9個(gè)OR基因、8個(gè)GR基因和3個(gè)IR基因。

紫榆葉甲(Ambrostomaquadriimpressum)亦是一種主要的林木害蟲(chóng)，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效且環(huán)境友好的化學(xué)防治方法來(lái)控制這種害蟲(chóng)。Wang等(2016)對(duì)紫榆葉甲腿部及觸角進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，經(jīng)生物信息學(xué)分析，同源分析及后續(xù)RT-PCR和Q-PCR等試驗(yàn)，最終得到了15個(gè)OBP基因、9個(gè)CSP基因，18個(gè)OR基因、6個(gè)IR基因和2個(gè)SNMP基因。其中，AquaOBP1/2/4/7/C1/C6、AquaCSP3/9、AquaOR8/9/10/14/15/18/20/26/29/33、AquaIR8a/13/25a顯示嗅覺(jué)特異性表達(dá)，這些基因可能在紫榆葉甲的嗅覺(jué)相關(guān)行為中發(fā)揮關(guān)鍵作用；AquaOBP4/C5、AquaOBP4/C5、AquaCSP7/9/10、AquaOR17/24/32和AquaIR4在雄性觸角中表達(dá)量較高且具有特異性，表明這些基因與性別特異性行為有關(guān)。

4.2 鱗翅目害蟲(chóng)

云南松毛蟲(chóng)(Dendrolimushoui)和思茅松毛蟲(chóng)(Dendrolimuskikuchii)是2個(gè)及其相近的物種，對(duì)中國(guó)西南地區(qū)的針葉林危害嚴(yán)重，盡管鱗翅目物種的嗅覺(jué)研究工作較多，但是關(guān)于2個(gè)姐妹種的嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制還研究的很少。Zhang等(2014)對(duì)這2大食葉害蟲(chóng)做了轉(zhuǎn)錄組分析，同源比較在云南松毛蟲(chóng)中得到了23個(gè)OBP基因、17個(gè)CSP基因、2個(gè)SNMP基因、33個(gè)OR基因和10個(gè)IR基因，在思茅松毛蟲(chóng)中得到了27個(gè)OBP基因、17個(gè)CSP基因、2個(gè)SNMP基因、33個(gè)OR基因和9個(gè)IR基因，對(duì)未來(lái)的功能研究提供了依據(jù)。馬尾松毛蟲(chóng)(Dendrolimuspunctatus)也是一種危害嚴(yán)重的食葉害蟲(chóng)，其生理生態(tài)研究較多，但有關(guān)其發(fā)育的分子機(jī)制還了解的不多。Yang等(2016)對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，構(gòu)建了卵、幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)4個(gè)階段的基因表達(dá)譜。Zhang等(2017)用新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)不同發(fā)育階段和不同器官進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，共得到171個(gè)可能的化學(xué)感受基因，包括53個(gè)OBP基因、26個(gè)CSP基因、2個(gè)SNMP基因、60個(gè)OR基因、18個(gè)IR基因和12個(gè)GR基因，其中觸角中的嗅覺(jué)基因表達(dá)含量最高，其他組織中等表達(dá)，而脂肪體、中腸、卵巢和精巢組織中也發(fā)現(xiàn)了一定量的嗅覺(jué)基因的表達(dá)(Zhangetal., 2017)。隨后，Zhang等(2018)進(jìn)一步對(duì)馬尾松毛蟲(chóng)羽化、求偶、交配、交配后4個(gè)交配階段進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，得到了相關(guān)化學(xué)感受基因在其交配期間3種不同的表達(dá)模式，通過(guò)后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析、基序表達(dá)模式分析等推測(cè)了相關(guān)化學(xué)感受基因的功能； 且在之前研究中的6個(gè)OBP基因、1個(gè)CSP基因、23個(gè)OR基因、1個(gè)GR基因和8個(gè)IR基因獲得了全長(zhǎng)序列，8個(gè)OR基因、9個(gè)GR基因和5個(gè)IR基因被新鑒定。

美國(guó)白蛾(Hyphantriacunea)繁殖率高，傳播范圍廣，對(duì)我國(guó)的森林甚至農(nóng)作物造成了嚴(yán)重的危害，但關(guān)于其寄主定位及交配選擇嗅覺(jué)機(jī)制的分子基礎(chǔ)知之甚少。Zhang等(2016)對(duì)美國(guó)白蛾進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，得到了30個(gè)OBP基因、17個(gè)CSP基因、52個(gè)OR基因、14個(gè)IR基因、9個(gè)GR基因和2個(gè)SNMP基因，并通過(guò)RT-PCR和Q-PCR系統(tǒng)分析了OBP和CSP的表達(dá)模式，為更深入研究嗅覺(jué)機(jī)制提供了新的線索。

5 結(jié)語(yǔ)

有關(guān)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)分子機(jī)制的研究在近年來(lái)有新進(jìn)展，氣味受體作為昆蟲(chóng)行使嗅覺(jué)功能的一種重要的蛋白質(zhì)，是昆蟲(chóng)嗅覺(jué)研究的重點(diǎn)部分。從昆蟲(chóng)異源細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、果蠅空神經(jīng)元表達(dá)系統(tǒng)、RNAi技術(shù)，到Crispr/cas9等新型技術(shù)在氣味受體功能研究中的應(yīng)用，使人們對(duì)氣味受體功能的認(rèn)識(shí)逐漸深入。除了對(duì)一些模式昆蟲(chóng)，如家蠶、黑腹果蠅等的深入研究外，一些農(nóng)業(yè)類重要害蟲(chóng)的研究也獲得了較為廣泛的關(guān)注。

林業(yè)類害蟲(chóng)嗅覺(jué)識(shí)別分子機(jī)制的研究在近幾年逐漸展開(kāi)，目前主要集中在基因鑒定方面，功能研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā)涉及較少。未來(lái)展開(kāi)對(duì)林業(yè)害蟲(chóng)氣味受體功能的研究，可以幫助人們從分子角度深入了解昆蟲(chóng)的嗅覺(jué)識(shí)別機(jī)制，有望以此為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)效率更高的引誘劑，推出林業(yè)害蟲(chóng)防治新技術(shù)。