太平洋牡蠣胞外超氧化物歧化酶同源基因與蛋白質(zhì)分析

毛小偉, 薛清剛, 夏淇峰, 李登峰, 林志華

(1. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315010； 2. 青島海洋科學(xué)技術(shù)試點(diǎn)國家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室， 青島 266071； 3. 浙江萬里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 寧波 315100)

生長在海洋沿岸的貝類不斷受到各種理化和生物性環(huán)境因素的影響，其中，劇烈波動的溫度、鹽度、pH值、溶解氧、病原生物和各種污染物均能對貝類構(gòu)成脅迫。處于脅迫狀態(tài)下的貝類，不僅生長發(fā)育滯緩，而且由于免疫力下降，容易受致病性或條件致病性微生物感染發(fā)病，而出現(xiàn)大規(guī)模死亡[1-4]。生物在脅迫條件下體內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species, ROS)生成增加，蓄積的ROS能引起生物膜的氧化損傷，甚至造成細(xì)胞脂類、蛋白或 DNA 的嚴(yán)重破壞[5]。因此，包括金屬污染等在內(nèi)的多種環(huán)境因素可通過誘發(fā)氧化脅迫(oxidative stress)，從而對生物體造成損害[6]。

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一些廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶。根據(jù)所結(jié)合的金屬離子不同而分為 3 類——銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)，錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD)和鐵超氧化物歧化酶 (Fe-SOD)，其中，Cu/Zn-SOD依據(jù)在生物體內(nèi)的存在部位又分成胞內(nèi)(icCu/ZnSOD)和胞外(EC-SOD)兩種亞型[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Cu/Zn-SOD對于貝類免疫具有重要作用[8]，其作用機(jī)理一般認(rèn)為與參與抗氧化防御(antioxidant defense)有關(guān)。

Gonzalez 等[9]報(bào)道了太平洋牡蠣(Crassostreagigas)血漿內(nèi)的一種EC-SOD蛋白——Cg-EcSOD，認(rèn)為其具有結(jié)合脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)和 SOD 酶活性。隨后的研究中Cg-EcSOD被命名為cavortin[10-11]，但純化后沒有檢測到SOD活性[11]。Cg-EcSOD在美洲牡蠣(Crassostreavirginica)中的直系同源蛋白——dominin純化后也未檢出SOD活性[12]。這說明牡蠣中存在的EC-SOD并不具備SOD活性，不是真正意義上的SOD。Ec-SOD蛋白是牡蠣血漿內(nèi)含量比例最高的蛋白，SDS-PAGE分析顯示其dominin占美洲牡蠣血漿總蛋白的近50%[12]。顯然，牡蠣EC-SOD對于該物種有重要功能意義。既然該蛋白不能通過SOD活性發(fā)揮作用，那么其功能是什么呢？有研究顯示，純化的dominin含有多種金屬[12]。而如果牡蠣EC-SOD通過分子進(jìn)化而演變成一種金屬結(jié)合蛋白，那么它就有可能在金屬儲運(yùn)、解毒以及間接抗氧化過程中發(fā)揮作用。因此，本研究試圖通過分析探討太平洋牡蠣的EC-SOD蛋白參與金屬代謝的可能性，為認(rèn)識該蛋白的確切生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

本研究所用太平洋牡蠣殼長8～12 cm，于2017年3月和11月采自山東省桑溝灣。2017年3月采集的牡蠣用于cDNA克隆，2017年11月采集的牡蠣用于金屬刺激實(shí)驗(yàn)。牡蠣使用前置鹽度23 psu、溫度13 ℃過濾天然海水中暫養(yǎng)。血淋巴液使用配有25號針頭的注射器經(jīng)牡蠣背側(cè)緣切口刺入閉殼肌抽取。抽取的血淋巴液800 g，4 ℃離心15 min，取血淋巴細(xì)胞立即液氮冷凍，并在-80 ℃下儲存，直至提取RNA。上清液3000 g，4 ℃離心15 min，然后收集上清液作為血漿，-20 ℃保存。取血淋巴后，從每只牡蠣中取約50 mg的鰓組織，液氮快速冷凍，-80 ℃下保存直至提取RNA。

1.2 序列查找與分析

以美洲牡蠣dominin氨基酸序列(BAF30874)為查詢序列，利用tblastx程序在太平洋牡蠣(Crassosteragigas)基因組庫(Oyster_v9 Release 101)查找同源序列。將覆蓋查詢序列50%以上，E值小于1e-5，有單獨(dú)標(biāo)注基因號的氨基酸序列下載，用clustalw2軟件[13-14]與查詢序列、人胞質(zhì)SOD(p00441)和人胞外SOD(p08294)做多重比對。通過搜索NCBI的保守域數(shù)據(jù)庫(CDD)識別保守域[15-16]。根據(jù)序列數(shù)據(jù)庫中所預(yù)測的內(nèi)含子和外顯子位置，確定基因編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)。

1.3 序列驗(yàn)證

以總RNA抽提試劑盒(OMEGA)從太平洋牡蠣鰓組織和血淋巴細(xì)胞中提取總RNA，1%瓊脂糖電泳檢測其完整性，NanoVue 微量紫外分光光度計(jì)檢測濃度和純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。根據(jù)BLAST檢索到的mRNAs的序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增全長cDNA(表1)。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，膠回收試劑盒(TinGen) 割膠純化。純化后的產(chǎn)物與T1(TransGen)載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌 DHα(TaKaRa)中進(jìn)行克隆，挑取陽性克隆測序。

表1 Cg-dominin克隆、重組表達(dá)以及熒光定量分析所用引物

1.4 Cg-dominin2重組蛋白的制備和抗氧化活性測定

設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，使用PromegaTaq酶擴(kuò)增Cg-dominin2成熟肽的cDNA片段，正向引物Cg-FM帶有BamH I限制性酶切位點(diǎn)，反向引物Cg-RM帶有XhoI酶切位點(diǎn)。將純化后PCR產(chǎn)物克隆到pEASY-T1載體(TransGen)中，提取質(zhì)粒并用限制性酶BamH I和XhoI消化，克隆到同樣用BamH I和XhoI消化的表達(dá)載體pET-28a。將重組質(zhì)粒pET-28a-Cg-dominin2轉(zhuǎn)化到表達(dá)感受態(tài)BL21中(DE3)。篩選陽性克隆，使用引物Cg-FM和Cg-RM擴(kuò)增測序進(jìn)一步驗(yàn)證，選擇無插入片段的pET-28a載體作為陰性對照。陽性克隆和陰性對照加入到LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中，37 ℃，以200 r/min，振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)液OD600達(dá)到0.4～0.6時，加入IPTG至終濃度0.8 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)12 h。采用鎳柱層析法純化重組蛋白Cg-dominin2，在分別含有6、4、3、2、1和0 mol/L尿素的緩沖液(50 mmol/L 三氨基甲烷、50 mmol/L氯化鈉、10%甘油、2 mmol/L還原谷胱甘肽和0.2 mmol/L氧化谷胱甘肽，pH 8.0)中，4 ℃，12 h，透析復(fù)性。復(fù)性純化的蛋白質(zhì)以10% 凝膠SDS-PAGE電泳分析，BCA法測定純化后的rCg-Dominin2濃度[17]，并質(zhì)譜測序鑒定。純化的重組蛋白質(zhì)活性分析前保存于-80 ℃。rCg-dominin2總抗氧化能力利用總抗氧化測定試劑盒(南京建成)測定。

1.5 金屬刺激實(shí)驗(yàn)

金屬刺激實(shí)驗(yàn)通過在23 鹽度海水中加入氯化鋅和氯化鎘進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中參照相應(yīng)金屬離子對褶牡蠣的半致死濃度[18]，分別選擇2個濃度ZnCl2(60和100 mg/L)和2個濃度的CdCl2(6和10 mg/L)。取350只牡蠣，隨機(jī)分為4個實(shí)驗(yàn)組，每組75只和1個50只的對照組。處理后0、3、6、12、24、48和72 h后，分別從每個實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取10只牡蠣，從對照組取5只牡蠣，如前述過程分別取樣血淋巴液和鰓組織。

1.6 Cg-dominin2基因表達(dá)實(shí)時熒光定量 PCR 檢測

按照總RNA抽提試劑盒(OMEGA)方法提取 Zn2+和 Cd2+脅迫下太平洋牡蠣血淋巴細(xì)胞和鰓(n=3)的總RNA，由于3個Cg-dominin的mRNA序列高度相似，使得在PCR分析中通過設(shè)計(jì)引物來區(qū)分難以實(shí)現(xiàn)，在本研究中僅測定了Cg-dominin2。根據(jù)Cg-dominin2測序結(jié)果設(shè)計(jì)熒光定量 PCR 引物，采用qRT-PCR法，以太平洋牡蠣β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)的總體積為20 μL，包含SYBR Green Mix (Bio-rad)10 μL，1∶100稀釋的cDNA 2 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL和ddH2O 6 μL。用ABI7500fast熒光定量PCR儀兩步法進(jìn)行擴(kuò)增，即95 ℃預(yù)變性1 min； 95 ℃變性10 s，59.6 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，從55 ℃緩慢升溫到95 ℃，制備熔解曲線。每次反應(yīng)都設(shè)置陰性對照和無模板對照，每個反應(yīng)3個重復(fù)孔。Cg-dominin2的相對表達(dá)量用最小二乘法2-ΔΔCt法計(jì)算[19]，并利用 SPSS 13.0 軟件進(jìn)行雙因素方差分析和Tukey檢驗(yàn)。

1.7 血漿沉淀蛋白中金屬含量的測定

采用PEG沉淀法制備了牡蠣主要血漿沉淀蛋白質(zhì)。為了選擇合適的PEG濃度，將牡蠣血漿在4 ℃下分別與7.5%、10%、12.5%、15%和17.5%的PEG6000水溶液1∶1混合15 min后4 ℃離心20 min，然后BCA測定法測定上清液蛋白質(zhì)濃度，并以此建立不同PEG6000濃度沉淀后，上清液中剩余濃度曲線。最后基于建立的曲線，選擇導(dǎo)致上清液中殘留蛋白濃度達(dá)最低值的最小PEG濃度制備用于金屬含量測定的沉淀血漿蛋白。以最終選擇的PEG6000溶液按上述過程處理牡蠣血漿樣品。離心后，去上清液，將沉淀的蛋白質(zhì)以去離子水溶解并測定蛋白濃度。最后采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測定樣品鋅和鎘的含量(西安204軍工研究所)。測定結(jié)果以單因素方差分析(ANOVA)和Tukey檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cg-dominin基因、轉(zhuǎn)錄物和氨基酸序列分析

利用美洲牡蠣dominin序列，在太平洋牡蠣基因組數(shù)據(jù)庫(Oyster_v9參考注釋101版)檢索，在不同的基因片段發(fā)現(xiàn)有5個潛在的dominin同源基因，其中3個在負(fù)鏈上，2個在正鏈上(表2)。其中3個外顯子個數(shù)和大小高度一致的基因所編碼的氨基酸序列，彼此之間序列一致性為92.2%～94.8%，與美洲牡蠣dominin的序列長度一致而且計(jì)算序列一致性達(dá)87.5%～88.5%，因此分別被命名為Cg-dominin1、Cg-dominin2和Cg-dominin3。其余的2個潛在基因(Cg-Cu/ZnSOD?1和Cg-Cu/ZnSOD?2)在外顯子數(shù)目和大小、編碼的氨基酸序列總長度上彼此之間及與前述3個序列之間差別明顯，與美洲牡蠣dominin的序列一致性為52.6%～61.9%(圖1)。多序列比對分析顯示，Cg-dominin1、Cg-dominin2和Cg-dominin3均有一個18個氨基酸的信號肽，而Cg-Cu/ZnSOD?1和Cg-Cu/ZnSOD?2沒有。同時，與dominin、人胞質(zhì)SOD和人胞外SOD的氨基酸序列比對顯示，5個太平洋牡蠣基因組內(nèi)鑒定到的潛在基因和美洲牡蠣的dominin一樣，均缺少SOD酶活性中心內(nèi)7個結(jié)合Cu和Zn離子的氨基酸殘基(圖2)。因此，Cg-dominin1、Cg-dominin2和Cg-dominin3被確定為太平洋牡蠣dominin直系同源的Ec-SOD編碼基因。PCR擴(kuò)增測序獲得了與3個基因相對應(yīng)的mRNA序列長度分別為775 bp、679 bp和724 bp，3者均預(yù)測出含有一個576 bp開放閱讀框，編碼192個氨基酸，與基因組序列基礎(chǔ)上預(yù)測的相應(yīng)mRNA序列一致。

表2 太平洋牡蠣基因組中dominin的同源蛋白基因

方塊、線條、數(shù)字分別代表外顯子、內(nèi)含子以及它們的序列長度(bp)；對于每一個基因，左邊標(biāo)注了基因名稱以及在本文中的命名，右邊標(biāo)注其所在的基因組名稱

圖1以美洲牡蠣dominin為檢索序列，在太平洋牡蠣基因組序列中識別得到的基因結(jié)構(gòu)示意圖

Figure 1 Schematic diagram of the genes identified from the Pacific oyster genome sequence usingCrassostreavirginicadominin as query

陰影部分為人體CuZnSODs對應(yīng)酶活中心的序列中結(jié)合Cu和Zn的7個氨基酸殘基

圖2太平洋牡蠣基因組中潛在的dominin同源序列與查詢序列、人胞質(zhì)SOD(p00441)和人胞外SOD(p08294)的多重比對

Figure 2 Alignment of amino acid sequences of potential dominin homologues identified inCrassostreagigasgenome with query and 2 human CuZnSODs, cytoplasmic SOD (HuCySOD, P00441) and extracellular SOD (HuEcSOD, P08294)

2.2 Cg-dominin2基因體外重組表達(dá)和活性測定

構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，通過10% SDS-PAGE分析全細(xì)胞裂解產(chǎn)物，考馬斯亮藍(lán)染色，發(fā)現(xiàn)一條分子量35 ku的明顯條帶，通過質(zhì)譜測序驗(yàn)證確定為Cg-dominin2重組蛋白，經(jīng)鎳柱親和層析法純化得到目的蛋白(圖3)。純化的Cg-dominin2重組蛋白的總抗氧化活性為每克蛋白質(zhì)相當(dāng)于0.0525 mmol/L Trolox。

M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)； 1：未經(jīng) IPTG 誘導(dǎo)的菌株； 2：IPTG 誘導(dǎo)的菌株； 3：pET-28a空載體； 4：純化后的Cg-dominin2重組蛋白

圖3SDS-PAGE檢測Cg-dominin2重組蛋白

Figure 3 Detection of Cg-dominin2 recombinant protein by SDS-PAGE

2.3 鋅和鎘脅迫下的Cg-dominin2基因表達(dá)

60和100 mg/L ZnCl2刺激后，太平洋牡蠣血淋巴細(xì)胞和鰓中Cg-dominin2基因表達(dá)均顯示為先升后降(圖4-A、B)。血淋巴細(xì)胞中2個刺激濃度對應(yīng)的表達(dá)高峰分別出現(xiàn)在刺激后48 h和12 h，相應(yīng)表達(dá)水平分別為對照組的4.8倍和3.7倍，差別有高度顯著性(P<0.01)。而鰓中的對應(yīng)表達(dá)高峰分別出現(xiàn)在刺激后24 h和12 h，其中，60 mg/L的ZnCl2刺激下的最高表達(dá)水平是對照組的2.1倍，差別有顯著性(P<0.05)。

A和B分別為在ZnCl2脅迫下，Cg-dominin2基因在血淋巴細(xì)胞(A)和鰓(B)中的相對表達(dá)量; C和D分別為在CdCl2脅迫下，Cg-dominin2基因在血淋巴細(xì)胞(C)和鰓(D)中的相對表達(dá)量?！?”表示差異顯著，“**”表示差異極顯著。下同

圖4在ZnCl2和CdCl2脅迫下，太平洋牡蠣血淋巴細(xì)胞和鰓中Cg-dominin2基因表達(dá)分析
Figure 4 The expression levels ofCg-dominin2 in hemocytes and gills ofCrassostreagigasfollowing challenges by ZnCl2and CdCl2

6和10 mg/L CdCl2刺激后，太平洋牡蠣血淋巴細(xì)胞和鰓中Cg-dominin2基因表達(dá)也顯示先升后降的趨勢(圖4-C、D)。血淋巴細(xì)胞中2個刺激濃度對應(yīng)的表達(dá)高峰分別出現(xiàn)在刺激后12 h和48 h，相應(yīng)表達(dá)水平分別為對照組的4.4倍和2.2倍，差別均有高度顯著性(P<0.01)。而鰓中的對應(yīng)表達(dá)高峰分別出現(xiàn)在刺激后24 h和48 h，相應(yīng)表達(dá)水平為對照組的2.7倍和4.2倍，差別均有高度顯著性(P<0.01)。

2.4 金屬刺激后太平洋牡蠣血漿沉淀蛋白質(zhì)中相應(yīng)金屬含量

ZnCl2刺激后，太平洋牡蠣血漿沉淀蛋白質(zhì)中的Zn含量相對于對照組含量均顯著升高(P<0.01)，但2個刺激濃度之間及不同取樣時間點(diǎn)之間的含量水平未發(fā)現(xiàn)顯著差異(圖5-A)。

CdCl2刺激后血漿沉淀蛋白中Cd含量在2個刺激濃度間顯示出差別(圖5-B)。6 mg/L CdCl2刺激下，沉淀蛋白中Cd含量水平在刺激后72 h開始升高，并與對照組有顯著性差別(P<0.05)。而在10 mg/L CdCl2刺激下，血漿沉淀蛋白中的Cd含量顯著升高，并與對照組和6 mg/L刺激組有高度顯著性差別(P<0.01)，但3個取樣時間點(diǎn)之間未發(fā)現(xiàn)顯著性差別。

A為ZnCl2脅迫下太平洋牡蠣血漿沉淀蛋白質(zhì)中鋅含量; B為CdCl2脅迫下太平洋牡蠣血漿沉淀蛋白質(zhì)中鎘含量

圖5在ZnCl2和CdCl2脅迫下太平洋牡蠣血漿沉淀蛋白質(zhì)中對應(yīng)金屬含量
Figure 5 Zinc and cadmium contents in the plasma protein inCrassostreagigaschallenged respectively by ZnCl2and CdCl2

3 討論

美洲牡蠣的dominin與文獻(xiàn)報(bào)道的太平洋牡蠣Cg-EcSOD/cavortin屬序列相似度極高的直系同源蛋白，屬Ec-SOD家族蛋白[12]。通過全基因組序列分析，在太平洋牡蠣基因組內(nèi)鑒定出5個與dominin序列相似性有顯著意義的基因。其中3個與dominin序列長度一致且氨基酸序列一致性超過80%，說明它們與dominin有顯著同源性，均是太平洋牡蠣Ec-SOD蛋白的編碼基因。而另外兩個序列與dominin顯著不同，不僅長度短，而且沒有信號肽。迄今為止絕大多數(shù)動物基因組中只有1～2個Ec-SOD基因，有些物種甚至沒有。而太平洋牡蠣有彼此序列相似度超過90%的3個基因。這一方面可以解釋為什么dominin相關(guān)蛋白質(zhì)構(gòu)成血漿總蛋白的近50%[12]，另一方面提示這些蛋白質(zhì)對于牡蠣物種生存有重要意義。

多項(xiàng)研究已經(jīng)證明dominin相關(guān)蛋白沒有SOD酶活性。Scotti等報(bào)道，太平洋牡蠣血漿中的cavortin盡管含有SOD結(jié)構(gòu)域，但是不具備SOD活性[11]。同樣，美洲牡蠣的dominin也有SOD結(jié)構(gòu)域，但沒有SOD活性[12]。具備類似特征的蛋白質(zhì)還包括悉尼石牡蠣中的SgEcSOD[20]和新西蘭綠唇蚌中的Pernin[21]。而這些蛋白質(zhì)共有的一個結(jié)構(gòu)特征是對應(yīng)酶活性中心的結(jié)構(gòu)域內(nèi)缺少結(jié)合催化離子Cu2+和穩(wěn)定局部結(jié)構(gòu)的Zn2+。這與本研究所發(fā)現(xiàn)的3個太平洋牡蠣同源分子一致。那么，這些蛋白質(zhì)是否有基于其他作用原理的抗氧化活性呢？我們測得太平洋牡蠣重組Cg-dominin2蛋白總抗氧化活性為每克重組蛋白相當(dāng)于0.0525 mmol/L Trolox，抗氧化能力顯然太弱，似乎不可能通過直接抗氧化活性在抵御環(huán)境脅迫中發(fā)揮作用。

鋅是生物體中最重要的微量元素之一，對微生物、植物和動物的生長發(fā)育至關(guān)重要。然而，高濃度鋅有潛在細(xì)胞毒性，大多數(shù)細(xì)胞必須將鋅含量保持在穩(wěn)定的水平[22]。而鎘是常見的污染重金屬，對于雙殼貝類，鎘離子能夠鈣通道穿過細(xì)胞膜，干擾細(xì)胞內(nèi)各種代謝過程、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)合成和DNA修復(fù)機(jī)制等[23-26]。有研究表明，CuZn-SOD是細(xì)胞針對鋅離子脅迫做出反應(yīng)的主要蛋白質(zhì)之一，推測其金屬結(jié)合能力與消除鋅的毒性作用有關(guān)[27]。為了揭示太平洋牡蠣Cg-dominin基因參與太平洋牡蠣金屬代謝的作用機(jī)制，本文檢測了血淋巴細(xì)胞和鰓中Cg-dominin2基因在受到Cd和Zn金屬刺激后的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種組織中Cg-dominin2基因的表達(dá)量均有顯著性上升，然后逐漸下降，顯然Cg-dominin2基因參與了太平洋牡蠣對Cd和Zn的解毒作用。而且這種表達(dá)水平變化與金屬濃度相關(guān)，變化模式與涉及的金屬離子也有關(guān)。對于Zn，高濃度比低濃度更快地刺激Cg-dominin2基因表達(dá)；而對于Cd，低濃度誘導(dǎo)作用更顯著。后者可能與過高濃度的Cd離子抑制細(xì)胞總體活性有關(guān)。除基因表達(dá)增加外，Zn和Cd刺激后的牡蠣血漿蛋白內(nèi)相應(yīng)金屬含量也增加。純化的cavortin和dominin均發(fā)現(xiàn)攜帶多種金屬離子[11-12]。本研究中PEG沉淀的牡蠣血漿蛋白也出現(xiàn)了大小相對均勻的蛋白顆粒(結(jié)果另外報(bào)道)，那么可以推測，本研究所觀察的Zn和Cd離子刺激后牡蠣血漿蛋白中增加的相應(yīng)金屬至少部分結(jié)合到了Ec-SOD相關(guān)蛋白質(zhì)上，參與了金屬轉(zhuǎn)運(yùn)和解毒。而這種金屬解毒功能有可能起到間接抗氧化作用。當(dāng)然，這些推測有待于今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。