基于VEGF/VEGFR-2信號通路探討穿山龍總皂苷促進(jìn)去勢大鼠骨折血管形成和骨折愈合的效果?

安曉暉 劉 恩 呂 飛 馮志偉

（冀中能源峰峰集團(tuán)總醫(yī)院，河北 邯鄲 056200）

絕經(jīng)后骨折是一種常見的絕經(jīng)后疾病，顯著影響患者的生活質(zhì)量。有研究報(bào)道，在絕經(jīng)后早期骨缺失迅速發(fā)生，但這一過程在絕經(jīng)后第6年逐漸消失，這可能是絕經(jīng)后雌激素減少所致[1-2]。雌激素、甲狀旁腺激素（PTH）和雙膦酸鹽目前用于預(yù)防絕經(jīng)后骨折[3-4]。然而，研究證實(shí)，長期使用這些藥物可帶來一系列副作用，包括子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)較高、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、頜骨壞死和靜脈血栓栓塞。因此迫切需要一種安全、有效的替代方法或藥物來治療絕經(jīng)后骨折。近幾十年來，某些中藥已被廣泛認(rèn)為是緩解或治療骨損失的有效藥物。穿山龍總皂苷具有多種生物和藥理作用，可用于促進(jìn)骨骼和牙齒強(qiáng)度。研究表明，穿山龍總皂苷可通過調(diào)節(jié)p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和Wnt信號通路對卵巢切除術(shù)大鼠維持牙槽骨發(fā)揮保護(hù)作用[5-6]。穿山龍總皂苷具有抗氧化和抗炎特性，具有抗細(xì)胞凋亡作用。研究證明，穿山龍總皂苷可促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，甚至可有效逆轉(zhuǎn)卵巢切除引起的骨質(zhì)疏松癥[7]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）/血管內(nèi)皮生長因子受體-2（VEGFR-2）信號通路是血管形成和骨骼愈合的主要信號調(diào)控通路[8-9]。本研究擬基于VEGF/VEGFR-2信號通路探討穿山龍總皂苷促進(jìn)去勢大鼠骨折血管形成和骨折愈合的效果，為絕經(jīng)后骨折的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雌性大鼠50只，體質(zhì)量220～240 g，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，喂養(yǎng)環(huán)境為：溫度24～26℃，濕度55%～65%。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（渝）2018-0008，動(dòng)物質(zhì)量合格證號：2018003746。

1.2 試藥與儀器 穿山龍總皂苷（美國賽默飛世，AS59845）；地塞米松、EasyPure RNA試劑盒、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）（美國Sigma公司，批號47844、47895、98766）；qRT-PCR SuperMix試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司，批號AM-3357）；抗VEGF抗體、抗VEGFR-2抗體（美國Abcam公司，批號ab95462、ab73400）；生物素綴合的山羊抗兔Ig抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號PV-6000）；ED-098型雙能X線掃描儀（美國Hologic公司）；DM750型顯微鏡（德國萊卡公司）；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國伯樂公司）。

1.3 分組與造模 大鼠隨機(jī)分為骨折對照組、模型組、地塞米松組（10 mg/kg，預(yù)實(shí)驗(yàn)求出地塞米松的LC50為20.0 mg/kg，以1/2 LC50為作用劑量）、穿山龍總皂苷低劑量組（20 mg/kg，預(yù)實(shí)驗(yàn)求出穿山龍總皂苷的LC50為80.0 mg/kg，以1/4 LC50為低劑量）、穿山龍總皂苷高劑量組（40 mg/kg，預(yù)實(shí)驗(yàn)求出穿山龍總皂苷的LC50為80.0 mg/kg，以1/2 LC50為高劑量）。模型組、地塞米松組、穿山龍總皂苷低、高劑量組經(jīng)戊巴比妥鈉（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒后取雙側(cè)背側(cè)切口，切除雙側(cè)卵巢，建立去勢模型。術(shù)后4周建立股骨的簡單橫向閉合性骨折，簡而言之，在術(shù)前肌內(nèi)注射青霉素（150 IU/kg）后，在全身麻醉和無菌條件下進(jìn)行手術(shù)，在右膝側(cè)面切開切口以暴露股骨遠(yuǎn)端的關(guān)節(jié)面，將10號（10 mm）針插入髓管中用于固定，通過壓平尖端和遠(yuǎn)端來實(shí)現(xiàn)旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定性，然后閉合切口，使用鈍性創(chuàng)傷產(chǎn)生骨折，閉合傷口后，在三點(diǎn)彎曲機(jī)構(gòu)上產(chǎn)生500 g質(zhì)量的中間骨干骨折，質(zhì)量的下落高度為30 cm，骨折采用放射學(xué)記錄，確認(rèn)骨折狀態(tài)。骨折對照組如前所述，只建立股骨的簡單橫向閉合性骨折。建模成功后，地塞米松組（10 mg/kg）、穿山龍總皂苷低劑量組（20 mg/kg）、穿山龍總皂苷高劑量組（40 mg/kg）給予相應(yīng)藥物灌胃，模型組、骨折對照組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液，每日1次，持續(xù)時(shí)間為4周。

1.4 標(biāo)本采集與檢測 股骨折后骨痂處骨密度、血管數(shù)量測定：ED-098型雙能X線掃描儀對股骨折后骨痂處骨密度進(jìn)行測定；每張切片在高倍鏡下任選10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)血管數(shù)量水平。股骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2基因水平測定：EasyPure RNA試劑盒提取骨總RNA，TransScript Green一步法qRT-PCR SuperMix試劑盒用于檢測RNA測試基因相對表達(dá)水平。在20 μL反應(yīng)體系中加入1 μL模板 RNA，0.2 μmol/L正向和 0.2 μmol/L反向引物，10 μL 2XTransStart提示綠色qPCR SuperMix，0.4 μL一步RT酶混合物，0.4 μL無源參比染料Ⅱ和無RNase水。qRT-PCR條件為：45℃5 min，95℃30 s，然后40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包含94℃5 s和60℃30 s。ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀用于測量基因表達(dá)。引物序列為如下。VEGF PF：5′-GGACAGGACGCACAGTCA-3′，VEGF PR：5′-CA GACGAGGCTCCGTGGT-3′。VEGFR-2 PF：5′-TGGT CGCCATCAAGAAAGTATTG-3′。 VEGFR-2 PR：5′-GCGTCTGTTTGGCTCGACTAT-3′。U6 PF：5′-ATTGG AACGATACAGAGAAGATT-3′。U6 PR：5′-GGAACG CTTCACGAATTTG-3′。股骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2蛋白水平測定：用抗VEGF抗體和抗VEGFR-2抗體分別稀釋至1∶200評估股骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)。根據(jù)制造商建議的方案進(jìn)行免疫組織化學(xué)方案，通過將切片與胰酶在37℃溫育30 min來回收抗原，將切片與一抗在4℃溫育過夜，沒有第一抗體孵育的載玻片用作陰性對照，用3%H2O2阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性，并將切片在Tris緩沖鹽水（pH7.6）中洗滌，用Tris緩沖鹽水沖洗15 min后，應(yīng)用生物素綴合的山羊抗兔Ig抗體作為二抗，通過應(yīng)用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，切片用Mayer′s蘇木精復(fù)染，并在分級乙醇和二甲苯系列中脫水，使用顯微鏡（×200）在來自骨折部位的3個(gè)隨機(jī)選擇的光學(xué)區(qū)域中檢查軟骨組織中陽性細(xì)胞的百分比。所有評估均以盲法進(jìn)行，為了定量免疫反應(yīng)性，細(xì)胞質(zhì)中的黃褐色顆粒代表陽性細(xì)胞。免疫組化評分（IHS）定義為陽性細(xì)胞百分比和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度如下：陽性細(xì)胞百分比（無陽性細(xì)胞=0，1-10%陽性細(xì)胞=1，11-50%=2，51-80%=3，81-100%=4）乘以陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度（陰性=0，弱陽性=1，中度陽性=2，強(qiáng)正=3）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS23.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行錄入、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以（）表示，采用單因素方差分析比較，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠骨折后骨痂處骨密度、血管數(shù)量的比較 見表1。與骨折對照組比較，模型組骨折后骨痂處骨密度、血管數(shù)量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、穿山龍總皂苷低劑量組、穿山龍總皂苷高劑量組骨密度、血管數(shù)量明顯升高（P＜0.05），且穿山龍總皂苷高劑量組骨密度、血管數(shù)量高于穿山龍總皂苷低劑量組（P＜0.05）；與地塞米松組比較，穿山龍總皂苷低劑量組骨密度、血管數(shù)量明顯降低（P＜0.05），穿山龍總皂苷高劑量組骨密度、血管數(shù)量無明顯變化（P＞0.05）。

表1 各組大鼠骨折后骨痂處骨密度、血管數(shù)量的比較（±s）

表1 各組大鼠骨折后骨痂處骨密度、血管數(shù)量的比較（±s）

與骨折對照組比較，?P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與地塞米松組比較，#P＜0.05；與穿山龍總皂苷低劑量組比較，◇P＜0.05。下同

組別骨折對照組模型組地塞米松組穿山龍總皂苷低劑量組穿山龍總皂苷高劑量組n 10 10 10 10 10骨密度（mg/cm2）165.45±16.13 113.65±13.97*142.32±19.63△126.36±15.99△#142.69±16.34△◇血管數(shù)量（條）45.63±25.99 10.36±8.66**35.96±11.21△18.63±13.65△#36.96±16.54△◇

2.2 各組大鼠骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平比較 見表2。與骨折對照組比較，模型組骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、穿山龍總皂苷低劑量組、穿山龍總皂苷高劑量組VEGF、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），且穿山龍總皂苷高劑量組VEGF、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平高于穿山龍總皂苷低劑量組（P＜0.05）；與地塞米松組比較，穿山龍總皂苷低劑量組VEGF、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），穿山龍總皂苷高劑量組VEGF、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）。

表2 各組大鼠骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組大鼠骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平比較（±s）

組別骨折對照組模型組地塞米松組穿山龍總皂苷低劑量組穿山龍總皂苷高劑量組n 10 10 10 10 10 VEGF mRNA 6.56±0.24 0.96±0.26*5.19±0.25△2.29±0.29△#5.16±0.28△◇VEGFR-2 mRNA 5.98±0.25 0.87±0.19*4.69±0.54△2.55±0.53△#4.71±0.35△◇

2.3 各組大鼠骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2 蛋白表達(dá)水平比較 見表3，圖1，圖2。與骨折對照組比較，模型組骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，地塞米松組、穿山龍總皂苷低、高劑量組VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05），且穿山龍總皂苷高劑量組VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)水平高于穿山龍總皂苷低劑量組（P＜0.05）；與地塞米松組比較，穿山龍總皂苷低劑量組VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），穿山龍總皂苷高劑量組VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)水平無明顯變化（P＜0.05）。

表3 各組大鼠骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2蛋白表達(dá)水平比較（±s）

組別骨折對照組模型組地塞米松組穿山龍總皂苷低劑量組穿山龍總皂苷高劑量組n 10 10 10 10 10 VEGF 9.67±0.56 2.36±0.65*6.55±0.59△4.96±0.72△#6.60±0.61△◇VEGFR-2 8.55±0.54 2.95±0.59*6.24±0.58△4.36±0.53△#6.32±0.59△◇

3 討論

圖1 各組大鼠骨折后骨痂處VEGF蛋白表達(dá)水平比較（DAB染色，200倍）

圖2 各組大鼠骨折后骨痂處VEGFR-2蛋白表達(dá)水平比較（DAB染色，200倍）

穿山龍總皂苷具有多種藥理作用，已被證明可以增加骨形態(tài)成形蛋白-2（BMP-2）的表達(dá)，誘導(dǎo)骨形成，并抑制骨吸收[10]。研究證實(shí)，在糖尿病大鼠模型中，穿山龍總皂苷介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子-c（VEGF-c），IFG-1和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）合成改善毛細(xì)血管密度，增強(qiáng)血管生成，從而增加大鼠模型中糖尿病足潰瘍的傷口破裂強(qiáng)度[11-12]。本研究首次從血管新生的角度研究了穿山龍總皂苷對去勢大鼠骨折的作用和機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，與骨折對照組比較，模型組骨折后骨痂處骨密度、血管數(shù)量明顯降低；與模型組比較，地塞米松組、穿山龍總皂苷低劑量組、高劑量組骨密度、血管數(shù)量明顯升高，且穿山龍總皂苷高劑量組骨密度、血管數(shù)量高于穿山龍總皂苷低劑量組；與地塞米松組比較，穿山龍總皂苷低劑量組骨密度、血管數(shù)量明顯降低，穿山龍總皂苷高劑量組骨密度、血管數(shù)量無明顯變化。這說明穿山龍總皂苷可以誘導(dǎo)更多的新血管形成，加速骨愈合。

雌激素和營養(yǎng)缺乏和骨質(zhì)疏松癥及骨折密切相關(guān)。老年婦女中發(fā)生骨質(zhì)疏松癥的主要原因是這類人群缺乏雌激素和血液供應(yīng)減少。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)生骨質(zhì)疏松癥時(shí)，毛細(xì)血管和血竇的數(shù)量會(huì)減少。而在血管生成中起關(guān)鍵作用的VEGF在卵巢切除大鼠的骨中水平明顯降低。因此，增加VEGF水平可促進(jìn)血管生成，增加骨量和治療骨質(zhì)疏松癥[13-14]。由于骨折末端的局部脈管系統(tǒng)破裂導(dǎo)致血腫形成，形成相對區(qū)域性的缺氧微環(huán)境。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）是調(diào)節(jié)細(xì)胞對缺氧反應(yīng)的重要因子。研究證實(shí)HIF-1α在骨愈合過程中表達(dá)，表明激活HIF-1α信號通路可誘導(dǎo)VEGF介導(dǎo)的反應(yīng)可以加速骨愈合。VEGF/VEGFR-2信號通路對血管生成和骨折愈合至關(guān)重要，研究報(bào)道通過VEGF拮抗劑和可溶性VEGFR抑制VEGF活性導(dǎo)致小鼠股骨骨折和皮質(zhì)骨缺損的愈合受損，VEGF的局部給藥可以改善兩種模型中的骨修復(fù)[15-16]。VEGFR-2可以與雌激素受體結(jié)合，促進(jìn)VEGF的表達(dá)，VEGF是促進(jìn)血管生成的關(guān)鍵因子，從而改善基質(zhì)中的增殖和黏附[17-18]。本次研究結(jié)果顯示，與骨折對照組比較，模型組骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA、蛋白表達(dá)水平明顯降低；與模型組比較，地塞米松組、穿山龍總皂苷低劑量組、穿山龍總皂苷高劑量組骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA、蛋白表達(dá)水平明顯升高，且穿山龍總皂苷高劑量組骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA、蛋白表達(dá)水平高于穿山龍總皂苷低劑量組；與地塞米松組比較，穿山龍總皂苷低劑量組骨折后骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，穿山龍總皂苷高劑量組VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表達(dá)無明顯變化。這與上述討論一致，同時(shí)說明，穿山龍總皂苷可促進(jìn)去勢大鼠骨折骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而激活VEGF/VEGFR-2信號通路。

綜上所述，穿山龍總皂苷可促進(jìn)去勢大鼠骨折血管形成和骨折愈合，其機(jī)制與穿山龍總皂苷可促進(jìn)去勢大鼠骨折骨痂處VEGF、VEGFR-2 mRNA、蛋白表達(dá)水平，進(jìn)而激活VEGF/VEGFR-2信號通路有關(guān)。