基于網(wǎng)絡藥理學探討燈盞細辛治療冠心病的作用機制?

賴 櫞 鄭 雪 魯衛(wèi)星

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。–HD）簡稱冠心病，是冠狀動脈粥樣硬化引起血管阻塞、狹窄，使心肌細胞缺血缺氧或壞死引起的心臟病[1]。冠心病發(fā)病與動脈粥樣硬化緊密相關(guān)，其機制主要集中在炎癥反應和脂質(zhì)浸潤這兩類學說上。

冠心病屬中醫(yī)學“胸痹”“真心痛”范疇，運用中醫(yī)藥治療療效頗佳。其中燈盞細辛作為西南部地區(qū)少數(shù)民族的常用草本藥，具有活血通絡止痛、祛風散寒的功效[2]，可用于治療因血瘀所致的各種疼痛不適。近年來，臨床上將燈盞細辛注射液用于治療心腦血管病的報道屢見不鮮。有研究表明，燈盞細辛所含的成分對神經(jīng)、心腦血管等靶器官具有明顯的保護作用，但其藥效物質(zhì)基礎和作用機制仍不明確。本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法，對燈盞細辛進行靶點、通路復雜的網(wǎng)絡關(guān)系研究，嘗試從多靶點、多通路角度說明燈盞細辛治療冠心病的可能機制?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 燈盞細辛化學成分收集與靶點篩選 通過運用西北農(nóng)林科技大學自主研發(fā)的中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺 TCMSP（http：//tcmspw.com/index.php），在該平臺中以“燈盞細辛”為關(guān)鍵詞進行初步檢索，得到燈盞細辛所有化學成分。在檢索結(jié)果中設置口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為篩選參數(shù)，進一步檢索燈盞細辛的化學成分。然后利用TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺，對上述結(jié)果進行系統(tǒng)搜索匹配，得到燈盞細辛有效成分的蛋白靶點。

1.2 疾病相關(guān)靶點篩選 以冠心病英文名稱“coronary disease”作為關(guān)鍵詞，在Genecards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org）中檢索與冠心病相關(guān)的靶點。

1.3 網(wǎng)絡模型構(gòu)建 將“1.1”及“1.2”中所得到的靶點導入Cytoscape3.6.1軟件進行燈盞細辛有效成分和冠心病靶點之間的網(wǎng)絡圖構(gòu)建。并將上述獲得的燈盞細辛有效成分靶點和冠心病疾病靶點上傳至在線韋恩圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/），得到燈盞細辛與冠心病的交集靶點，再利用STRING10.5數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org）得到交集靶點相互作用關(guān)系網(wǎng)絡圖（PPI）。

1.4 富集分析 通過DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov）將上述得到治療冠心病的靶點導入其中，設置閾值P＜0.05，對靶點生物過程（BP）、細胞組分（CC）、分子功能（MF）進行GO富集分析和KEGG代謝通路富集分析，并采用線上繪圖工具Omic Share Tool（https：//www.omicshare.com/tools/index.php/）將富集結(jié)果可視化，以進一步說明燈盞細辛治療冠心病的作用機制。

2 結(jié) 果

2.1 化學成分及其作用靶點分析 以“燈盞細辛”為關(guān)鍵字檢索到燈盞細辛的化學成分共49個，設置篩選參數(shù)OB≥30%，DL≥0.18后，得到燈盞細辛主要活性成分12個，剔除無對應靶點的1個成分，共獲得11個潛在有效成分。見表1。再次把燈盞細辛有效成分帶入TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索，得到有效成分相關(guān)的靶點331個。在Pharm Mapper中剔除所有重復的靶點，最后整理得到燈盞細辛有效靶點184個。在Gene cards數(shù)據(jù)庫中，以“coronary disease”為關(guān)鍵詞，檢索出冠心病相關(guān)靶點6 704個。

將燈盞細辛184個靶點與冠心病疾病靶點上傳至在線韋恩圖，得到兩者的交集靶點共155個，韋恩圖詳見圖1。交集靶點分別為：PTGS1、AR、PTGS2、PRSS1、NCOA2、RELA、EGFR、AKT1、VEGFA、CCND1、BCL2L1、CDKN1A、CASP9、MMP2、MMP9、MAPK1、IL10、RB1、JUN、IL6、CASP3、NFKBIA、MDM2、APP、MMP1、PC-NA、ERBB2、PPARG、HMOX1、CASP7、ICAM1、MCL1、BIRC5、IL2、CCNB1、IFNG、IL4、GSTP1、SLC2A4、INSR、CD40LG、PTGES、MET、AKR1B1、KCNH2、SCN5A、ADRB2、MMP3、F7、RXRA、ACHE、MAOB、BCL2、FOS、BAX、PLAU、EGF、ELK1、POR、ODC1、CASP8、RAF1、SOD1、PRKCA、HIF1A、STAT1、ACACA、CYP3A4、CYP1A2、CAV1、MYC、F3、GJA1、CYP1A1、IL1B、CCL2、SELE、VCAM1、CXCL8、PRKCB、DUOX2、NOS3、HSPB1、MGAM、NR1I2、CYP1B1、PLAT、THBD、SERPINE1、COL1A1、ALOX5、IL1A、MPO、NCF1、ABCG2、HAS2、NFE2L2、NQO1、PARP1、AHR、COL3A1、CXCL11、NR1I3、CLDN4、PPARA、PPARD、HSF1、CRP、CXCL10、CHUK、SPP1、RUNX2、E2F1、E2F2、CTSD、IGFBP3、IGF2、IRF1、ERBB3、PON1、DIO1、PCOLCE、HK2、RASA1、GSTM1、GSTM2、NOS2、CHRM1、ESR1、ADRA1A、SLC6A4、ESR2、MAPK14、GSK3B、CCNA2、ATP5F1B、PGR、SLC6A2、CHRM2、ADRA1B、IKBKB、MAPK8、PPP3CA、AKR1C3、SLPI、NR3C2、NR3C1、NCOA1、FOSL1、CYCS、ALOX12、NFATC1、EGLN1、NOX5、APOD。

表1 燈盞細辛有效活性成分

圖1 燈盞細辛有效成分與冠心病靶點交集

2.2 有效成分-靶點相互作用網(wǎng)絡 見圖2。通過Cytoscape3.6.1構(gòu)建燈盞細辛有效成分治療冠心病靶點相互作用網(wǎng)絡圖，右邊深色多邊形代表燈盞細辛，其外圈為燈盞細辛主要有效成分；左邊深色多邊形代表冠心病，其兩層外圈均為冠心病相關(guān)靶點；每條邊代表有效成分與作用靶點之間的關(guān)系。由圖可知，燈盞細辛有效成分與冠心病的內(nèi)圈靶點關(guān)聯(lián)邊比外圈邊更密集，因此內(nèi)圈的靶點為燈盞細辛治療冠心病的核心靶點，也體現(xiàn)了燈盞細辛治療冠心病多成分、多靶點共同作用的特點。

圖2 有效成分-靶點相互作用網(wǎng)絡圖

2.3 交集靶點相互作用網(wǎng)絡 將155個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫得到交集靶點相互作用關(guān)系網(wǎng)絡圖，見圖3。圖中包括節(jié)點155個，邊2625條，節(jié)點代表靶點，邊代表作用靶點之間的關(guān)聯(lián)。節(jié)點發(fā)出的邊越多，則代表兩個靶點間的關(guān)聯(lián)越密切，發(fā)出邊越多的節(jié)點則越可能為網(wǎng)絡圖中的核心靶點基因。統(tǒng)計其中關(guān)聯(lián)度最高的前30個靶點，見圖4。

圖3 燈盞細辛與冠心病交集靶點

2.4 GO富集分析 將155個靶點信息導入DAVID數(shù)據(jù)庫中，從生物過程、細胞組分、分子功能3個水平對關(guān)鍵靶點進行GO富集分析，分別得到生物過程（BP）條目2 155個，細胞組分（CC）條目60個、分子功能（MF）條目152個，并以P＜0.05篩選整合排名靠前的條目，分別取富集程度較高的前10個繪制成圖，見圖5。

圖4 PPI網(wǎng)絡核心基因統(tǒng)計圖

圖5 GO功能富集分析

2.5 KEGG通路富集分析 同樣通過DAVID數(shù)據(jù)庫，對燈盞細辛治療冠心病的主要155個靶點進行KEGG通路富集分析，得到信號通路162條，同樣以P＜0.05篩選整合排名靠前的條目并選取其中所含靶點數(shù)量較高的前30條轉(zhuǎn)化為可視化圖，見圖6。

圖6 KEGG富集分析

3 討 論

網(wǎng)絡藥理學是采用網(wǎng)絡分析的模式，對中藥的物質(zhì)基礎、生物效應及其藥效機制開展網(wǎng)格化、系統(tǒng)化的整合研究[3]。網(wǎng)絡藥理學的興起，將古今中外的信息、內(nèi)容、技術(shù)相融合，為現(xiàn)代研究中醫(yī)藥治療疾病的作用機制提供了更為廣闊的思路和方法。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學的方法探討燈盞細辛治療冠心病的作用機制，結(jié)果得到11個有效成分，155個作用于冠心病的主要靶點。有效成分包括木樨草素、槲皮素、芒柄花素、山奈酚等[4-6]，有研究表明這些成分對心肌細胞具有保護作用。而從PPI網(wǎng)絡圖的分析中可知，燈盞細辛作用靶點與冠心病靶點之間相互影響，靶點間的關(guān)系錯綜復雜，表明其治療作用機制復雜多樣。統(tǒng)計其中關(guān)聯(lián)性最高的靶點，位于前幾位的靶點分別為AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、CASP3，這些靶點主要參與了細胞凋亡、血管生成、炎癥反應等過程。AKT1是PI3K通路中的一個重要蛋白，是AKT 3個同種型蛋白結(jié)構(gòu)中的一種[7]。AKT又稱為蛋白激酶B，在葡萄糖代謝、細胞凋亡、細胞增殖和轉(zhuǎn)錄中具有關(guān)鍵作用[8]；在心血管系統(tǒng)中一旦被胰島素、血小板衍化生長因子（PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、表皮生長因子（EGF）等激活，這些生長因子通過轉(zhuǎn)錄或翻譯機制調(diào)節(jié)AKT活性[9]。CASP3屬于凋亡蛋白酶亞科中的一種，其激活方式主要通過受損的細胞線粒體膜，從胞內(nèi)釋放到胞外來誘導細胞發(fā)生凋亡[10]。AKT活化后可以調(diào)節(jié)VEGF介導的血管生長，使內(nèi)皮細胞遷移來減慢心功能受損速度，同時通過抑制心肌細胞凋亡來增加心肌細胞活性[9]。IL-6由單核巨噬細胞和淋巴細胞產(chǎn)生，是一種常見的炎癥因子。它不僅可以引發(fā)血管壁損傷，另一方面還可誘導肝臟產(chǎn)生CRP，加速冠心病進程[11]。黃樂等研究發(fā)現(xiàn)，隨著冠心病病變程度增加，血清中IL-6水平隨之增高，因此可推斷IL-6與冠心病呈正相關(guān)性[12]。JUN是組成轉(zhuǎn)錄因子AP-1（激活蛋白-1）的一類蛋白族，包括c-JUN、v-JUN、JUN B和JUN D這幾個亞單位。韓暢暢、伍培等研究認為AP-1通過對各種生長因子和細胞因子的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等多種細胞過程，其中c-JUN蛋白對誘導炎性介質(zhì)分泌起重要作用[13-14]。綜上所述，本研究團隊推測認為燈盞細辛一方面通過激活AKT1蛋白保護心肌細胞，一方面單獨通過抑制IL-6介導的炎癥反應，減緩炎癥反應造成的冠脈粥樣硬化；同時從JUN蛋白方面調(diào)控炎性介質(zhì)分泌，從而減慢冠心病形成過程中的炎癥反應。由此說明，燈盞細辛治療冠心病可能是依靠多靶點相互影響、共同調(diào)節(jié)的作用機制。

本研究對燈盞細辛治療冠心病的155個主要靶點進行GO生物過程富集，主要涉及氧化應激反應、代謝反應等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，燈盞細辛主要參與PI3K-Akt信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號通路、MAPK信號通路、HIF-1信號通路等。PI3K-Akt信號通路的激活影響著心肌細胞存活、增殖、凋亡以及心肌細胞能量代謝及調(diào)節(jié)，血管再生等，其在調(diào)控心肌細胞存活和功能方面起著重要作用[9，15]。動脈粥樣硬化是冠心病的發(fā)生發(fā)展基礎，關(guān)鍵的病理生理過程為巨噬細胞膽固醇代謝紊亂從而形成泡沫細胞[16]，其中涉及的巨噬細胞膽固醇攝取能力對脂質(zhì)積累起到重要作用[17]。徐雷等研究認為，AGE-RAGE信號通路通過干預SRA2和CD36表達來介導巨噬細胞膽固醇的代謝，從而影響糖尿病并發(fā)癥中的大血管病變，進一步導致冠心病的發(fā)生[18]。MAPK信號通路是細胞信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)通路之一，參與細胞增殖、凋亡、炎癥、免疫應答等過程，主要包括了ERK、p38 MAPK和JNK信號通路。其中p38 MAPK信號通路磷酸化后生成p-p38 MAPK發(fā)揮促進心肌細胞凋亡的作用[19]；p38 MAPK信號通路激活后還使細胞內(nèi)的炎癥因子水平升高，進一步誘發(fā)巨噬細胞炎癥反應的發(fā)生[20]。HIF-1α是HIF-1信號通路中的重要因子，HIF1的生理活性主要是由HIF-1α決定。鞏曉東等研究發(fā)現(xiàn)，雖然在心肌缺血時HIF-1α的穩(wěn)定表達對心肌有一定保護作用，但當HIF-1α表達水平增高時，冠脈軟斑塊的發(fā)病率也相應增高[21]。這可能與患者血清缺氧和炎癥反應程度明顯增加有關(guān)，導致患者血管內(nèi)皮損傷更加嚴重、更容易形成軟斑塊。以上表明，燈盞細辛作用靶點可能通過分布于不同代謝通路，相互調(diào)節(jié)治療冠心病的作用機制。

綜上所述，燈盞細辛治療冠心病的過程涉及多個有效成分，作用靶點和通路，從靶點基因的角度初步驗證了燈盞細辛治療冠心病的藥理學作用機制，為后續(xù)進一步研究奠定了基礎。由于本研究僅依據(jù)生物利用度和類藥性這一常用篩選標準作為篩選條件，因此對于生物利用度較低但在臨床研究中較為重視的成分有所漏篩，未能將這些成分納入研究中來，是本研究存在的不足之處。