光照對硝酸甘油誘發(fā)的慢性偏頭痛小鼠行為學(xué)癥狀的影響

蒲雙雙 令麗荷 丁 杰 符慶剛 楊旭娟△

1)蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 2)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 3)蘭州大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030

偏頭痛(migrane)是臨床常見的原發(fā)性頭痛，其特征是發(fā)作性、多為偏側(cè)搏動(dòng)性頭痛，一般持續(xù)4～72 h，可伴有惡心、嘔吐、眩暈、畏光等癥狀[1]。據(jù)流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，1/6的男性和1/5的女性有自述的嚴(yán)重頭痛和偏頭痛史，每年約占急診就診總數(shù)的3%[2]。在育齡婦女中，頭痛是急診就診的第三大原因[3-4]。這是一種復(fù)雜的多因素、多基因影響的疾病[5-6]，與遺傳、內(nèi)分泌、飲食及精神因素等[7-9]均有一定關(guān)系，但其發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚[10]。目前學(xué)說中血管學(xué)說主張偏頭痛是由血管舒縮障礙引起的[11-12]，而經(jīng)典造模方法中的硝酸甘油造模法也是通過影響血管的舒縮功能。也有學(xué)說認(rèn)為皮質(zhì)擴(kuò)展性抑制(cortical spreading depressing，CSD)[13]及三叉神經(jīng)血管學(xué)說中降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-realated peptide，CGRP)釋放等有關(guān)[14]。弄清偏頭痛的機(jī)制對患者的治療和預(yù)后有十分重要的作用。

偏頭痛的發(fā)作可由某些食物和藥物誘發(fā)。食物包含腌制食物、奶制品、巧克力、辛辣食物、食品添加劑等，藥物包括口服避孕藥和血管擴(kuò)張劑等，過勞和緊張情緒也是偏頭痛的誘發(fā)因素。而燈光因素如亮光和頻閃燈[15-17]作為一項(xiàng)易被人們忽視的因素，往往影響偏頭痛疾病的轉(zhuǎn)歸。目前尚無光照影響偏頭痛疾病進(jìn)展的研究，故我們在此利用PRADHAN等[18]的硝酸甘油實(shí)驗(yàn)性慢性偏頭痛造模方法[19-21]，利用亮燈和頻閃燈來干預(yù)小鼠的生活環(huán)境，記錄這些干預(yù)對小鼠的行為學(xué)影響[22-24]。以此探究合適的光照條件是否可以緩解患者的病程偏頭痛。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雌性KM系健康小鼠，體質(zhì)量(16±1)g，雌鼠25只，蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。5只一籠飼養(yǎng)，分開進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，自然光照，通風(fēng)良好，自由進(jìn)食水。動(dòng)物飼料：顆粒小鼠飼料，由蘭州大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)注射劑，0.9%生理鹽水，30%乙醇，30%丙二醇。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)裝置：2 W LED燈光，40 W 108顆LED白光頻閃燈(頻閃速度1 s/次)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及造模：隨機(jī)分為空白組、造模(硝酸甘油，NTG)組、NTG-暗光組、NTG-亮光組、NTG-頻閃光組，每組5只?？瞻捉M：小鼠腹腔注射生理鹽水；造模組[18]：硝酸甘油制備液由5.0 mg·mL-1硝酸甘油、30%乙醇、30%丙二醇和水配制而成(4 ℃保存)，需要時(shí)0.9%氯化鈉注射液稀釋至10 mg·kg-1，間隔1 d小鼠腹腔注射稀釋液，共9 d (5個(gè)測試日)，復(fù)制實(shí)驗(yàn)性慢性偏頭痛模型，以注射后1～3 min出現(xiàn)雙耳發(fā)紅，前肢頻繁撓頭，爬籠次數(shù)增多等癥狀為造模成功的指標(biāo)[25]。觀察注射NTG 30 min內(nèi)小鼠撓頭和爬籠次數(shù)。NTG-暗光組：小鼠在完全避光條件下飼養(yǎng)；NTG-亮光組：小鼠在10 W的LED燈光下生活；NTG-頻閃組：造模成功后，在環(huán)境處理室-暗室裝置中間開一通道(頻閃燈垂直照射，盡量使暗室無亮光)，15 min后計(jì)算小鼠進(jìn)入暗室的概率。

1.2.2 觀察內(nèi)容和方法：(1)撓頭、爬籠次數(shù)：記錄造模30 min之后小鼠撓頭和爬籠的次數(shù)。撓頭開始時(shí)間以小鼠出現(xiàn)連續(xù)撓頭次數(shù)>5次為標(biāo)志。(2)體質(zhì)量變化：每天同一時(shí)間測小鼠體質(zhì)量。(3)位置偏好：計(jì)算NTG-暗光組和NTG-頻閃組小鼠進(jìn)入暗室的概率。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)分析用SPSS軟件處理，對小鼠撓頭次數(shù)和爬籠次數(shù)進(jìn)行重復(fù)測量的方差分析，對進(jìn)入暗室小鼠比率進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以α=0.05為顯著性水準(zhǔn)。作圖用GraphPad prism 6。

2 結(jié)果

2.1撓頭空白組偶發(fā)有<1次撓頭的癥狀(故不計(jì))，造模后的大鼠在1～3 min后出現(xiàn)撓頭癥狀，比較NTG-暗光組，NTG-亮光組和模型組撓頭的次數(shù)，其中亮光組和模型組相比亮光組撓頭次數(shù)顯著上升(P<0.05)，且NTG亮光組和暗光組相比次數(shù)也顯著上升(P<0.001)。見圖1、表1。

2.2體質(zhì)量變化在9 d的慢性偏頭痛造模進(jìn)程中，每天在同一時(shí)間對小鼠體質(zhì)量進(jìn)行測量，經(jīng)過重復(fù)測量統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)對照組的體質(zhì)量變化率和其他處理組相比有顯著性差異(P<0.001)，而處理組之間的互相對比尚不能認(rèn)為不同環(huán)境因素對小鼠的體質(zhì)量變化有顯著作用。見表2、圖2。

2.3位置偏好[25]測試NTG暗光組和NTG頻閃光組小鼠在測試日注入硝酸甘油注射劑后對于暗室和亮室的偏好，以進(jìn)入暗室小鼠所占比率為衡量值，發(fā)現(xiàn)頻閃光能顯著增加小鼠的畏光(表現(xiàn)為閉眼，活動(dòng)度下降，躲在角落)和避光(進(jìn)入暗室)行為，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3、圖3。

圖1 小鼠在測試日撓頭次數(shù)變化趨勢Figure 1 Trends in the number of scratches on mice during the test day

圖2 小鼠體質(zhì)量增長率變化趨勢Figure 2 The trend of growth rate of mouse body mass

表1 小鼠在測試日撓頭的次數(shù)次數(shù)/30 min)Table 1 Number of times the mouse scratched the head on the test of times/30 min)

注：與NTG組比較，*P<0.05；與NTG-黑暗組比較，#P<0.05

表2 小鼠在9d內(nèi)體質(zhì)量增長率Table 2 Growth rate of body mass within 9

注：與NTG比較，*P<0.05

圖3 頻閃光和暗光處理?xiàng)l件下小鼠進(jìn)入暗室的頻率Figure 3 Frequency of mice entering the darkroom under stroboscopic and dim light conditions

3 討論

偏頭痛是一種常見的慢性神經(jīng)血管性疾病，患病率為5%～10%。其治療包括藥物治療和非藥物治療。藥物治療包含非甾體類抗炎藥、麥角類制劑和曲普坦類藥物，可分別緩解頭痛、收縮腦血管，減少搏動(dòng)幅度以及降低偏頭痛時(shí)血中的CGRP含量。但不良反應(yīng)包括胃潰瘍、惡心、嘔吐、心悸、焦慮等[26]。目前有研究表明CGRP受體拮抗劑是終止偏頭痛急性發(fā)作的特異性藥物[14]。非藥物治療包括健康生活方式，避免偏頭痛的誘因和疾病加重因素。亮光和頻閃光作為易被人們忽視的因素，往往影響慢性偏頭痛疾病的轉(zhuǎn)歸。

本實(shí)驗(yàn)中，硝酸甘油注射后的小鼠出現(xiàn)了雙耳發(fā)紅，前肢頻繁搔頭，爬籠次數(shù)增多，說明偏頭痛造模成功，且亮光和頻閃光能加重小鼠的焦慮程度(撓頭和爬籠次數(shù)表征)和誘導(dǎo)畏光行為(閉眼和縮進(jìn)角落)。在造模的進(jìn)程中(1～9 d)，小鼠的撓頭次數(shù)下降，說明慢性偏頭痛造模過程中，小鼠對硝酸甘油的耐受性增加[27]。本實(shí)驗(yàn)也說明慢性偏頭痛會(huì)導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量下降，活動(dòng)度下降。亮光、頻閃光組和黑暗組的體質(zhì)量與正常組相比均有顯著差異，而不同燈光干預(yù)之間沒有顯著差異，說明偏頭痛和小鼠體質(zhì)量減輕有明顯聯(lián)系，而不同光照導(dǎo)致的差異較小。

本實(shí)驗(yàn)選擇對偏頭痛造模方法更敏感的雌性大鼠[28]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更典型。且選擇了PRADHAN等[18]驗(yàn)證過的慢性偏頭痛造模方法。此造模方法通過慢性和間歇給予硝酸甘油，引起小鼠足底機(jī)械性痛覺過敏[29]。有研究表明硝酸甘油通過誘導(dǎo)CGRP的基因表達(dá)，使腦膜血管舒張[14，30-31]。它簡單、經(jīng)濟(jì)，可在短期內(nèi)大量復(fù)制，且能夠觀察清醒狀態(tài)下小鼠的行為學(xué)變化。但是此造模方法也有不足之處，它不能完全模擬偏頭痛患者顱內(nèi)血管變化[32]，且全身反應(yīng)較大，運(yùn)用行為學(xué)癥狀評價(jià)小鼠的對環(huán)境的影響不能做到客觀公正。

亮光和頻閃光能誘發(fā)偏頭痛的發(fā)生而且能加重偏頭痛患者頭痛程度眾所周知，但具體的分子機(jī)制還不清楚[33]，一些人認(rèn)為，偏頭痛發(fā)作時(shí)會(huì)激活從眼睛到大腦的特定神經(jīng)通路，從而導(dǎo)致偏頭痛患者暴露于亮光和頻閃光后立即經(jīng)歷突然的光敏性和頭痛癥狀[34]。黑暗環(huán)境可以緩解偏頭痛癥狀，一項(xiàng)已發(fā)表的調(diào)查表明，超過90%的患者嘗試過該方法，人們進(jìn)入暗室10～20 min后癥狀開始緩解[35]。

本實(shí)驗(yàn)為光照影響偏頭痛的機(jī)制提供了思路，若要證明光照和偏頭痛的直接聯(lián)系，還需要血清學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行證明。除此之外，探究偏頭痛患者是否對不同波長的光敏感性有差異也具有重要意義。

本實(shí)驗(yàn)探究了光照對于慢性偏頭痛的影響，將環(huán)境因素對偏頭痛的影響量化，能為人們的生活方式提供合理的建議，并且為弄清偏頭痛發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。