通電加熱過程中凡納濱對(duì)蝦蝦肉糜核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的變化

谷文靜，金英善，鄭睿林，程裕東，金銀哲*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院食品熱加工工程中心，上海，201306) 2(揚(yáng)州大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州，277600) 3(北倫敦濟(jì)州國際學(xué)校，韓國 濟(jì)州，697600)

通電加熱(ohmic heating，OH)，也稱為電阻加熱或焦耳加熱，是一種電流流經(jīng)食品物料從而直接進(jìn)行加熱的加工方式[1]。與傳統(tǒng)加熱相比，它的主要優(yōu)點(diǎn)是加熱快速、均勻，即開即停，能量轉(zhuǎn)換率高，能最小程度地改變食品的結(jié)構(gòu)、營養(yǎng)或感官，從而提高產(chǎn)品品質(zhì)[2]。這項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于高黏度和固液混合物的糊狀產(chǎn)品的滅菌，魚糜的烹飪和冷凍食品的解凍等方面[3-4]。

電導(dǎo)率(σ)是衡量通電加熱效應(yīng)的重要因素，是熱量產(chǎn)生的先決條件[5]。溫度、頻率、場(chǎng)強(qiáng)、電解質(zhì)/離子添加劑、食品成分和食品相態(tài)都會(huì)通過改變食品電導(dǎo)率從而影響加熱效果[6]。張烈等[7]測(cè)定了頻率、溫度對(duì)草魚魚塊和魚皮電導(dǎo)率的影響，發(fā)現(xiàn)樣品的電導(dǎo)率都呈現(xiàn)了溫度和頻率的依存性。SARANG等[8]認(rèn)為，基于糖或鹽的總離子電導(dǎo)率的測(cè)定可能是未來研究通電加熱效果的方向，因此研究金屬離子對(duì)食品電導(dǎo)率的影響十分有意義。

電導(dǎo)率會(huì)影響通電加熱速率，而加熱速率不同也導(dǎo)致加熱過程中的一些化學(xué)變化的改變，如核苷酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的降解過程等。核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物(nucleotides and related compounds，NRCs)是蝦類等水產(chǎn)動(dòng)物肌肉中重要組成成分，主要包含三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、一磷酸鳥苷(guanosine monophosphate，GMP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、一磷酸腺苷(adenosine monophosphate，AMP)、肌苷酸(inosine monophosphate，IMP)、次黃嘌呤核苷(inosine，HxR)、次黃嘌呤(hypoxanthine，Hx)、腺苷(adenosine，AdR)、腺嘌呤(adenine，Ad)和黃嘌呤(xanthine，Xt)等[9]。水產(chǎn)動(dòng)物死后，肌糖原分解并且在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量ATP，ATP逐漸降解為ADP和AMP。AMP在AMP脫氨酶作用下脫氨生成IMP[10]，IMP通過酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)緩慢轉(zhuǎn)化為HxR和Hx[11]。死后肌肉中核苷酸及關(guān)聯(lián)化合物的變化與新鮮度和滋味有關(guān)。

核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量受到各種直接和間接因素影響，如年齡、性別、遷徙行為、物種、處理和季節(jié)變化。此外，溫度、離子的存在以及AMP脫氨酶和ACP活性的變化也會(huì)影響核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量[12-16]。

綜上所述，加熱方式和溫度，以及金屬離子含量或添加物會(huì)影響水產(chǎn)品中核苷酸及其關(guān)聯(lián)產(chǎn)物。作為新興的加熱方式，通電加熱在水產(chǎn)品中的應(yīng)用會(huì)越來越廣泛。金屬離子的種類和含量會(huì)在很大程度上影響物料的電導(dǎo)率，導(dǎo)致通電加熱速率和效果的不同。因此，有必要探究水產(chǎn)品在通電加熱過程中核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量的變化，特別是金屬離子含量或添加物對(duì)其核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量尤其是對(duì)滋味的影響。

本研究探究了通電加熱過程中金屬離子添加劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦電導(dǎo)率的影響,并采用HPLC法檢測(cè)通電加熱期間蝦肉中核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量。同時(shí)，研究了添加不同金屬離子的凡納濱對(duì)蝦在通電加熱過程中核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鮮活的凡納濱對(duì)蝦于2019年6月購自菜市場(chǎng)，放置充氧袋中并迅速運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行預(yù)處理。ATP、GMP、 ADP、AMP、IMP、HxR、Hx、AdR、Ad標(biāo)準(zhǔn)品,Sigma公司;去離子水和超純水來自上海海洋大學(xué);甲醇、K2HPO4、KH2PO4均為HPLC級(jí)，高氯酸、KOH、H3PO4、ZnCl2、CuCl2、AlCl3、FeCl3均為優(yōu)級(jí)純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS224S電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；IMS-20制冰機(jī)，常熟市雪科電器有限公司；FSH-2可調(diào)高速勻漿機(jī)，常州國華電器有限公司；WRNK-135K型熱電偶，大華儀器儀表有限公司；TDGC2接觸調(diào)壓器，浙江德力西電器有限公司；LCR測(cè)量儀(IM3533),日置電機(jī)株式會(huì)社；DZF-2ASB真空干燥箱，中儀泓瑞科技發(fā)展(北京)有限公司；MP522型精密pH計(jì)，上海三信儀表廠；T-50溶劑過濾器，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；E2695高效液相色譜儀，美國沃特斯股份有限公司；ODS-3高效液相色譜柱，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備

挑選體長、體積相近，質(zhì)量約為10 g的鮮蝦去頭去尾脫殼除蝦線，清洗并瀝干表面水分。取150 g凡納濱對(duì)蝦置于預(yù)冷勻漿儀中，以30 s的間隔在10 000 r/min下攪拌5 min，以蝦與溶液料液比為10∶1(g∶mL)加入預(yù)冷金屬離子溶液(1、5、10 mmol/L)，對(duì)照組加入等量去離子水，形成均勻的復(fù)合蝦肉糜?；旌虾?，將樣品轉(zhuǎn)移到500 mL容器中并用保鮮膜密封以防止水分的蒸發(fā)。共13組樣品，在(4.0±0.1) ℃下保持30 min。

1.3.2 金屬離子溶液的制備

稱取1.36 g ZnCl2粉末，去離子水溶解并定容到1 L容量瓶中，得到10 mmol/L ZnCl2溶液，并稀釋得到1、5 mmol/L ZnCl2溶液。用同樣的方法分別配制1、5、10 mmol/L的CuCl2、AlCl3、FeCl3溶液，共得到12組離子溶液。

1.3.3 通電加熱及電導(dǎo)率的測(cè)定

靜態(tài)通電加熱裝置由加熱腔體、鈦電極、K型熱電偶等組成。自制的加熱腔(20 mm×20 mm×20 mm，厚5 mm)由聚乙烯材料與絕緣膠帶制成。鈦電極(20 mm×60 mm，厚0.1 mm)作為導(dǎo)電極板，在氯化物環(huán)境中具有高度耐腐蝕性。腔體外部包裹泡沫塑料隔熱以減少樣品的熱量損失。K型熱電偶探針(φ=0.5 mm)裹上聚四氟乙烯膜(防止電場(chǎng)干擾熱電偶的信號(hào)傳輸)從頂部插入至樣品幾何中心。

將4 ℃復(fù)合蝦肉糜樣品約8 g快速填充至總體積為8 cm3的加熱腔中。通電加熱的關(guān)鍵是電極與腔體中樣品表面之間達(dá)到完全接觸，接觸不良可能導(dǎo)致加熱不均。接觸調(diào)壓器通過電極板將20 V恒定電壓施加到電極上，加熱樣品直到樣品中心溫度達(dá)到指定溫度(25、40、55、65、75、85和95 ℃)。此時(shí)停止加熱并記錄加熱時(shí)間。電極兩側(cè)連接LCR測(cè)量儀，并在50 Hz～20 kHz下測(cè)量樣品的瞬時(shí)阻抗(Z)。由于在此頻段下樣品阻抗(Z)在數(shù)值上幾乎與電阻(R)相同。因此阻抗(Z)用于計(jì)算樣品的電導(dǎo)率，如公式(1)所示。

(1)

式中：R，樣品電阻，Ω；L，兩電極之間的間隙，m；S，電極表面積，m2。

通電加熱后，取出樣品在冰水浴中冷卻至4 ℃，然后立即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)操作。

1.3.4 核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的提取

核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的提取參考ZHANG等[13]的方法，并作適當(dāng)修改。稱取冷卻后的樣品5.0 g于離心管中，加入20 mL預(yù)冷的100 g/L高氯酸溶液充分勻漿，將懸浮液在5 000 r/min下冷凍離心10 min，收集上清液，沉淀物中再次加入10 mL預(yù)冷的50 g/L高氯酸溶液浸提、離心(條件同上)，合并2次離心的上清液，調(diào)pH至5.8。將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中并用超純水定容。使用孔徑為0.22 μm微孔濾膜過濾。將樣品保持于-20 ℃冰箱備用。

1.3.5 核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的測(cè)定

核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的檢測(cè)參考QIU等[17]的方法，并作適當(dāng)修改。在裝有Waters 2996光電二極管陣列檢測(cè)器和empower 2軟件包(Waters Co.，Massachusetts，MA，USA)的Waters Alliance 2695 HPLC系統(tǒng)上進(jìn)行NRC分析。色譜條件如下：色譜柱Shimadzu ODS-3 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；流動(dòng)相A為甲醇，B為V(20 mmol/L KH2PO4)∶V(20 mmol/L K2HPO4)=1∶1，用磷酸調(diào)節(jié)pH至5.8(所有溶劑通過0.45 μm膜濾器過濾并脫氣)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長254 nm；流速1.0 mL/min；梯度洗脫：0～8 min 100% B，8～10 min 3% A，10～15 min 6% A，15～23 min A線性增加至30%，23～26 min 30% A，26～30 min 100% B。

1.3.6 滋味活性值的計(jì)算

滋味活性值(taste active value，TAV)為食品基質(zhì)中某一呈味物質(zhì)的濃度與其相應(yīng)的味道識(shí)別閾值之比。盡管TAV方法沒有考慮到同時(shí)存在的化合物在食品基質(zhì)中的掩蔽、增強(qiáng)或協(xié)同作用的可能性，但TAV被廣泛用于評(píng)估那些單獨(dú)的味道活性化合物的味道影響。

(2)

式中：C，某一呈味物質(zhì)的濃度，mg/100 g；T，呈味物質(zhì)的味道識(shí)別閾值，mg/100 g。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS軟件(版本13.0，SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和平均值比較。顯著性差異為P<0.05。所有數(shù)據(jù)使用Origin 9.1(Origin Lab，Massachusetts，MA，USA)作圖。所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 凡納濱對(duì)蝦蝦肉糜電導(dǎo)率的變化

2.1.1 電導(dǎo)率的頻率依存性

在不同溫度下，蝦肉糜在50 Hz～20 kHz的電導(dǎo)率為0.15～1.36 S/m(圖1)。這符合ZELL等[18]提出的通電加熱物料的電導(dǎo)率值在0.01～10 S/m范圍內(nèi)，最佳效率在0.1～5 S/m范圍內(nèi)的結(jié)論。

如圖1所示，頻率和電導(dǎo)率具有對(duì)數(shù)函數(shù)關(guān)系。在50 Hz～20 kHz內(nèi)，樣品電導(dǎo)率隨頻率先顯著增加(P<0.05)，后趨于穩(wěn)定。在較低溫度(25～40 ℃)，頻率低于1 000 Hz時(shí)，電導(dǎo)率急劇增加，之后變化不大；在高溫(55～95 ℃)， 電導(dǎo)率隨頻率不斷增長，但在5 000 Hz后無顯著變化(P>0.05)。當(dāng)頻率接近測(cè)定終點(diǎn)頻率(20 kHz)時(shí)，樣品電導(dǎo)率略有下降。這與SHYNKARYK等[19]和GUO等[1]的結(jié)論一致。

圖1 通電加熱過程中蝦肉糜的電導(dǎo)率Fig.1 Electrical conductivity of minced shrimpduring ohmic heating

電導(dǎo)率的頻率依存性可能與細(xì)胞膜的滲透性和頻率的分散機(jī)制有關(guān)。在低頻下，樣品組織中存在α-分布機(jī)理，當(dāng)施加電壓時(shí)，細(xì)胞膜滲透性的變化為離子運(yùn)動(dòng)打開許多通道[20]，此時(shí)內(nèi)源酶與大分子物質(zhì)的相互作用也將增加離子的數(shù)量，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)導(dǎo)電性增強(qiáng)。在高頻率下，由于細(xì)胞結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全透化，電導(dǎo)率趨于穩(wěn)定。并且完整細(xì)胞和破裂細(xì)胞的電導(dǎo)率差異幾乎可以忽略不計(jì)[1]。當(dāng)接近20 kHz時(shí)，細(xì)胞可能存在的β-分散機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞膜逐漸失去通透性[21]，另外細(xì)胞膜可能的可逆透化也會(huì)造成電導(dǎo)率的輕微減小。

作為絕緣細(xì)胞膜在電場(chǎng)中充電極化的結(jié)果，電導(dǎo)率的頻率依存性存在于所有生物細(xì)胞中。因此，研究特定頻率范圍(例如本實(shí)驗(yàn)使用的頻率段是在α色散范圍內(nèi)和僅高于α色散頻段的β色散范圍內(nèi))對(duì)電導(dǎo)率的影響，這對(duì)于預(yù)測(cè)具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的食品材料在加工、貯藏和運(yùn)輸時(shí)發(fā)生的細(xì)胞損傷和破裂行為是十分有價(jià)值的。

2.1.2 電導(dǎo)率的溫度依存性

樣品的電導(dǎo)率隨溫度升高而升高(圖2)，這是由于高溫處理對(duì)離子運(yùn)動(dòng)的阻礙作用不如低溫時(shí)顯著，即溫度升高導(dǎo)致離子遷移率增加[22]。電導(dǎo)率也與離子電荷密度有關(guān)，在通電加熱過程中，隨著加熱溫度的升高，蝦肉糜的內(nèi)源性酶促進(jìn)了帶電荷量少的大分子聚合物(如蛋白質(zhì)和脂肪)分解成帶電荷量多的小分子物質(zhì)，這可能會(huì)增加樣品的電導(dǎo)率[23-24]。此外，蛋白質(zhì)通道和細(xì)胞膜中脂質(zhì)結(jié)構(gòu)域的熱損傷，肌原纖維蛋白的熱變性和蒸煮損失也影響樣品在高溫下的電導(dǎo)率[24]。

圖2 蝦肉糜在不同溫度下的電導(dǎo)率Fig.2 Electrical conductivity of minced shrimp atdifferent temperature注：圖中同一折線圖上不同字母代表著差異性顯著，P<0.05

圖2顯示了50 Hz和20 kHz(20 kHz為通電加熱的工業(yè)用頻率)下的電導(dǎo)率的溫度依存性，樣品的電導(dǎo)率與溫度呈線性關(guān)系而高于65 ℃時(shí)電導(dǎo)率非線性增加。這可能是由于在60～70 ℃時(shí)肌動(dòng)蛋白、肌束膜和肌外膜膠原蛋白變性，導(dǎo)致離子運(yùn)動(dòng)發(fā)生變化[25]。此外，由于部分蛋白質(zhì)熱變性，樣品也有一些收縮，這導(dǎo)致樣品與電極接觸不良[26]。如DARVISHI等[22]所示，樣品電導(dǎo)率下降的另一個(gè)主要結(jié)構(gòu)變化是由于樣品中蒸汽的產(chǎn)生和氧化還原反應(yīng)副產(chǎn)物中氣體(例如H2或O2)的增加導(dǎo)致樣品體積膨脹，而這些氣體通常是電絕緣體。SARANG等[8]指出，樣品中更多的孔隙和大量的氣體是樣品電導(dǎo)率降低的原因。這種同時(shí)膨脹和收縮將導(dǎo)致通電加熱中整體體積變化，進(jìn)而影響電導(dǎo)率。

在95 ℃，20 kHz下樣品的電導(dǎo)率約為50 Hz時(shí)的5倍左右(分別為0.28 S/m和1.36 S/m)。20 kHz條件下，由σ-T曲線的斜率可以看出，隨著溫度升高，這兩者的差異更為明顯。20 kHz時(shí)樣品溫度升高到95 ℃所用時(shí)間約50 Hz條件下的1/6，這意味著在指定溫度，高頻條件下電導(dǎo)率的增加速率比低頻條件快，也就是說，與低頻相比，電導(dǎo)率的溫度依賴性在高頻時(shí)表現(xiàn)得更為明顯。

2.1.3 金屬離子濃度對(duì)蝦肉糜電導(dǎo)率的影響

通電加熱過程中經(jīng)不同濃度的Zn2+、Cu2+、Al3+和Fe3+處理的蝦肉糜的電導(dǎo)率的變化見圖3、圖4。發(fā)現(xiàn)含金屬離子添加物的蝦肉糜的電導(dǎo)率高于沒有添加金屬離子的電導(dǎo)率，這是因?yàn)榭呻婋x的鹽在通電加熱中充當(dāng)電流載流子，導(dǎo)電性增強(qiáng)。

經(jīng)不同種類的金屬離子(濃度分別為1、5和10 mmol/L)處理的蝦肉糜在通電加熱下的電導(dǎo)率見圖3。在相同溫度下，經(jīng)同一種金屬離子處理的蝦肉糜的電導(dǎo)率與離子濃度的關(guān)系Zn2+：σ(1 mmol/L)>σ(5 mmol/L)>σ(10 mmol/L)；Cu2+： σ(5 mmol/L)>σ(10 mmol/L)>σ(1 mmol/L)；Al3+：σ(10 mmol/L)>σ(1 mmol/L)>σ(5 mmol/L);Fe3+：σ(10 mmol/L)>σ(5 mmol/L)>σ(1 mmol/L)。

a-Zn2+處理組;b-Cu2+處理組;c-Al3+處理組;d-Fe3+處理組圖3 不同濃度的金屬離子處理的蝦肉糜在通電加熱下的電導(dǎo)率Fig.3 Electrical conductivity of minced shrimp treated with different concentrations of metal ions during OH注：圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05)

從圖3可以看出，電導(dǎo)率與金屬離子濃度之間沒有強(qiáng)烈的相關(guān)性。這是由于電導(dǎo)率取決于游離或未結(jié)合的金屬離子量而不是與蝦肌肉蛋白結(jié)合的金屬量或給定金屬的離子量[27]。Zn2+易與蛋白質(zhì)表面氨基酸殘基中的咪唑基、硫醇和吲哚基等官能團(tuán)結(jié)合[28]，低濃度的Zn2+只能與部分氨基酸殘基相結(jié)合，而高濃度的Zn2+能夠與更多氨基酸殘基結(jié)合使暴露的氨基酸殘基的離子量減小[28]，電導(dǎo)率相應(yīng)也減小。Cu2+與蛋白質(zhì)結(jié)合的官能團(tuán)與Zn2+相同，但是Cu2+具有比Zn2+更強(qiáng)的結(jié)合能力[29]，低濃度的Cu2+可與蛋白質(zhì)結(jié)合形成更緊密的結(jié)構(gòu)，1 mmol/L Cu2+處理組的電導(dǎo)率大于5、10 mmol/L處理組。Al3+、Fe3+與蛋白質(zhì)結(jié)合的特征官能團(tuán)是羧基和磷酸酯，且二者與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力弱于Zn2+、Cu2+[28]。濃度越大，未能與蛋白質(zhì)結(jié)合的Fe3+量越多，所以對(duì)于Fe3+處理組來說，濃度越高，電導(dǎo)率越大。此外，金屬與蛋白質(zhì)螯合物的穩(wěn)定性受到金屬離子的半徑和電荷密度的影響[28]，這可能是造成Al3+處理組與Fe3+處理組的結(jié)果有差異的原因。

2.1.4 金屬離子種類對(duì)蝦肉糜電導(dǎo)率的影響

經(jīng)不同濃度的金屬離子處理的蝦肉糜在通電加熱下的電導(dǎo)率見圖4。在相同溫度下，經(jīng)同一離子濃度處理蝦肉糜的電導(dǎo)率與離子種類的關(guān)系：1 mmol/L：σ(Zn2+)>σ(Al3+)>σ(Fe3+)>σ(Cu2+)；5 mmol/L：σ(Fe3+)>σ(Zn2+)>σ(Cu2+)>σ(Al3+)；10 mmol/L：σ(Fe3+)>σ(Al3+)>σ(Zn2+)>σ(Cu2+)。

離子種類和濃度會(huì)對(duì)樣品的電導(dǎo)率產(chǎn)生影響。Zn2+和Cu2+比Al3+和Fe3+對(duì)蛋白質(zhì)有更強(qiáng)的親和力，而Cu2+與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力稍強(qiáng)于Zn2+ [28]。在高濃度下Zn2+和Cu2+優(yōu)先中和蛋白質(zhì)表面上的電荷，導(dǎo)致樣品的自由離子更少。AROCKIADOSS等[27]也認(rèn)為，銅比鐵更有效地結(jié)合蛋白質(zhì)。金屬離子與蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子的結(jié)合機(jī)理復(fù)雜，且食品生物大分子中的游離電荷量不能確定，目前金屬離子對(duì)食品電導(dǎo)率的影響機(jī)理沒有準(zhǔn)確的理論，有待進(jìn)一步研究。

圖4 不同種類的金屬離子處理的蝦肉糜在通電加熱過程中的電導(dǎo)率(P<0.05)Fig.4 Electrical conductivity of minced shrimp treated with different metal ions during OH(P<0.05)

此外，當(dāng)達(dá)到指定加熱溫度時(shí)，較高的電導(dǎo)率導(dǎo)致較快的加熱速率和較短的加熱時(shí)間。95 ℃時(shí)，經(jīng)10 mmol/L Fe3+處理的樣品中，電導(dǎo)率(1.86 S/m)增加了37%并且加熱時(shí)間(239 s)縮短了19%。因此，具有最大電導(dǎo)率，最短加熱時(shí)間以及最弱金屬結(jié)合水平的10 mmol/L Fe3+是蝦肉糜樣品中的最佳導(dǎo)體。

2.2 通電加熱對(duì)蝦肉糜中核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物變化的影響

2.2.1 通電加熱溫度對(duì)蝦肉糜核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量的影響

通電加熱過程中蝦肉糜的9種核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物含量的變化情況如圖5所示。ATP含量在7.7～8.2 mg/100 g范圍內(nèi)波動(dòng)，ADP含量隨著溫度的升高而增大，到達(dá)高溫(85～95 ℃)后略有下降。凡納濱對(duì)蝦存活時(shí)，蝦肉中的核苷酸主要是ATP和ADP。在死后初期，Ca2+-ATP酶受膜上大量Ca2+激活并分解ATP。在蝦死后1 d內(nèi)，大部分ATP和ADP主要降解為AMP和IMP，所以僅剩下少量ATP和ADP。

AMP、IMP都在65 ℃達(dá)到最大值，溫度升高促進(jìn)了AMP、IMP的積累，溫度進(jìn)一步升高時(shí)，二者均略有下降。這是由于溫度升高，Ca2+-ATP酶的活性增強(qiáng)，而溫度過高導(dǎo)致該酶失活，這與ZHANG等[13]的研究結(jié)果一致。HxR分別在40 ℃和65 ℃時(shí)達(dá)到最小和最大值，而AdR在75 ℃時(shí)達(dá)到最大值，GMP在55 ℃時(shí)達(dá)到最大值。故通電加熱溫度最好控制在40～65 ℃之間，不宜超過75 ℃。

a-7種核苷酸;b-GMP和AdR圖5 通電加熱過程中9種核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的變化Fig.5 Changes of 9 NRCs during OH注：不同字母代表著差異性顯著(P<0.05)

核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物對(duì)蝦類滋味的產(chǎn)生具有重要貢獻(xiàn)，在本研究中，GMP、AMP和IMP是對(duì)凡納濱對(duì)蝦滋味貢獻(xiàn)最大的核苷酸，且它們的TAV都大于1。GMP和IMP是水產(chǎn)品呈現(xiàn)鮮味的核心物質(zhì)，二者濃度越大，呈味效果越好。而AMP的呈味效果取決于AMP在樣品中的濃度，低濃度(50～100 mg/100 g)下即TAV在1～2之間，AMP呈現(xiàn)甜味，但沒有鮮味；中等濃度(100～200 mg/100 g)下即TAV在2～4之間，AMP呈現(xiàn)甜味和輕微的咸味。

4種呈味核苷酸的TAV隨通電加熱溫度的變化如圖6所示。GMP、IMP的TAV均大于1，其中GMP的TAV最大，并在55 ℃時(shí)達(dá)到最大值；AMP、IMP的TAV均在65 ℃達(dá)到最大值；Hx的TAV隨著溫度的升高略有降低且始終遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于1，故通電加熱過程中凡納濱對(duì)蝦能夠產(chǎn)生一定的鮮味但不會(huì)產(chǎn)生明顯的苦味。IMP和AMP的TAV都在65 ℃達(dá)到最大值，故通電加熱溫度控制在55～65 ℃之間更有利于蝦肉糜良好滋味的產(chǎn)生。

圖6 四種呈味核苷酸的TAVFig.6 TAVs of four kinds of taste nucleotides注：同一折線圖上不同字母代表差異性顯著(P<0.05)

2.2.2 通電加熱過程中金屬離子對(duì)蝦肉糜中核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的影響

不同金屬離子添加劑對(duì)蝦肉糜中核苷酸的降解途徑的影響如表1所示，對(duì)照組(純蝦肉糜)與Zn2+處理組均有2種降解途徑，分別是IMP途徑：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx和AdR途徑：ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Ad，而10 mmol/L Zn2+處理組蝦肉糜中未檢測(cè)到AdR卻有Ad的積累，這可能是由于高濃度的Zn2+更多地與AMP脫氨酶與酸性磷酸酶形成配合物，從而改變了IMP的降解途徑與產(chǎn)物。Cu2+、Al3+處理組的蝦肉糜都只有1種降解途徑為ATP→ADP→AMP→IMP→Hx，而Fe3+處理組也只有1種降解途徑為ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx，二者之間的差異可能是由于金屬離子種類不同，對(duì)關(guān)鍵酶的構(gòu)象與活性的影響不同所致。

表1 不同金屬離子處理下蝦肉糜中核苷酸的降解途徑Table 1 Degradation pathways of nucleotides in shrimptreated with different metal ions

注：空白處表示該途徑有對(duì)應(yīng)物質(zhì)，但實(shí)際未測(cè)出

不同金屬離子對(duì)ATP降解途徑的影響作用主要是通過改變酶的構(gòu)象及影響酶活性實(shí)現(xiàn)的，目前研究最多的是AMP脫氨酶和ACP，這2種酶與IMP的生成和降解有關(guān)。LI等[15]發(fā)現(xiàn)Na+、K+、5 ～ 9 mmol/L Fe2+和Zn2+通過增強(qiáng)AMP脫氨酶活性進(jìn)而產(chǎn)生大量IMP，F(xiàn)e2+和Zn2+抑制ACP活性進(jìn)而減少了IMP的分解和Hx的形成。金屬離子對(duì)ATP降解途徑的影響機(jī)理還與加工方式(如通電加熱等)和物種(水產(chǎn)品魚、蝦、貝等)有關(guān)，這有待進(jìn)一步研究。

不同濃度Zn2+處理的蝦肉糜中的核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量變化如圖7所示。其中ATP、ADP的含量沒有明顯地變化(P<0.05)，始終保持在較低的水平(<10 mg/100 g)，這是由于凡納濱對(duì)蝦死后，ATP、ADP迅速降解為AMP與IMP。AMP的含量分別在65 ℃(1 mmol/L)、65 ℃(5 mmol/L)、75 ℃(10 mmol/L)達(dá)到最大值,而IMP的含量分別在40 ℃(1 mmol/L)、75 ℃(5 mmol/L)、40 ℃(10 mmol/L)達(dá)到最大值。1 mmol/L Zn2+處理組的AMP+IMP最大，說明1 mmol/L Zn2+處理的蝦肉糜的鮮味與甜味呈味效果更好。而對(duì)同樣呈鮮味的GMP來說，3種濃度處理的蝦肉糜中均呈上下波動(dòng)趨勢(shì)，但在加熱溫度25～65 ℃時(shí)，GMP(1 mmol/L Zn2+)> GMP(10 mmol/L Zn2+)> GMP(5 mmol/L Zn2+)，并且在添加1 mmol/L Zn2+加熱到40 ℃時(shí)，GMP含量達(dá)到最大值。1 mmol/L Zn2+處理組蝦肉糜的AdR隨溫度的升高緩慢增大，直到85 ℃時(shí)達(dá)到最大值，然后略有下降；5 mmol/L Zn2+處理組蝦肉糜的AdR隨溫度的升高持續(xù)下降，直到95 ℃時(shí)，樣品中無法檢測(cè)到AdR。添加10 mmol/L Zn2+加熱到55 ℃時(shí)，HxR的含量誤差較大(n=4)。其原因有待進(jìn)一步證實(shí)。加熱溫度超過55 ℃后，HxR的含量較低且變化不大。

不同濃度Cu2+處理的蝦肉糜中的核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量變化如圖8所示。3種濃度下的IMP含量均處于較高的水平，分別在加熱到40 ℃(1 mmol/L Cu2+)、85 ℃(5 mmol/L Cu2+)、95 ℃(10 mmol/L Cu2+)達(dá)到最大值，分別為126.5、107.6、119.4 mg/100 g。3個(gè)濃度處理組的AMP的變化趨勢(shì)與IMP大致相同，進(jìn)一步加強(qiáng)了樣品的鮮味和甜味。Hx含量始終很小。對(duì)于低濃度(1 mmol/L)處理組來說，較適宜的加熱溫度為中低溫(40 ℃)，對(duì)于高濃度(5、10 mmol/L)處理組來說，較適宜的加熱條件為高溫(85、95 ℃)。

a-1 mmol/L Zn2+處理組;b-5 mmol/L Zn2+處理組;c-10 mmol/L Zn2+處理組;d-GMP與AdR圖7 Zn2+處理的蝦肉糜中的核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量變化(P<0.05)Fig.7 Changes of the content of NRCs in Zn2+ treated minced shrimp (P<0.05)

a-1 mmol/L Cu2+處理組;b-5 mmol/L Cu2+處理組;c-10 mmol/L Cu2+處理組圖8 Cu2+處理的蝦肉糜中的核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量變化(P<0.05)Fig.8 Changes of the content of NRCs in Cu2+ treated minced shrimp (P<0.05)

不同濃度Al3+處理的蝦肉糜中核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量變化如圖9所示。對(duì)于1 mmol/L Al3+處理組來說，ATP、ADP、GMP、Hx的含量隨通電加熱溫度的升高略有減??；AMP的含量先增大后減小，在75 ℃時(shí)達(dá)到最大值；IMP的含量在通電加熱前的初始溫度4 ℃時(shí)達(dá)到最大值后減小，在25～40 ℃短暫增大后持續(xù)減小。對(duì)于5 mmol/L Al3+處理組，AMP的含量隨著加熱溫度的升高先增大后減小，在65 ℃達(dá)到最大值；IMP的含量隨著溫度增大不斷上下波動(dòng)，在低溫(25 ℃)下，達(dá)到最大值。對(duì)于10 mmol/L Al3+處理組，ATP、ADP、AMP的含量均隨溫度先增大后減小，在65 ℃達(dá)到最大值；IMP的含量先增大后減小，在25 ℃達(dá)到最大值。Al3+處理的蝦肉糜均在較低溫度下達(dá)到較好的風(fēng)味。

不同濃度Fe3+處理的蝦肉糜中核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量變化如圖10所示。1和5 mmol/L Fe3+處理組的IMP含量均在40 ℃達(dá)到最大值，而10 mmol/L Fe3+處理組的IMP含量在85 ℃達(dá)到最大值。3種不同濃度處理組的AMP的含量變化趨勢(shì)基本一致，均隨溫度的升高先增大后減小，分別在75、65、75 ℃達(dá)到最大值。低濃度Fe3+處理組在較低溫度(40 ℃)下獲得最佳風(fēng)味，高濃度Fe3+處理組在高溫(85 ℃)下獲得最佳風(fēng)味。

根據(jù)IMP是水產(chǎn)品中主要的鮮味相關(guān)物質(zhì)，Hx是苦味化合物，以二者含量的差異來確定蝦肉糜的最佳加熱條件。而Hx是首要考慮的滋味指標(biāo)，若通電加熱期間Hx濃度很低且無明顯積累，則該研究才能進(jìn)一步優(yōu)化蝦肉糜中存在的IMP量。經(jīng)金屬離子處理的蝦肉糜在通電加熱下其Hx的TAV變化如表2所示，在通電加熱期間，無論蝦肉糜是否經(jīng)金屬離子處理，Hx的TAV(<0.05)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于1，這表明升高溫度和添加金屬離子都不會(huì)引起蝦肉糜滋味惡化和引起食品安全問題。

a-1 mmol/L Al3+處理組;b-5 mmol/L Al3+處理組;c-10 mmol/L Al3+處理組圖9 Al3+處理的蝦肉糜中的核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量變化 (P<0.05)Fig.9 Changes of the content of NRCs in Al3+ treated minced shrimp (P<0.05)

a-1 mmol/L Fe3+處理組;b-5 mmol/L Fe3+處理組;c-10 mmol/L Fe3+處理組圖10 Fe3+處理的蝦肉糜中的核苷酸及關(guān)聯(lián)產(chǎn)物的含量變化(P<0.05)Fig.10 Changes of the content of NRCs in Fe3+ treated minced shrimp (P<0.05)

表2 經(jīng)金屬離子處理的蝦肉糜在通電加熱下Hx的TAV變化Table 2 TAVs of Hx in the minced shrimp treated with different metal ions during OH

注：同列不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

4種金屬離子處理的蝦肉糜在通電加熱期間其IMP的TAV變化如圖11所示。除Zn2+處理組所有樣品中IMP的TAV均>1，這表明金屬離子處理的蝦肉糜中IMP是其主要的滋味物質(zhì)，對(duì)蝦肉糜的滋味產(chǎn)生明顯影響。

通電加熱過程中，金屬離子促進(jìn)了IMP的產(chǎn)生。三價(jià)離子對(duì)IMP的促進(jìn)作用要大于二價(jià)離子，這可能是因?yàn)槿齼r(jià)離子所帶電荷量更多，從而更增強(qiáng)AMP脫氨酶的活性。5 mmol/L Zn2+對(duì)IMP影響最顯著，且隨著溫度的升高，IMP的TAV增大。1和10 mmol/L Cu2+均表現(xiàn)出高水平的IMP，1 mmol/L Cu2+處理組對(duì)低溫更敏感，而10 mmol/L Cu2+處理組對(duì)高溫更敏感。在低溫(4 ℃)下，1 mmol/L Al3+處理組的IMP水平高于5、10 mmol/L Al3+處理組，而通電加熱后，5 mmol/L Al3+處理組的IMP的TAV最大，10 mmol/L Al3+處理組IMP的TAV最小。除25 ℃，其他溫度條件下，10 mmol/L Fe3+處理組的IMP的TAV均大于1、5 mmol/L Fe3+處理組。通常，不同的金屬離子對(duì)IMP具有不同的影響，除了與AMP脫氨酶活性相關(guān)之外，還可能與金屬離子半徑，電荷密度，蛋白質(zhì)結(jié)合能力和穩(wěn)定性有關(guān)。

a-Zn2+處理組;b-Cu2+處理組;c-Al3+處理組;d-Fe3+處理組圖11 四種金屬離子處理的蝦肉糜在通電加熱期間其IMP的TAV變化Fig.11 TAVs of IMP in the minced shrimp treated with different metal ions during OH注：圖中不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)

與溫度相比，金屬離子(除Zn2+外)對(duì)IMP含量的影響更為明顯。這可能是因?yàn)榻饘匐x子改變了AMP脫氨酶活性位點(diǎn)催化基團(tuán)的構(gòu)象，而加熱對(duì)該酶的作用速率或效果不及金屬離子。金屬離子對(duì)酶的反應(yīng)速率有可能比熱效應(yīng)的反應(yīng)速率更快。另外，金屬離子可能會(huì)增加AMP脫氨酶活性隨溫度變化的穩(wěn)定性。

基于IMP量先確定最佳金屬離子再選擇最佳加熱溫度。將整個(gè)加熱過程劃分成低溫區(qū)(25、40、55、65 ℃)和高溫區(qū)(75、85、95 ℃)。在某些處理組中低溫范圍內(nèi)IMP的產(chǎn)生量略高于高溫區(qū)，但更高的溫度似乎更有利于抑制微生物生長并確保產(chǎn)品安全。因此，優(yōu)先考慮高溫處理組中IMP滋味的影響。在本研究中，10 mmol/L Fe3+處理組IMP的TAV最大，在85 ℃達(dá)到最大值8.06，對(duì)凡納濱對(duì)蝦的滋味貢獻(xiàn)最明顯。

3 結(jié)論

通電加熱中頻率、溫度和金屬離子添加物的種類及濃度均會(huì)影響凡納濱對(duì)蝦的電導(dǎo)率。電導(dǎo)率與頻率呈對(duì)數(shù)關(guān)系，在低于65 ℃下與溫度呈線性關(guān)系(P<0.05)；添加金屬離子，電導(dǎo)率增大，10 mmol/L Fe3+處理的樣品電導(dǎo)率最大。通電加熱有利于蝦(未添加金屬離子)鮮味的產(chǎn)生和保持；高溫會(huì)積累AdR，通電加熱純蝦肉糜(未添加金屬離子)的溫度應(yīng)控制在55～65 ℃之間。水產(chǎn)品中ATP降解途徑的研究為控制水產(chǎn)品的加工及貯藏過程、條件提供了理論依據(jù)，以便優(yōu)化加工貯藏條件，獲得滋味良好的水產(chǎn)品。在本研究中添加金屬離子會(huì)改變凡納濱對(duì)蝦中ATP的降解途徑，對(duì)照組(純蝦肉糜)與Zn2+處理組ATP降解途徑有2種，分別為IMP途徑：ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx與AdR途徑：ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx→Ad，Cu2+、Al3+和Fe3+處理組ATP降解途徑為IMP途徑ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx。金屬離子處理的蝦肉糜不同加熱溫度下均產(chǎn)生大量IMP和少量Hx，有利于蝦鮮味的形成；添加10 mmol/L Fe3+通電加熱至85 ℃是一種較理想的處理方式，凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)生更多鮮味。