大豆不溶性膳食纖維體外發(fā)酵產(chǎn)短鏈脂肪酸的研究

王賁香，賀陽，蔣海芹，文連奎*

1(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春，130118) 2(市場監(jiān)督管理局，河北 唐山，063200)

膳食纖維被稱為第七大營養(yǎng)素[1]。豆渣中膳食纖維含量可達(dá)50%～60% (干基)，分為可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維，其中不溶性膳食纖維含量占總膳食纖維的90%[2-3]，多作為廢物被丟掉或用作飼料，其營養(yǎng)價(jià)值沒有得到充分利用。因此，對(duì)大豆不溶性膳食纖維 (soybean insoluble dietary fiber, SIDF) 的開發(fā)和利用具有重要意義。

腸道菌群是人體生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，可調(diào)節(jié)人體健康[4]。膳食纖維不能在體內(nèi)消化吸收，大部分直接到達(dá)大腸 (盲腸和結(jié)腸) 中，可被腸道菌群發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸 (short-chain fatty acids, SCFAs)，如乙酸，丙酸，丁酸等[5-7]，可調(diào)節(jié)腸道內(nèi)的pH，對(duì)腸道上的致病菌有抑制作用[8-9]，并可為結(jié)腸細(xì)胞提供能量[10-12]，除了可以作為能源外，還可以激活G蛋白偶聯(lián)受體，充當(dāng)信號(hào)分子并調(diào)節(jié)宿主中的不同生物過程[13-14]，在調(diào)節(jié)宿主代謝[15-17]、免疫系統(tǒng)和細(xì)胞增殖中具有關(guān)鍵作用[18-20]，并可促進(jìn)腸道健康進(jìn)而維持人體健康[21-22]。吳洪斌等[23]發(fā)現(xiàn)體外發(fā)酵番茄皮膳食纖維可產(chǎn)生SCFAs；趙蘭濤[24]對(duì)燕麥、大麥中的膳食纖維進(jìn)行體外發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)SCFAs的濃度在發(fā)酵10 h后顯著增加。陳雷[25]體外發(fā)酵苦蕎粉，產(chǎn)生的SCFAs中乙酸含量最大。目前，對(duì)SIDF體外發(fā)酵的研究鮮有報(bào)道。

本文探究4種外源菌不同時(shí)間體外發(fā)酵SIDF的pH變化及產(chǎn)生SCFAs的含量變化。為體內(nèi)發(fā)酵SIDF調(diào)節(jié)腸道健康和SIDF開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SIDF，本實(shí)驗(yàn)室提取得到。兩歧雙歧桿菌 (Bifidobacteriumbifidum) BNCC186304、糞腸球菌(Enterococcusfaecalis) BNCC102668，北納生物科技有限公司；乳桿菌 (Lactobacillus) LP5，大腸桿菌 (Escherichiacoli) ATCC 25922，為實(shí)驗(yàn)室留存。LB培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、BBL培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DG250厭氧工作站，英國Don Whitely Scientific；BXM-30R立式電熱壓力蒸汽鍋、YP4002電子分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；LXJ-IIB離心機(jī)，上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺(tái)，上海析域儀器設(shè)備有限公司；GC-2010plus氣相色譜儀，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化及計(jì)數(shù)

將保存在甘油的乳酸桿菌LP5、大腸桿菌ATCC25922以體積分?jǐn)?shù)5%接種量接到相應(yīng)培養(yǎng)基上進(jìn)行活化(表1)。兩歧雙歧桿菌BNCC186304、糞腸球菌BNCC102668為凍干菌粉，在超凈臺(tái)內(nèi)用體積分?jǐn)?shù)75%酒精擦拭管壁，在火焰上灼燒上部后迅速滴加無菌水后用鑷子敲碎，然后取400 μL相應(yīng)培養(yǎng)基加入凍干菌粉管中輕輕吹打至完全溶解，成懸浮狀態(tài)，將其全部加入10 mL相應(yīng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件見表1。每種菌種活化3次，平板涂布計(jì)算菌落數(shù)后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 菌種培養(yǎng)基類型及培養(yǎng)條件Table 1 Media types and culture conditions of bacteria

1.3.2 體外發(fā)酵

取SIDF 250 mg，活化后的菌種1.5 mL加入到厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基 (30 mL) 中，以不加SIDF組為對(duì)照，在37 ℃，厭氧工作站中厭氧發(fā)酵48 h，分別在發(fā)酵的0、6、12、24、48 h取發(fā)酵液分別進(jìn)行pH、SCFAs的測定，分析不同菌種在不同發(fā)酵時(shí)間發(fā)酵液的pH變化以及產(chǎn)生SCFAs含量的變化。

1.3.3 pH測定

分別在發(fā)酵的0、6、12、24、48 h取發(fā)酵液，在4 500 r/min的條件下離心15 min，離心后進(jìn)行pH的測定。

1.3.4 SCFAs測定

取各個(gè)時(shí)間段的發(fā)酵液1 mL加入0.2 mL偏磷酸(體積分?jǐn)?shù)25%)于1.5 mL離心管中，渦旋2 min，充分混合均勻后，在10 000 r/min 條件下離心15 min，離心后取上清，通過0.22 μm濾膜后上機(jī)檢測。采用外標(biāo)法進(jìn)行SCFAs測定。

氣相色譜條件：檢測器FID，色譜柱Nukol (30 m×0.32 mm×0.25 μm) 毛細(xì)管柱。測定條件：載氣N2流速為75 mL/min； H2流速為70 mL/min；空氣流速為50 mL/min，進(jìn)樣量體積為1 μL。進(jìn)樣口溫度為220 ℃；檢測器溫度250 ℃，升溫程序：60 ℃，以20 ℃/min 升到190 ℃，保持3 min，分流比20∶1。

圖1 短鏈脂肪酸氣相色譜圖Fig.1 The gas chromatogram of SCFAs

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 原菌液菌落數(shù)

原菌液菌落數(shù)如表2所示。

表2 外源菌活菌數(shù)Table 2 Viable counts of exogenous bacteria

2.2 發(fā)酵液中pH變化

2.2.1 乳酸桿菌體外發(fā)酵的pH變化

由圖2可以看出，乳酸桿菌 (Lacto.) 組和Lacto.+SIDF組發(fā)酵液的pH在0～6 h急劇下降，Lacto.從6.71下降到5.05，Lacto.+SIDF組從6.70下降至4.98，這主要是因?yàn)樵?～6 h乳桿菌利用厭氧培養(yǎng)基中大量的碳源產(chǎn)酸使pH急劇下降，Lacto.組在12 h時(shí)pH達(dá)到最低為4.91，之后pH基本恒定。而Lacto.+SIDF組在24 h時(shí)達(dá)到最低為4.49，Lacto.+SIDF組pH顯著低于Lacto.組 (P<0.05)，說明乳酸桿菌利用SIDF 發(fā)酵產(chǎn)酸。

圖2 乳桿菌體外發(fā)酵SIDF的pH變化Fig.2 Changes of pH in vitro fermentation by Lacto.

2.2.2 兩歧雙歧桿菌體外發(fā)酵的pH變化

由圖3可知，兩歧雙歧桿菌 (Bifido.) 組和Bifido.+SIDF組發(fā)酵液的pH在0～12 h急劇下降，Bifido.組從6.37下降到3.54，Bifido.+SIDF組從6.28下降至3.51，Bifido.在12 h時(shí)pH達(dá)到最低為3.54，12 h之后發(fā)酵穩(wěn)定，而Bifido.+SIDF組在48 h時(shí)達(dá)到最低為3.29，兩歧雙歧桿菌發(fā)酵液的最低pH比乳酸桿菌發(fā)酵液低，這說明兩歧雙歧桿菌利用SIDF產(chǎn)酸比乳酸桿菌發(fā)酵SIDF產(chǎn)生的酸多。

圖3 兩歧雙歧桿菌桿菌體外發(fā)酵的pH變化Fig.3 Changes of pH in vitro fermentation by Bifido.

2.2.3 糞腸球菌體外發(fā)酵的pH變化

由圖4可見，糞腸球菌 (Entero.) 組和Entero. + SIDF組發(fā)酵液的pH在0～12 h變化趨勢與兩歧雙歧桿菌發(fā)酵液變化相似。當(dāng)發(fā)酵到24 h，Entero.+SIDF組pH顯著低于Entero.組 (P<0.05)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，Entero.+SIDF組pH持續(xù)下降，在48 h達(dá)到最低為4.36，其最低pH比兩歧雙歧桿菌高，這說明其產(chǎn)酸沒有兩歧雙歧桿菌發(fā)酵SIDF產(chǎn)酸多。發(fā)酵24 h后Entero.組pH值略有上升趨勢，這主要是Entero.組隨著發(fā)酵時(shí)間延長將碳源全部利用完畢，發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物增多，菌體死亡并產(chǎn)生菌體自溶，使pH略有上升。

圖4 糞腸球菌體外發(fā)酵的pH變化Fig.4 Changes of pH in vitro fermentation by Entero.

2.2.4 大腸桿菌體外發(fā)酵的pH變化

由圖5可知，大腸桿菌 (Escher.) 組和Escher.+SIDF組發(fā)酵液的pH在0～6 h急劇下降，Escher.組從7.35下降到5.27，Escher.+SIDF組從7.36下降至5.13，這主要是因?yàn)樵?～6 h大腸桿菌利用厭氧培養(yǎng)基中大量的碳源使pH急劇下降，在發(fā)酵24 h，2組發(fā)酵液的pH基本保持恒定，Escher.組在48 h時(shí)pH達(dá)到最低為4.68，而Escher.+SIDF組在48 h時(shí)達(dá)到最低為4.59；大腸桿菌發(fā)酵的最低pH比糞腸球菌最低pH高，這說明大腸桿菌發(fā)酵SIDF產(chǎn)生的酸沒有糞腸球菌發(fā)酵產(chǎn)酸多。Escher.+SIDF組pH顯著低于Escher.組 (P<0.05)。Escher.組在發(fā)酵12 h之后，pH有所上升，這主要是因?yàn)榇竽c桿菌充分利用了培養(yǎng)基中的碳源后產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，利用蛋白質(zhì)等物質(zhì)，使pH有上升趨勢[12]，Escher.+SIDF組pH在發(fā)酵12 h后仍繼續(xù)下降。

圖5 大腸桿菌體外發(fā)酵的pH變化Fig.5 Changes of pH in vitro fermentation by Escher.

2.2.5 外源菌體外發(fā)酵SIDF的pH變化

4種外源菌體外發(fā)酵SIDF的發(fā)酵液pH變化如圖6所示。乳酸桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌發(fā)酵液pH在12 h時(shí)相近，分別為(4.62±0.04)、(4.64±0.05)、(4.68±0.06)，隨著發(fā)酵時(shí)間的增長，變化趨勢平穩(wěn)，pH值最低分別為(4.49±0.06)、(4.36±0.05)、(4.59±0.05)，與另外3種外源菌相比，兩歧雙歧桿菌在發(fā)酵過程中pH變化最大，最低pH值為(3.29±0.05)。這說明兩歧雙歧桿菌發(fā)酵SIDF產(chǎn)生的酸最多。

圖6 四種外源菌體外發(fā)酵SIDF的pH變化Fig.6 Changes of pH in vitro fermentation of SIDFby 4 exogenous intestinal bacteria

2.3 不同外源菌及不同發(fā)酵時(shí)間產(chǎn)SCFAs變化

乙酸、丙酸、丁酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表3。

表3 短鏈脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)方程Table 3 Standard equation of SCFAs

2.3.1 乳酸桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)SCFAs

由圖7-a和圖7-c可以看出，各組乙酸、丁酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間延長而逐漸增加，在48 h時(shí)Lacto.+SIDF組含量達(dá)到最大，分別為(1.19±0.015)、(0.082±0.001)g/L，在發(fā)酵24 h產(chǎn)生的丙酸最多，為(0.12±0.002)g/L(圖7-b)；SCFAs總的含量在發(fā)酵48 h達(dá)到最大為(1.35±0.031)g/L (圖7-d)，乳酸桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸含量最多，丙酸次之，丁酸最少。發(fā)酵的整個(gè)過程中，Lacto.與Lacto.+SIDF組相比產(chǎn)生的SCFAs具有顯著性差異 (P<0.05)。在發(fā)酵48 h時(shí)，乙酸和丁酸含量最大，連曉蔚等[26]利用低聚麥芽糖體外發(fā)酵，在24 h時(shí)乙酸、丁酸含量最高，本研究延長了發(fā)酵時(shí)間，在發(fā)酵48 h乙酸、丁酸含量最大。在發(fā)酵48 h時(shí)，丙酸含量大幅減少，可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的增加丙酸不再產(chǎn)生并發(fā)生揮發(fā)所致。

2.3.2 兩歧雙歧桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)SCFAs

由圖8-a和圖8-b可以看出，Bifido.+SIDF在發(fā)酵24 h時(shí)乙酸、丙酸含量達(dá)到最大，分別為(4.05±0.024)、(0.13±0.014)g/L；丁酸在發(fā)酵48 h含量最高為(0.024±0.000 4)g/L (圖8-c)。兩歧雙歧桿菌發(fā)酵SIDF產(chǎn)生的總SCFAs在24 h時(shí)達(dá)到最大為(4.20±0.11)g/L (圖8-d)。在整個(gè)發(fā)酵過程中，Bifido.與Bifido.+SIDF組產(chǎn)生的SCFAs具有顯著性差異 (P<0.05)。兩歧雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的總SCFAs最大值比乳酸桿菌大。發(fā)酵時(shí)間24～48 h，乙酸、丙酸含量大幅下降，乙酸、丙酸隨著發(fā)酵時(shí)間的增加不再產(chǎn)生并發(fā)生揮發(fā)所致。這與劉露等[27]報(bào)道的結(jié)果相似。丁酸在此過程中繼續(xù)產(chǎn)生，丁酸含量累積增加。

2.3.3 糞腸球菌體外發(fā)酵產(chǎn)SCFAs

由圖9-a可以看出，乙酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，其含量逐漸積累，在48 h時(shí)達(dá)到最大為(0.49±0.011)g/L，在6 h時(shí)，Entero.+SIDF組丙酸 (圖9-b) 開始產(chǎn)生，而Entero.組在24 h才開始產(chǎn)生丙酸，

圖7 乳酸桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)SCFAs含量Fig.7 Production of SCFAs by Lacto.注：同一時(shí)間不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

圖8 兩歧雙歧桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)SCFAs含量Fig.8 Production of SCFAs by Bifido

在發(fā)酵48 h時(shí)Entero.+SIDF組丙酸含量達(dá)到最大為(0.07±0.003)g/L，如圖9-c所示，Entero.組丁酸在12 h產(chǎn)生，而Entero.+SIDF組在6 h時(shí)開始產(chǎn)生丁酸，并隨著時(shí)間積累逐漸增多，在48 h時(shí)達(dá)到最多為(0.013±0.001 4)g/L；如圖9-d所示，在發(fā)酵48 h時(shí)Entero.+SIDF組總SCFAs含量為(0.57±0.026)g/L。糞腸球菌發(fā)酵產(chǎn)生的總SCFAs最大值沒有兩歧雙歧桿菌大。

2.3.4 大腸桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)SCFAs

由圖10-a可以看出，2組乙酸都是在發(fā)酵6 h時(shí)開始產(chǎn)生，在48 h達(dá)到最大，Escher.+SIDF組為(1.06±0.021)g/L；在0～24 h內(nèi)，Escher.組沒有產(chǎn)生丙酸 (圖10-b)，Escher.+SIDF在24 h時(shí)丙酸含量最大為(0.006±0.000 3)g/L；Escher.+SIDF組在24 h產(chǎn)生的丁酸最多為(0.006±0.000 8)g/L (圖10-c)；整個(gè)發(fā)酵過程中，48 h時(shí)總SCFAs最多為(1.07±0.031)g/L (圖10-d)。大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的總SCFAs最大值比糞腸球菌大。有文獻(xiàn)報(bào)道[28-29]，體外發(fā)酵淀

圖9 糞腸球菌體外發(fā)酵產(chǎn)SCFAsFig.9 Production of SCFAs by Entero.

圖10 大腸桿菌體外發(fā)酵產(chǎn)SCFAsFig.10 Production of SCFAs by Escher.

粉產(chǎn)生乙酸的含量最高，這與本研究相一致；彭喜春等[30]利用直腸菌群體外發(fā)酵麥麩和甘蔗渣2種不溶性膳食纖維產(chǎn)丙酸含量最大，與本研究不一致，這可能是菌群種類不同，發(fā)酵的纖維不同所致。

2.3.5 外源菌體外發(fā)酵產(chǎn)SCFAs

4種外源菌發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs中乙酸均為最高，丁酸最低。乳酸桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌在發(fā)酵0～48 h，產(chǎn)生的乙酸含量隨時(shí)間增加而增大，在48 h達(dá)到最大，兩歧雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸含量先增加后減少，與另外3種外源菌相比，兩歧雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、丙酸含量最多，在24 h達(dá)到最大分別為(4.05±0.024)、(0.13±0.014)g/L (圖11-a、b)，乳酸桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的丁酸最多為(0.082±0.001)g/L (圖11-c)。兩歧雙歧桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的總SCFAs最多，在發(fā)酵24 h時(shí)產(chǎn)量最大為(4.20±0.11)g/L，兩歧雙歧桿菌發(fā)酵SIDF產(chǎn)生SCFAs能力最強(qiáng)，糞腸球菌發(fā)酵產(chǎn)SCFAs能力最弱 (圖11-d)。

3 結(jié)論與討論

本研究以乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、大腸桿菌、糞腸球菌4種外源菌體外發(fā)酵SIDF，從單一菌群角度研究發(fā)酵過程中的pH變化、SCFAs含量，發(fā)現(xiàn)4種外源菌發(fā)酵SIDF都可使pH降低，產(chǎn)生SCFAs。但是，在pH最低時(shí)，產(chǎn)生的SCFAs并不是最高，這說明菌群發(fā)酵SIDF產(chǎn)生多種酸，不僅是SCFAs。試驗(yàn)中還存在不足，比如單一菌群雖然能清楚表現(xiàn)出產(chǎn)生SCFAs的總類和含量，但沒能體現(xiàn)腸道菌群的多樣性，體內(nèi)發(fā)酵SIDF可能更好地調(diào)節(jié)腸道健康，更深入地研究多菌群試驗(yàn)將進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)研究。

圖11 外源菌發(fā)酵SIDF產(chǎn)短鏈脂肪酸Fig.11 SIDF was fermented in vitro by exogenous intestinal bacteria to produce SCFAs

試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸桿菌、兩歧雙歧桿菌、大腸桿菌、糞腸球菌4種外源菌可體外發(fā)酵SIDF使pH降低。兩歧雙歧桿菌發(fā)酵液中pH最低。兩歧雙歧桿菌在發(fā)酵24 h 產(chǎn)乙酸、丙酸含量最多，分別為(4.05±0.024)、(0.13±0.014)g/L。乳酸桿菌在發(fā)酵24 h時(shí)，產(chǎn)生的丁酸最多為(0.082±0.001)g/L。整個(gè)發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的乙酸含量最大，大腸桿菌產(chǎn)生的丁酸比丙酸含量多，而其他3種菌產(chǎn)生的丁酸含量比丙酸少。兩歧雙歧桿菌發(fā)酵SIDF產(chǎn)SCFAs能力最強(qiáng)。SIDF可通過外源菌群體外發(fā)酵產(chǎn)生對(duì)人體有益的SCFAs，使發(fā)酵液的pH發(fā)生變化，這可為SIDF在體內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生有益的SCFAs奠定基礎(chǔ)。