牛血清蛋白與鄰苯二酚、間苯三酚相互作用的機(jī)理探究

褚千千，艾健，方佳琪，韓秋煜，包斌，2*，孫永軍

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(上海海洋大學(xué))，上海，201306) 3(好當(dāng)家集團(tuán)有限公司，山東 榮成，264305)

蛋白質(zhì)不僅為人類提供了必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并且在食品加工中具有膠凝、乳化、起泡、水結(jié)合等多種功能性質(zhì)[1-3]。一些蛋白質(zhì)由于受固有結(jié)構(gòu)的限制，導(dǎo)致其功能性質(zhì)缺乏，或者由于環(huán)境條件變化、食品加工處理，功能性質(zhì)也會(huì)受到負(fù)面影響[4-6]。為了改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，可以在含蛋白質(zhì)食品中添加一些外源性成分，以更好地滿足加工業(yè)的需求，例如酚類化合物、淀粉、非肌肉蛋白、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等[7-9]。酚類化合物由于具有抗氧化、抗糖尿病、抗腫瘤等多種生物活性[9-10]，而被應(yīng)用于食品、藥品中。一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)植物多酚提取物可以作為魚糜凝膠的增強(qiáng)劑[10-13]，改善魚糜制品的口感和質(zhì)地。PRIGENT等[14]發(fā)現(xiàn)原花青素可以改善球蛋白(牛血清蛋白、溶菌酶、α-乳白蛋白)的泡沫穩(wěn)定性。ALU′DATT等[15]研究發(fā)現(xiàn),從亞麻籽蛋白質(zhì)分離物中去除游離和結(jié)合的酚類化合物降低了亞麻籽蛋白的熱穩(wěn)定性、持水性和黏彈性。

近年來關(guān)于酚類化合物與蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理逐漸成為研究熱點(diǎn)，有學(xué)者探究了氧化的單寧酸、阿魏酸、綠原酸、沒食子酸等與蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)合[16-18]，推測(cè)這些酚類化合物被氧化后可以形成相應(yīng)的醌類物質(zhì)，氨基酸側(cè)鏈和醌之間的反應(yīng)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子聚合，從而形成復(fù)合物，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)功能性質(zhì)[19]。也有學(xué)者提出酚類化合物也可以與蛋白質(zhì)發(fā)生非共價(jià)相互作用[20-21]，徐潔瓊等[22]探究了熱加工處理對(duì)β-乳球蛋白與酚酸(綠原酸、咖啡酸、阿魏酸)間相互作用的影響。

前期有研究表明，褐藻多酚提取物能夠提高魚糜凝膠的破斷力和凝膠強(qiáng)度[23]，說明褐藻多酚和魚糜蛋白質(zhì)發(fā)生了反應(yīng)。褐藻多酚是間苯三酚的脫氫聚合物，有時(shí)帶有額外的鹵素或羥基[24]。為了進(jìn)一步研究褐藻多酚與蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)機(jī)理，本文選擇其單體酚——間苯三酚 (m-trihydroxybenzene，MP) 作為研究對(duì)象，同時(shí)選擇與間苯三酚結(jié)構(gòu)相近的鄰苯二酚(o-dihydroxybenzene，OP) 作為比較。RAWEL等[25]提出，牛血清蛋白 (bovine serum protein，BSA)由于具有較高的分子量，并且可以與酚類化合物形成可溶性復(fù)合物，適合用于這類機(jī)理的研究。因而本文先將OP、MP進(jìn)行氧化，將氧化和未氧化的OP、MP與BSA進(jìn)行反應(yīng)，從共價(jià)相互作用和非共價(jià)相互作用2個(gè)角度比較研究BSA與鄰苯二酚、間苯三酚相互作用的機(jī)理，以期為酚類化合物在開發(fā)健康和營(yíng)養(yǎng)食品中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

BSA(優(yōu)級(jí)純)，上海美倫生物科技有限公司；OP、MP，均為優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三硝基苯磺酸(trinitro-benzene-sulfonic acid, TNBS)，美國(guó)Sigma公司；L-亮氨酸、NaCl、尿素、溴化鉀、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、NaHSO3，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2-硝基苯甲酸、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)，分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司。

UV1102紫外分光光度計(jì)，上海譜元儀器有限公司； Synergy2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；96孔酶標(biāo)板，上?？祵幱邢薰?；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，深圳市超杰生物科技有限公司；真空冷凍干燥機(jī)、NICOLET iS5傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)，美國(guó)Thermo公司；高速冷凍離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Chirascan圓二色譜(circular dichroism, CD)，英國(guó)Leatherhead公司；差示掃描量熱儀 (differential scanning calorimeter, DSC)，美國(guó)TA儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酚類化合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物的制備

參考RAWEL等[26]的方法制備酚類化合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物，略有改動(dòng)。

氧化鄰苯二酚-牛血清蛋白 (OOP-BSA)、氧化間苯三酚-牛血清蛋白 (OMP-BSA) 復(fù)合物的制備：將10 g/L的鄰苯二酚、間苯三酚水溶液用NaOH調(diào)pH為9，暴露于空氣中在 25 ℃的條件下連續(xù)攪拌氧化24 h。分別取2 mL氧化的鄰苯二酚、間苯三酚水溶液加入到20 mL 1 mg/mL的BSA水溶液中，反應(yīng)2 h。

鄰苯二酚-牛血清蛋白(OP-BSA)、間苯三酚-牛血清蛋白(MP-BSA) 復(fù)合物的制備：分別取2 mL 10 g/L的鄰苯二酚、間苯三酚水溶液加入到20 mL 1 mg/mL的BSA水溶液中，加入液體石蠟液封以隔絕氧氣，反應(yīng)2 h。

對(duì)照組：取2 mL 超純水加入到20 mL 1 mg/mL的BSA水溶液中。

將上述反應(yīng)后的復(fù)合物及對(duì)照組透析24 h，每隔4 h換一次水，以除去未反應(yīng)的酚類化合物。取一部分透析液進(jìn)行真空冷凍干燥，備用。剩下的透析液用做液體樣品。

1.2.2 游離氨基含量的測(cè)定

參照CROWELL[27]采用TNBS的方法測(cè)定樣品中游離氨基含量的變化，略有改動(dòng)。取待測(cè)溶液125 μL，加入1 mL pH 8.2的磷酸緩沖溶液及1 mL 1 g/L TNBS，將混合好的樣品置于50 ℃的暗處搖勻1 h。將樣品取出后加入2 mL 0.1 mol/L的NaHSO3，至于暗處，30 min后于420 nm下測(cè)吸光值。以0.1～0.5 mmol/L 濃度的L-亮氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線來定量游離氨基含量。

1.2.3 巰基含量的測(cè)定

參照BEVERIDGE等[28]的方法，準(zhǔn)確稱取0.4 g DTNB于100 mL Tirs-Gly緩沖溶液 (每升溶液含10.4 g Tirs，6.9 g Gly，1.2 g EDTA，pH 8) 中，配制成4 mg/mL的Ellman’s試劑。取0.5 mL樣品加入2 mL 8 mol/L尿素 (溶于Tirs-Gly緩沖溶液) 及40 μL Ellman’s試劑，在室溫下放置1 h后于412 nm處測(cè)吸光度，巰基的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：S,疏基含量，μmol/g;73.53來自106/(1.36×104)，106表示從摩爾基礎(chǔ)到μmol/mL基礎(chǔ)以及從mg固體到g固體的轉(zhuǎn)化率，1.36×104是摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm);D,稀釋倍數(shù);ρ,蛋白質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.4 OP、MP與BSA非共價(jià)相互作用力的測(cè)定

離子鍵的含量以溶解于A、B溶液中蛋白質(zhì)含量之差來表示；氫鍵以溶解于B、C溶液中蛋白質(zhì)的含量之差來表示；疏水性相互作用以溶解于C、D溶液中蛋白質(zhì)的含量之差來表示。

1.2.5 表面疏水性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[30]的方法，略有改動(dòng)。以ANS試劑為熒光探針，將樣品用磷酸緩沖液 (0.01 mol/L，pH 7.0) 稀釋為5個(gè)蛋白終濃度 (0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mg/mL)。取2 mL上述稀釋液加入40 μL 8 mmol/L ANS溶液，室溫下放置15 min。用 Synergy 2多功能酶標(biāo)儀在激發(fā)光波長(zhǎng)360 nm、發(fā)射光波長(zhǎng)460 nm下測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度。同時(shí)，分別以相同濃度的鄰苯二酚、間苯三酚溶液作為試劑空白。最后，以熒光強(qiáng)度對(duì)BSA濃度作圖進(jìn)行線性分析，所得曲線斜率即為該樣品的蛋白質(zhì)表面疏水性。

1.2.6 酚類化合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物構(gòu)象的表征

1.2.6.1 傅里葉變換紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法進(jìn)行FTIR分析。分別取凍干后的對(duì)照組樣品和復(fù)合物1 mg加入適量的KBr，用瑪瑙研缽研磨成均勻細(xì)粉狀，壓片。掃描條件：波數(shù)范圍4 000～650 cm-1，次數(shù)16 次，分辨率為4 cm-1。采用KBr做空白對(duì)照，每個(gè)樣品在相同條件下重復(fù)3次取平均值。

使用OMNIC 9軟件, 對(duì)樣品譜圖進(jìn)行修整校正。剪切蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶 (1 600～1 700 cm-1) 的數(shù)據(jù)在Peakfit 4.12軟件中進(jìn)行基線校正，去卷積，采用Gausse函數(shù)進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合，直至擬合相關(guān)系數(shù)R2≥0.99, 且穩(wěn)定不再變化, 確定各子峰與各二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系, 計(jì)算各子峰面積的相對(duì)百分含量。

1.2.6.2 圓二色譜分析

通過圓二色譜儀對(duì)酚類化合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。測(cè)定在室溫且持續(xù)通氮?dú)獾臈l件下進(jìn)行，掃描速度100 nm/min，帶寬1.0 nm,路徑長(zhǎng)度0.5 mm。將樣品濃度稀釋到0.1 mg/mL，在190～260 nm范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，平均測(cè)定3次。

1.2.6.3 變性溫度分析

采用差式掃描量熱法，參考曹艷蕓[31]的方法，稱取 5 mg 左右凍干的對(duì)照組樣品和復(fù)合物，置于鋁制坩堝中。加熱溫度范圍為20～120 ℃，升溫速率為10 ℃/min?？諛悠粉釄遄鳛榭瞻讓?duì)照。用 Universal analysis分析軟件 (TA公司) 計(jì)算樣品在升溫過程中的最大轉(zhuǎn)變溫度。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)與分析

本文實(shí)驗(yàn)所有樣品均為3組平行。作圖采用OriginPro 9.1軟件，采用SPSS statistic 22.0進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 鄰苯二酚和間苯三酚對(duì)BSA游離氨基和巰基的影響

BSA與酚類化合物反應(yīng)前后游離氨基和巰基含量如表1所示。與對(duì)照相比，OOP-BSA、OMP-BSA復(fù)合物中游離氨基和巰基的含量均顯著降低(P<0.05)，并且OOP-BSA的降低量大于OMP-BSA。說明氧化的鄰苯二酚、間苯三酚與牛血清蛋白的游離氨基、巰基發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，而且該反應(yīng)與酚羥基的反應(yīng)活性有關(guān)。OP由于其羥基取代的高反應(yīng)性，很容易被氧化，在O2存在的堿性條件下即可進(jìn)行自動(dòng)氧化[32]。OP被氧化成相應(yīng)的鄰苯二醌，醌是一種反應(yīng)性親電子中間體，可能會(huì)和BSA氨基酸側(cè)鏈中的游離氨基、巰基發(fā)生反應(yīng)，形成C—N或C—S共價(jià)鍵。氨基酸側(cè)鏈和醌之間的反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的聚合，從而形成復(fù)合物[33]。但是對(duì)于間苯三酚來說，MP不能被氧化成相應(yīng)的醌，而是形成了半醌自由基[34]，半醌自由基可以攻擊親核反應(yīng)配偶體，從而和BSA的游離氨基、巰基反應(yīng)，形成復(fù)合物。半醌自由基的反應(yīng)活性低于醌，因而導(dǎo)致OOP-BSA復(fù)合物游離氨基和巰基較BSA的降低量大于OMP-BSA復(fù)合物。RAWEL等[35]比較了鄰苯二酚、間苯二酚與溶菌酶的共價(jià)反應(yīng)活性，結(jié)果顯示鄰苯二酚的反應(yīng)活性更高。對(duì)于未氧化的鄰苯二酚和間苯三酚而言，OP-BSA、MP-BSA復(fù)合物中游離氨基和巰基的含量較對(duì)照均沒有顯著性變化(P<0.05)，進(jìn)一步說明了酚類化合物只有在被氧化形成醌或半醌自由基后才能與蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)反應(yīng)。

表1 BSA及其復(fù)合物的游離氨基與巰基含量(n=3)Table 1 Free amino and sulfhydryl content of BSA andits complexes

2.2 鄰苯二酚、間苯三酚與BSA之間的非共價(jià)相互作用力分析

KANG等[36]提出綠原酸和阿魏酸與人血清蛋白的非共價(jià)相互作用主要包括芳香環(huán)與疏水氨基酸殘基之間的疏水力，羧酸鹽基團(tuán)與堿性氨基酸殘基之間的靜電力以及羥基與多肽鏈之間的氫鍵。鑒于未氧化的OP、MP不能和BSA發(fā)生共價(jià)相互作用，因而對(duì)OP、MP和BSA之間的非共價(jià)相互作用進(jìn)行探究 (圖1)。酚類化合物和蛋白質(zhì)之間的非共價(jià)相互作用包括5種類型：氫鍵，疏水相互作用，靜電相互作用，范德華力和離子鍵[37]。其中氫鍵和疏水相互作用被認(rèn)為是酚類化合物和蛋白質(zhì)之間相互作用的主要驅(qū)動(dòng)力[38]。從圖1可見，和對(duì)照相比，OP-BSA、MP-BSA離子鍵沒有顯著變化(P<0.05)，說明OP、MP未與BSA形成新的離子鍵。氫鍵含量顯著升高(P<0.05)，并且MP-BSA的增加量大于OP-BSA。因?yàn)榉踊鶊F(tuán)是一種優(yōu)良的氫供體，很容易與蛋白質(zhì)的羧基形成氫鍵，從而導(dǎo)致OP-BSA、MP-BSA復(fù)合物中氫鍵含量升高，并且間苯三酚的羥基數(shù)量大于鄰苯二酚，因而與BSA形成更多的氫鍵。OP-BSA的疏水相互作用較對(duì)照顯著提高(P<0.05)，而MP-BSA的疏水相互作用顯著下降。酚類化合物中的芳基和BSA分子內(nèi)部的疏水性基團(tuán)發(fā)生聚集，降低了其結(jié)合水的能力，疏水相互作用增強(qiáng)[39]，而MP由于含有較多的羥基，羥基是一種親水性基團(tuán)，羥基的親水性可能會(huì)阻礙芳基和BSA疏水性基團(tuán)的聚集，也可能是氫鍵成為了MP和BSA之間相互作用的主要驅(qū)動(dòng)力，因而導(dǎo)致MP-BSA中疏水相互作用降低。

圖1 鄰苯二酚、間苯三酚與BSA的非共價(jià)相互作用Fig.1 Effect of OP and MP on the interaction force of BSA注：上標(biāo)不同字母表示顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 鄰苯二酚、間苯三酚對(duì)BSA表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)的表面疏水性變化可以反映蛋白質(zhì)與水、其他化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生作用時(shí)的實(shí)際情況[40]。氧化與未氧化的鄰苯二酚、間苯三酚對(duì)BSA表面疏水性的影響如圖2所示，與對(duì)照相比，OP、MP、OOP、OMP的引入都會(huì)使BSA的表面疏水性顯著降低 (P<0.05)，這說明酚類化合物與BSA的疏水性氨基酸發(fā)生了反應(yīng)。RAWEL等[41]討論了氧化鄰苯二酚在色氨酸的雜環(huán)N-原子上發(fā)生反應(yīng)的可能性，證實(shí)了酚類化合物被氧化成醌后和蛋白質(zhì)色氨酸發(fā)生了共價(jià)反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)表面疏水性降低。而未氧化的酚類化合物的氫原子也很容易和色氨酸的氮原子形成分子間氫鍵，發(fā)生非共價(jià)相互作用。圖2顯示OOP-BSA、OMP-BSA復(fù)合物的表面疏水性顯著低于OP-BSA、MP-BSA復(fù)合物，說明相較非共價(jià)反應(yīng)，蛋白質(zhì)如果與酚類化合物發(fā)生共價(jià)反應(yīng)，會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的表面疏水性產(chǎn)生更大的影響。另一方面，OP-BSA、OOP-BSA復(fù)合物表面疏水性顯著低于MP-BSA、OMP-BSA復(fù)合物，說明鄰苯二酚對(duì)蛋白質(zhì)表面疏水性的影響大于間苯三酚。

圖2 鄰苯二酚、間苯三酚對(duì)BSA表面疏水性的影響Fig.2 Effect of OP and MP on the surfacehydrophobicity of BSA

2.4 鄰苯二酚、間苯三酚對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 傅里葉變換紅外光譜分析

圖3 鄰苯二酚、間苯三酚與BSA相互作用的紅外光譜圖Fig.3 Infrared spectrum of interaction between OP,MP and BSA

與BSA比較，4種復(fù)合物在酰胺I和酰胺II帶也發(fā)生了位移，說明BSA與鄰苯二酚、間苯三酚的相互作用伴隨著蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。對(duì)酰胺I (1 600～1 700 cm-1) 的光譜進(jìn)行高斯擬合，得到二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，如表2所示。OP-BSA、OOP-BSA、MP-BSA、OMP-BSA復(fù)合物中α-螺旋含量分別降低15.40%、15.60%、16.00%、16.00%， β-折疊分別上升25.60%、28.90%、18.20%、14.00%，β-轉(zhuǎn)角分別上升7.10%、5.90%、7.70%、17.20%，無規(guī)則卷曲分別上升5.10%、5.60%、1.20%、3.40%。表明引入氧化和未氧化的OP、MP都會(huì)破壞BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并且OP、OOP對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響大于MP、OMP，這與鄰苯二酚對(duì)BSA一級(jí)結(jié)構(gòu)有更大影響相對(duì)應(yīng)。蛋白質(zhì)中的α-螺旋、β-折疊結(jié)構(gòu)是靠氫鍵來穩(wěn)定的，酚類化合物的加入造成蛋白分子內(nèi)部的氫鍵發(fā)生改變，從而導(dǎo)致BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。RAWEL等[25]在探究綠原酸共價(jià)結(jié)合誘導(dǎo)牛血清白蛋白的結(jié)構(gòu)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，綠原酸和BSA的反應(yīng)導(dǎo)致BSA α-螺旋減少，而其余結(jié)構(gòu)增加。JIANG等[43]在研究乳清蛋白分離物(whey protein isolates, WPI) 和酪蛋白(casein, CS) 與綠原酸非共價(jià)相互結(jié)合時(shí)，發(fā)現(xiàn)WPI、CS紅外光譜圖中酰胺I和酰胺II的移動(dòng)，并且α-螺旋含量減少，β-折疊含量增加。這些結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

表2 基于FTIR的BSA及其復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 單位：%

2.4.2 圓二色譜分析

圓二色譜是研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種常用方法，在近紫外區(qū)，蛋白質(zhì)的圓二色性主要由側(cè)鏈基團(tuán)所貢獻(xiàn)，主要用來分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。酚類化合物與BSA結(jié)合前后的結(jié)構(gòu)變化如圖4所示。BSA處于天然狀態(tài)時(shí)圓二色譜線在190 nm左右為正峰，205～235 nm時(shí)為負(fù)槽。在209和222 nm左右呈現(xiàn)出2個(gè)負(fù)槽，稱為雙負(fù)槽曲線，代表BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu)；在215 nm左右的負(fù)槽代表β-折疊結(jié)構(gòu)。當(dāng)BSA與酚類化合物反應(yīng)后，CD峰強(qiáng)度發(fā)生改變，圖譜出現(xiàn)輕微的藍(lán)移現(xiàn)象，表明氧化與未氧化的OP、MP與BSA的反應(yīng)改變了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖4 鄰苯二酚、間苯三酚與BSA相互作用的近紫外圓二色譜圖Fig.4 Near-UV circular dichroism of interaction betweenOP, MP and BSA

采用Dichroweb程序?qū)SA及BSA復(fù)合物的二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分含量進(jìn)行了估算，結(jié)果如表3所示，CD結(jié)果與紅外結(jié)果一致。與BSA相比，4種BSA復(fù)合物的α-螺旋含量降低，而其余結(jié)構(gòu)增加。CD結(jié)果在數(shù)值上與FTIR的結(jié)果存在一些差異，這可能由于樣品不同所致，紅外光譜測(cè)定的樣品為凍干樣，而遠(yuǎn)紫外CD色譜測(cè)定的樣品為水溶液。

表3 基于CD的BSA及其復(fù)合物二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 單位：%

2.5 鄰苯二酚、間苯三酚對(duì)BSA變性溫度的影響

DSC是測(cè)定蛋白質(zhì)變性溫度的一種常用手段，進(jìn)而反映出蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化。MOSTAFA等[44]在研究咖啡酸和乳清蛋白相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，綠原酸在堿性條件下修飾乳清蛋白會(huì)提高蛋白的熱穩(wěn)定性。本文所研究的BSA變性溫度為86 ℃，如圖5所示，與酚類化合物反應(yīng)后，OOP-BSA、OP-BSA、OMP-BSA、MP-BSA的Tmax分別為90、89、87、90 ℃，均有所升高。

圖5 BSA及其復(fù)合物的差式掃描圖Fig.5 Differential scan of BSA and its complexes

熱變性溫度與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的β-折疊比α-螺旋的疏水性更強(qiáng)，因此β-折疊含量更高的蛋白質(zhì)的熱變性溫度更高[37]。因此當(dāng)鄰苯二酚、間苯三酚與蛋白質(zhì)相互作用使β-折疊增加時(shí)，會(huì)導(dǎo)致變性溫度升高。根據(jù)FTIR分析結(jié)果，OMP-BSA 復(fù)合物β-折疊含量增加幅度最低，因此其變性溫度的變化幅度最小。并且OP、MP的引入使BSA無規(guī)則卷曲含量升高，說明BSA的有序相結(jié)構(gòu)含量減少，無序結(jié)構(gòu)增加，這也可能導(dǎo)致BSA變性溫度升高[44]。

3 結(jié)論

鄰苯二酚、間苯三酚與BSA既能發(fā)生共價(jià)相互作用也能發(fā)生非共價(jià)相互作用。共價(jià)相互作用是蛋白質(zhì)氨基酸側(cè)鏈和醌之間的反應(yīng)，非共價(jià)相互作用主要是氫鍵和疏水相互作用，導(dǎo)致BSA表面疏水性降低。這些反應(yīng)使BSA的構(gòu)象發(fā)生顯著變化，主要是二級(jí)結(jié)構(gòu)改變 (α-螺旋含量降低，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量増加)、熱變性溫度升高。這些結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步研究褐藻多酚與蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理提供了依據(jù)。