以葡萄糖為底物合成2-吡咯烷酮重組谷氨酸棒桿菌的構(gòu)建及發(fā)酵研究

馬振鋒，徐美娟，楊套偉，張顯，邵明龍，中西秀樹，饒志明

(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

2-吡咯烷酮(2-pyrrolidone)又稱丁內(nèi)酰胺、α-吡咯烷酮,是一種無色結(jié)晶，可用作溶劑及有機(jī)合成中間體，以及用來制造尼綸4和乙烯基吡咯烷酮等多種化合物的前體，在工業(yè)上具有許多重要的應(yīng)用[1-4]。

目前，工業(yè)上常通過化學(xué)法生產(chǎn)2-吡咯烷酮,先將1,4-丁二醇脫氫得到γ-丁內(nèi)酯，然后將γ-丁內(nèi)酯水溶液與氨反應(yīng)得到2-吡咯烷酮[5]。但這種方法的反應(yīng)條件苛刻，需要高溫高壓及催化劑。隨著石油資源的減少以及人們對(duì)環(huán)境惡化的擔(dān)憂，從可再生資源中利用微生物生產(chǎn)化學(xué)品和材料對(duì)于可持續(xù)化學(xué)工業(yè)變得越來越重要[6-7]。最近，利用合成生物學(xué)策略在大腸桿菌中建立2-吡咯烷酮合成途徑的研究已有報(bào)道， ZHANG等[8]在大腸桿菌中異源表達(dá)來源鏈霉菌(Streptomycesaizunensis)中的ORF27基因，以L-谷氨酸為底物溫和發(fā)酵獲得1.1 g/L 2-吡咯烷酮。然而，2-吡咯烷酮的產(chǎn)量低，CHAE等[9]進(jìn)一步挖掘來源于丙酸梭菌(Clostridiumpropionicum)β-丙氨酸CoA轉(zhuǎn)移酶(Act)催化的ω-氨基酸的活化，然后自發(fā)環(huán)化，成功在大腸桿菌中建立合成2-吡咯烷酮途徑。

本實(shí)驗(yàn)室前期以C.glutamicumATCC13032菌株誘變獲得1株CorynebacteriumglutamicumE01生產(chǎn)L-谷氨酸為出發(fā)菌株，可利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)生25.6 g/L的谷氨酸。首次探索在谷氨酸棒桿菌C.glutamicumE01中建立2-吡咯烷酮合成途徑。通過對(duì)β-丙氨酸CoA轉(zhuǎn)移酶進(jìn)化系統(tǒng)分析篩選來源于丙酸厭氧菌(Anaerotignumpropionicum)的CoA轉(zhuǎn)移酶(CoA transferase，Act)基因催化γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，發(fā)生環(huán)化合成2-吡咯烷酮。敲除L-谷氨酸分支途徑L-精氨酸合成中的關(guān)鍵基因argB, 當(dāng)合成2-吡咯烷酮時(shí)，消除精氨酸的競爭，使更多的葡萄糖碳流量流向2-吡咯烷酮合成途徑中。完成體外和體內(nèi)驗(yàn)證設(shè)計(jì)途徑的功能性后，采用N-端RBS優(yōu)化act基因，平衡谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase，Gad)與CoA轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量來解除中間產(chǎn)物γ-氨基丁酸過多積累問題。最終，培養(yǎng)工程菌株實(shí)現(xiàn)了以可再生碳源葡萄糖為底物生產(chǎn)2-吡咯烷酮。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌EscherichiacoliBL21 (DE3)、CorynebacteriumglutamicumE01及質(zhì)粒pK18mobsacB、pET-28a、pXMJ 19，均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

限制性內(nèi)切酶(EcoR I、Hind III)、DL10000 DNA Marker、蛋白Marker，大連寶生物公司；高保真酶、同源重組酶克隆試劑盒，南京諾維贊生物科技有限公司；2-吡咯烷酮標(biāo)準(zhǔn)品，東京化成工業(yè)株式會(huì)社；γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙酰CoA、ATP，阿拉丁公司；分析純甲醇，麥克林公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 PCR引物設(shè)計(jì)

本研究中PCR擴(kuò)增所用引物由蘇州金唯智生物有限公司合成，引物見表1。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used for PCR in this study

注：堿基加粗為質(zhì)粒的酶切位點(diǎn)，堿基斜體為基因N-端前的RBS序列

1.1.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10；酵母粉5；NaCl 10；pH 7.0，固體培養(yǎng)基則加15～20 g/L的瓊脂粉，1×105Pa滅菌20 min。根據(jù)實(shí)際需要添加適量的抗生素。

LBG培養(yǎng)基(g/L)：LB培養(yǎng)基+葡萄糖5，固體培養(yǎng)基則加15～20 g/L的瓊脂粉，根據(jù)需要加入相應(yīng)濃度抗生素,用于谷氨酸棒桿菌平板活化和誘導(dǎo)表達(dá)。

谷氨酸棒桿菌電轉(zhuǎn)感受態(tài)培養(yǎng)基(g/L)：腦心浸液(BHI) 37.5、吐溫-80 0.1%、甘氨酸30、異煙肼4。根據(jù)實(shí)際需要添加適量的抗生素。

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25，K2HPO41.5，MgSO40.6，玉米漿30，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，MnSO4·H2O 0.005，尿素2.5(與其他組分分開滅菌)，用200 g/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，115 ℃滅菌20 min；用于谷氨酸棒桿菌上罐發(fā)酵培養(yǎng)種子。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖140，K2HPO41.0，MgSO40.6，玉米漿5.0，F(xiàn)eSO4.7H2O 0.005，MnSO4·H2O 0.005，尿素7.0(與其他組分分開滅菌)，用200 g/L NaOH調(diào)pH至7.0，115 ℃滅菌20 min；用于谷氨酸棒桿菌發(fā)酵。

大腸桿菌培養(yǎng)溫度37 ℃，旋轉(zhuǎn)式搖床180 r/min。谷氨酸棒桿菌培養(yǎng)溫度30 ℃，旋轉(zhuǎn)式搖床180 r/min。

1.2 重組菌株的構(gòu)建與表達(dá)

1.2.1C.glutamicumE01-ΔargB菌株的構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,敲除argB基因，可阻斷L-谷氨酸流向L-精氨酸的合成[10]。根據(jù)GenBank中C.glutamicumATCC13032的argB基因序列設(shè)計(jì)敲除引物。分別以C.glutamicumE01基因組為模板，分別以argB-L-F、argB-L-R和argB-R-F、argB-R-R引物PCR擴(kuò)增的2個(gè)片段，經(jīng)過重疊延伸PCR獲得缺失型片段ΔargB，回收后連接至pK18mobsacB線性化載體，連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)至E.coliBL21 (DE3)。篩選后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證及測序分析。驗(yàn)證正確的pK18-ΔargB重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)C.glutamicumE01,涂布含有30 μg/mL卡那霉素的固體LBG平板，于30 ℃培養(yǎng)36 h，經(jīng)過卡那霉素初次篩選獲得一次重組菌。再分別將目標(biāo)轉(zhuǎn)化子在含100 g/L蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行脅迫二次重組篩選，30 ℃培養(yǎng)24 h后獲得二次同源重組菌。提取重組子染色體為模板，以argB基因設(shè)計(jì)上下游引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，進(jìn)行回復(fù)野生型/重組型的鑒定，將PCR鑒定為重組型的菌株命名為C.glutamicumE01-ΔargB(C.glutamicumEA)。

1.2.2 2-吡咯烷酮合成途徑相關(guān)基因的克隆

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通過點(diǎn)突變及C-末端切除改造大腸桿菌gad基因，獲得大腸桿菌gad突變體(Glu89Gln /Δ452-466)，使得谷氨酸脫羧酶在pH 7下仍具有催化活性[11-12]，擴(kuò)寬了Gad的pH范圍。分別以BL21基因組為模板，以相應(yīng)引物PCR擴(kuò)增的2個(gè)片段，經(jīng)過重疊延伸PCR獲得目的基因片段gad-M，回收后連接至pXMJ 19線性化載體，連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)至E.coliBL21 (DE3)。篩選后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證及測序分析。驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)C.glutamicumEA,涂布氯霉素平板進(jìn)行篩選，將驗(yàn)證正確的重組菌株命名為C.glutamicumE01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M(C.glutamicumEAG)。

通過對(duì)β-丙氨酸CoA轉(zhuǎn)移酶進(jìn)化系統(tǒng)分析，篩選來自丙酸厭氧菌的CoA轉(zhuǎn)移酶(CoA transferase，NCBI: WP_066047836.1)的氨基酸序列，由蘇州金唯智有限公司進(jìn)行act基因的合成。分別以重組質(zhì)粒pXMJ 19-gad-M、act基因合成片段為模板，分別以gad-F、gad-act-R和act-gad-F、act-R為引物PCR擴(kuò)增的2個(gè)片段，經(jīng)過重疊延伸PCR獲得目的基因片段，回收后連接至pXMJ 19線性化載體，連接產(chǎn)物化轉(zhuǎn)至E.coliBL21(DE3)。篩選后，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證及測序分析。驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)C.glutamicumEA,涂布氯霉素平板進(jìn)行篩選，驗(yàn)證正確的重組菌株命名為C.glutamicumE01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M-act(C.glutamicumEAGA)。

1.2.3 重組菌表達(dá)

將重組谷氨酸棒桿菌C.glutamicumEAGA、C.glutamicumEAGAN2及含有空載pXMJ 19質(zhì)粒的C.glutamicumE01對(duì)照菌株在LBG固體平板上分別劃線活化后，挑取單菌落接入10 mL BHI液體小瓶，30 ℃、180 r/min培養(yǎng)16～24 h后按1%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL BHI液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)4～5 h后，添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為1 mmol/L，繼續(xù)于30 ℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)8～12 h后，4 ℃下離心收集菌體細(xì)胞后分別用0.1 mol/L pH 7.4 的PBS緩沖液洗滌2次后，重新懸浮于PBS緩沖液中，用超聲破碎儀破碎，破碎液在4 ℃下離心20 min，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE分析，粗酶液用于后續(xù)的酶活力測定。

1.3 酶純化

為了獲得N-末端his標(biāo)記的act，以act基因合成片段為模板，以28a-act-F 與28a-act-R為引物PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物膠回收，膠回收的產(chǎn)物與線性化的pET-28a載體連接，然后將重組質(zhì)?；D(zhuǎn)大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，即獲得E.coliBL21/pET-28a-act菌株。將此重組菌株接種于50 mL LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為50 μg/mL的卡那霉素抗性，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)。采用25 ℃、180 r/min誘導(dǎo)表達(dá)8～12 h后，4 ℃下離心收集菌體細(xì)胞后分別用0.1 mol/L pH 7.4 的PBS緩沖液洗滌2次，用超聲破碎儀破碎，破碎液于4 ℃下離心20 min，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE分析。將上清液粗酶液用0.45 μm濾膜過濾后，利用裝有Ni-NTA蛋白純化柱的AKTA Prime蛋白純化設(shè)備來去除雜蛋白，重組酶Act的N-末端帶有His標(biāo)簽?zāi)芘c純化柱上的Ni+進(jìn)行鰲合，采用咪唑緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，達(dá)到純化酶的目的。然后粗酶液和純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析驗(yàn)證大小和純度，利用Bradford試劑盒測定蛋白濃度，以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 相關(guān)酶的酶活力測定

N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)酶活力檢測：具體操作見參考文獻(xiàn)[10]，1個(gè)酶活力單位(U)定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘生成1 μmolN-乙酰谷氨酸氧肟酸所需的酶量。

谷氨酸脫羧酶(Gad)酶活力檢測：采用Berthlot比色法[13]。1個(gè)酶活力單位(U)定義為：在測定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μmol GABA所需的酶量。

CoA轉(zhuǎn)移酶酶活力檢測方法：詳細(xì)操作參考文獻(xiàn)[9]，1個(gè)酶活力單位(U)定義為：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘將1 μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的酶量。

1.5 2-吡咯烷酮質(zhì)譜分析

LS-MS質(zhì)譜分析采用WATERS QUATTRO PREMIER XE儀器。電噴霧電離(ESI +)ESI在陽離子模式下用于洗脫質(zhì)譜條件，如下所述：Desolvation Gas Flow 12 L/min; 離子源溫度100 ℃; 脫溶劑氣溫度400 ℃; 毛細(xì)管電壓3.5 kV。使用掃描模式，掃描質(zhì)量范圍為m/z50～2 000 kDa。使用MassLynx V4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和處理。

1.6 重組菌株發(fā)酵合成2-吡咯烷酮

菌株經(jīng)平板活化后，挑取單菌落分別接入種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、180 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h，得到種子液；將種子液以體積分?jǐn)?shù)為10%的接種量接種至200 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)18 h，獲得培養(yǎng)液；將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)接到含有2.5 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，30 ℃條件下發(fā)酵8 h。8 h后，添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，于30 ℃條件下繼續(xù)誘導(dǎo)發(fā)酵84 h，獲得發(fā)酵液；整個(gè)發(fā)酵過程中，控制通氣量維持在40%，控制轉(zhuǎn)速維持在600～800 r/min，控制pH維持在7.0(補(bǔ)加50% NH3·H2O自動(dòng)控制)，流加濃度為800 g/L的葡萄糖溶液控制發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖量。

1.7 發(fā)酵過程中相關(guān)參數(shù)分析

發(fā)酵液菌體濃度適當(dāng)稀釋后，測定OD600，葡萄糖和谷氨酸含量采用生物傳感分析儀SBA-40E進(jìn)行測定。GABA采用HPLC檢測，發(fā)酵液通過鄰苯二甲醛(OPA FMOC) 柱前衍生化測定[14]，其色譜條件為：C18色譜柱，柱溫控制在 40 ℃，流速 1.0 m L/min，波長338 nm紫外檢測器下檢測。2-吡咯烷酮采用HPLC檢測[15]，其色譜條件為：C18色譜柱，流動(dòng)相：KH2PO4溶液(KH2PO410.0 g與己烷磺酸鈉1.1 g， 加水溶解并稀釋至1 L, 用H3PO4調(diào)節(jié)pH至2.1)與甲醇體積比為9∶1；流速 1.0 mL/min，波長210 nm紫外檢測器下檢測；柱溫30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 C.glutamicum E01-ΔargB構(gòu)建與相關(guān)參數(shù)測定

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫GenBank中C.glutamicumATCC13032的argB基因，此基因長度為954 bp。采用pK18mobsacB敲除系統(tǒng)，經(jīng)2輪同源重組篩選，PCR鑒定與測序結(jié)果顯示，ΔargB缺失堿基為454 bp，與理論值相一致(圖1-a)。結(jié)果表明C.glutamicumE01菌株中argB基因敲除成功，獲得C.glutamicumE01-ΔargB菌株(C.glutamicumEA)。為了更加深入理解敲除argB基因后對(duì)菌株的影響，測定生長曲線顯示敲除argB基因后不影響C.glutamicumEA菌株生長(圖1-b)。測定敲除argB基因前后C.glutamicumE01菌株N-乙酰谷氨酸激酶(NAGK)酶活力情況，敲除argB基因后酶活力幾乎為零(圖1-c)。搖瓶發(fā)酵C.glutamicumE01-ΔargB菌株后，發(fā)酵液中幾乎檢測不到精氨酸，L-谷氨酸的積累量由25.6 g/L提高到28.4 g/L(圖1-d)。

2.2 CoA轉(zhuǎn)移酶進(jìn)化系統(tǒng)分析

為了篩選催化γ-氨基丁酸合成2-吡咯烷酮的酶。通過對(duì)β-丙氨酸CoA轉(zhuǎn)移酶進(jìn)化樹系統(tǒng)分析，采用β-丙氨酸CoA轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列在數(shù)據(jù)庫NCBI中進(jìn)行氨基酸BLAST比對(duì)，然后采用MEGA 5.1軟件按照Neighbor-joining方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，最后采用在線軟件iTOL 5.5進(jìn)行進(jìn)化樹美化。結(jié)果表明,來源于丙酸梭菌的β-丙氨酸CoA轉(zhuǎn)移酶與丙酸厭氧菌、梭狀芽孢桿菌(Clostridiabacterium)、新厭氧厭氧菌(Anaerotignumneopropionicum)、厭氧厭氧桿菌(Anaerotignumlactatifermentans)來源的的CoA轉(zhuǎn)移酶蛋白序列相識(shí)度分別達(dá)到100%、90.93%、90.43%、83.12%(圖2)。為了能成功在谷氨酸棒桿菌中建立2-吡咯烷酮合成途徑，選擇來源于丙酸厭氧菌的CoA轉(zhuǎn)移酶催化γ-氨基丁酸合成2-吡咯烷酮。將CoA轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列由蘇州金唯智公司進(jìn)行act基因的合成，大小為1 194 bp。

a-C.glutamicum E01菌株敲除argB基因的PCR擴(kuò)增鑒定；M-DL20000 DNA marker; 1-argB基因；2-ΔargB缺失;b-C.glutamicum E01菌株敲除argB基因前后生長曲線;c-C.glutamicum E01菌株敲除argB基因前后NAGK粗酶活力比較;d-C.glutamicum E01與C.g E01-ΔargB菌株發(fā)酵參數(shù)圖1 C.glutamicum E01-ΔargB的PCR擴(kuò)增鑒定及相關(guān)參數(shù)Fig.1 C.glutamicum E01-ΔargB PCR amplification identification and related parameters

圖2 β-丙氨酸CoA轉(zhuǎn)移酶進(jìn)化樹系統(tǒng)分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of β-alanine CoA transferase

2.3 2-吡咯烷酮合成途徑體外驗(yàn)證

將E.coliBL21/pET-28a-act菌株誘導(dǎo)表達(dá)，細(xì)胞破碎液上清純化采用Ni-NTA蛋白純化柱的AKTA Prime蛋白純化設(shè)備去除雜蛋白，將純化后的蛋白SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖3-a所示，CoA轉(zhuǎn)移酶在E.coliBL21中成功表達(dá)，Ni-NTA蛋白純化柱可以對(duì)CoA轉(zhuǎn)移酶純化，分子質(zhì)量為43.8 kDa左右。為了檢測CoA轉(zhuǎn)移酶催化γ-氨基丁酸合成2-吡咯烷酮的能力，采用比色法體外測定法，體外酶活力測定結(jié)果顯示Act對(duì)γ-氨基丁酸催化活性為20 U/mg，2-吡咯烷酮檢測為(56±3) mg/L，而在陰性對(duì)照測定中未檢測到2-吡咯烷酮。為了確定CoA轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化GABA為2-吡咯烷酮，對(duì)2-吡咯烷酮標(biāo)準(zhǔn)液及上述反應(yīng)液進(jìn)行LS-MS質(zhì)譜分析,結(jié)果如圖3-b所示。

2-吡咯烷酮預(yù)期的m/z值為86.07，與理論值一致。以上驗(yàn)證表明，Act對(duì)γ-氨基丁酸具有催化合成2-吡咯烷酮的能力。

a-CoA轉(zhuǎn)移酶在E.coli BL21(DE3)中表達(dá)與純化;b-2-吡咯烷酮LS-MS質(zhì)譜分析;c-反應(yīng)樣品LS-MS質(zhì)譜分析；M-Protein Marker;1- E.coliBL21/pET-28a-Act上清液;2～5-不同時(shí)間收集純化的Act酶圖3 2-吡咯烷酮合成途徑體外驗(yàn)證Fig.3 In vitro validation of 2-pyrrolidone synthesis pathway

2.4 谷氨酸棒桿菌C.glutamicum E01-ΔargB菌株中建立2-吡咯烷酮合成途徑

從可再生的碳源葡萄糖生產(chǎn)2-吡咯烷酮是可持續(xù)發(fā)展化學(xué)工業(yè)的方向。首先，選擇可以利用葡萄糖的底盤細(xì)胞C.glutamicumE01生產(chǎn)L-谷氨酸，然而C.glutamicumE01中不存在天然2-吡咯烷酮代謝途徑，為了將2-吡咯烷酮途徑引入到谷氨酸棒桿菌中。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]，gad突變體(Glu89Gln /Δ452-466)在細(xì)胞生長最佳pH 7下仍具有催化活性，在C.glutamicumE01-ΔargB菌株中異源過量表達(dá)編碼L-谷氨酸脫羧酶的突變體gad-M得到C.glutamicumE01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M(C.glutamicumEAG)，將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA,增加細(xì)胞內(nèi)GABA的含量。在搖瓶發(fā)酵中，獲得(1.3±0.05) g/L GABA(圖4)。為了生產(chǎn)2-吡咯烷酮，將pXMJ 19-gad-M-act電轉(zhuǎn)到C.glutamicumE01-ΔargB菌株獲得重組菌C.glutamicumE01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M-act(C.glutamicumEAGA)，搖瓶發(fā)酵中，GABA的含量減少到(593±6) mg/L，2-吡咯烷酮含量為(124±8) mg/L(圖4)。

圖4 重組菌合成GABA與2-吡咯烷酮的發(fā)酵參數(shù)Fig.4 Fermentation parameters of GABA and 2-pyrrolidone by recombinant bacteria

2.5 限速步驟中間產(chǎn)物GABA的解除

為了使更多GABA合成2-吡咯烷酮，采用提高act基因的表達(dá)量。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[16]N-端序列可以明顯提高基因在谷氨酸棒桿菌中的表達(dá)量。將編號(hào)為N2的RBS序列添加在act基因N-端前面，獲得重組質(zhì)粒pXMJ 19-gad-M-N2-act電轉(zhuǎn)到C.glutamicumE01-ΔargB菌株獲得重組菌C.glutamicumE01-ΔargB/pXMJ 19-gad-M-N2-act(C.glutamicumEAGAN2)， 按照方法1.2.3重組菌誘導(dǎo)表達(dá)，破碎細(xì)胞后上清液SDS-PAGE電泳分析，重組菌C.glutamicumEAGAN2比C.glutamicumEAGA菌株中Act蛋白表達(dá)量明顯提高，分子質(zhì)量為43.8 kDa左右(圖5-a)。

重組菌C.glutamicumEAGAN2與C.glutamicumEAGA菌株中Gad與Act酶活力測定結(jié)果顯示, 2株重組菌中Gad酶活力保持為(0.64±0.05) U/mg,C.glutamicumEAGAN2中Act的酶活為(6.4±0.3) U/mg相對(duì)于C.glutamicumEAGA菌株中Act的酶活力(2.5±0.2) U/mg提高了1.56倍(圖5-b)。即基因N-端前面添加RBS策略可以提高Act的酶活力。為了測試重組菌C.glutamicumEAGAN2中GABA的積累量，搖瓶發(fā)酵測定，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的積累量為(30±3) mg/L，較重組菌C.glutamicumEAGA降低了18.7倍，發(fā)酵液中2-吡咯烷酮的積累量達(dá)(180±7) mg/L，較重組菌C.glutamicumEAGA提高了45.2%?？梢?，在act基因N-端前面添加RBS序列可提高減弱其γ-氨基丁酸積累，增強(qiáng)其2-吡咯烷酮積累(圖5-c)。

2.6 發(fā)酵罐發(fā)酵重組菌C.glutamicum EAGAN2合成2-吡咯烷酮的研究

為了進(jìn)一步研究C.glutamicumEAGAN2菌株合成2-吡咯烷酮的能力，將C.gEAGAN2菌株進(jìn)行5 L罐發(fā)酵測試，在發(fā)酵期間，每隔一段時(shí)間對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行取樣，檢測發(fā)酵液中葡萄糖、L-谷氨酸、γ-氨基丁酸、2-吡咯烷酮的含量以及發(fā)酵液的OD600值(圖6)。在C.glutamicumEAGAN2菌株48 h時(shí)，OD600達(dá)到最高，此時(shí)GABA含量積累到最高點(diǎn)。發(fā)酵72 h時(shí)，發(fā)酵液中2-吡咯烷酮的含量達(dá)到最高，高達(dá)(8±0.3) g/L?？梢?，C.glutamicumEAGAN2菌株可以實(shí)現(xiàn)以廉價(jià)碳源葡萄糖為底物合成2-吡咯烷酮，但還存在2-吡咯烷酮的含量低、CoA轉(zhuǎn)移酶催化合成2-吡咯烷酮效率低問題，無法滿足工業(yè)上利用微生物大規(guī)模合成2-吡咯烷酮。

a-重組菌C.glutamicum EAGAN2與C.glutamicum EAGA菌株中Gad與Act表達(dá)情況; M-Protein Marker; 1-C.glutamicum E01-ΔargB/pXMJ 19空對(duì)照上清液;2-C.glutamicum EAGA 上清液；C.glutamicum EAGAN2上清液; b-重組菌C.glutamicum EAGAN2與C.glutamicum EAGA菌株中Gad與Act粗酶活力測定分析；c-重組菌C.glutamicum EAGAN2搖瓶發(fā)酵合成GABA與2-吡咯烷酮的含量圖5 不同N-端序列對(duì)重組菌Act酶表達(dá)量、酶活力及2-吡咯烷酮合成的影響Fig.5 Effects of different N-terminal sequence on the expression, activity and 2-pyrrolidone synthesis ofAct enzyme in recombinant bacteria

圖6 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵重組菌C.glutamicum EAGAN2合成2-吡咯烷酮發(fā)酵過程Fig.6 Fermentation of 2-pyrrolidone by C.glutamicumEAGAN2 in 5 L fermentor

3 討論

在過去十幾年內(nèi)，通過對(duì)系統(tǒng)生物學(xué)、代謝工程和合成生物學(xué)的策略對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行工程設(shè)計(jì)，將谷氨酸棒桿菌作為傳統(tǒng)生產(chǎn)各種氨基酸菌株，改造為生產(chǎn)化學(xué)品的現(xiàn)代化工平臺(tái)[17-18]。僅在過去的5年中，利用谷氨酸棒桿菌合成的產(chǎn)品數(shù)量由35種增加到70多種[19-21]。隨著合成生物學(xué)的進(jìn)步，越來越多的化學(xué)品通過設(shè)計(jì)谷氨酸棒桿菌來生產(chǎn)傳統(tǒng)上采用石化工藝生產(chǎn)的化學(xué)藥品。

2-吡咯烷酮是一種有價(jià)值的大宗化學(xué)品。迄今為止，由于缺乏天然生物合成途徑，僅最近在大腸桿菌中建立起2-吡咯烷酮合成途徑[8-9]。本研究首次探索了在谷氨酸棒桿菌中建立2-吡咯烷酮合成途徑。首先，利用進(jìn)化樹系統(tǒng)分析，篩選催化GABA轉(zhuǎn)化為2-吡咯烷酮的CoA轉(zhuǎn)移酶。其次，選擇C.glutamicumE01作為生產(chǎn)L-谷氨酸的天然菌株，為了使更多葡萄糖的碳流量流向L-谷氨酸，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，敲除argB基因阻斷L-谷氨酸合成L-精氨酸，獲得生產(chǎn)更多L-谷氨酸的谷氨酸棒桿菌底盤細(xì)胞。最終，體內(nèi)外驗(yàn)證及N-端RBS優(yōu)化后，成功在谷氨酸棒桿菌中建立了2-吡咯烷酮合成途徑，發(fā)酵結(jié)果顯示合成(8±0.3) g/L 2-吡咯烷酮。由于此項(xiàng)研究利用微生物生產(chǎn)2-吡咯烷酮含量低，今后利用微生物合成2-吡咯烷酮的研究將聚焦幾個(gè)方面進(jìn)行。(1)通過對(duì)CoA轉(zhuǎn)移酶理性改造拓寬底物與酶結(jié)合口袋進(jìn)而提高酶的催化效率；(2)采用非理性策略對(duì)CoA轉(zhuǎn)移酶隨機(jī)突變，高通量篩選催化效率高效的酶；(3)挖掘新酶高效催化2-吡咯烷酮合成；(4)拓寬更多的碳源來合成2-吡咯烷酮，如果糖、蔗糖、淀粉、木聚糖、纖維素等。總之，本研究首次揭示了在谷氨酸棒桿菌中建立可持續(xù)合成2-吡咯烷酮的方法，為未來工業(yè)上利用可再生資源生產(chǎn)2-吡咯烷酮奠定了基礎(chǔ)。