血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA DANCR在非小細(xì)胞肺癌診斷中的臨床應(yīng)用

周建英 劉震天 侯 洪 胡珍珍 劉暉群 肖 丹

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占所有肺癌患者的80%～85%左右，由于目前對(duì)于NSCLC缺少有效的篩查手段，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，失去了手術(shù)治療機(jī)會(huì)[1]。近年來，長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在腫瘤發(fā)生及發(fā)展方面的研究受到廣泛關(guān)注[2]。LncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸、缺少完整的開放閱讀框、無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA分子[3]。近期研究證實(shí)，lncRNA可穩(wěn)定存在于機(jī)體的各種體液中，包括血清、尿液、唾液等[4-5]，使得lncRNA作為疾病早期診斷和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物成為可能。分化拮抗非蛋白編碼RNA(DANCR，differentiation antagonizing non-coding RNA)是2012年由Kretz等發(fā)現(xiàn)并定義的1個(gè)lncRNA，定位于人體4號(hào)染色體，全長(zhǎng)915個(gè)堿基[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)，DANCR在多種腫瘤中高表達(dá)，參與了腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程的調(diào)控[7]。有文獻(xiàn)報(bào)道在NSCLC腫瘤組織中DANCR表達(dá)顯著升高，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8-9]，但DANCR在NSCLC患者血清中是否表達(dá)，表達(dá)水平與NSCLC臨床病理特征是否相關(guān)尚未見報(bào)道。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測(cè)NSCLC患者血清中DANCR的表達(dá)情況，并同時(shí)分析其與NSCLC患者各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，初步探討血清DANCR在NSCLC臨床診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 一般資料

NSCLC組：收集2017年1月至2018年8月于江西省腫瘤醫(yī)院住院的初診NSCLC患者82例，其中男性50例，女性32例；年齡42～79歲，中位年齡68歲，均經(jīng)病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查確診。其中腺癌57例，鱗癌25例；根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC，2009年第7版)TNM分期Ⅰ期21例，Ⅱ期31例，Ⅲ期12例，Ⅳ期18例。肺良性疾病組：收集同期就診的肺部良性疾病患者45例作為肺良性疾病組，年齡36～74歲，中位年齡63歲，其中肺炎23例，慢性支氣管炎15例，慢性阻塞性肺疾病7例，所有患者經(jīng)胸腹部CT等檢查未發(fā)現(xiàn)肺癌及其他部位腫瘤證據(jù)。健康對(duì)照組：收集同期門診健康體檢者血清50例，其中男性32例，女性18例；年齡35～72歲，中位年齡58歲。本研究經(jīng)江西省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意。7600型定量 PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Trizol LS試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR?Premix Ex TaqTM均購(gòu)自大連寶生物TaKaRa公司。

1.2 標(biāo)本收集與處理

分別采集NSCLC患者術(shù)前、肺部良性疾病患者及健康體檢者空腹靜脈血2 ml，置于促凝管中，輕輕混勻后，室溫放置30 min，采用兩步離心法獲取血清，1500 r/min離心10 min，吸取上清，然后將上清12000 r/min離心2 min，分離血清置于無RNA酶EP管中，血清樣本于-80 ℃保存。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)

吸取250 μl血清，分別加入Trizol LS試劑，混勻后按Trizol LS試劑說明書提取總RNA，用無RNA酶雙蒸水溶解后，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和質(zhì)量。采用反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)脫氧核糖核酸。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按TaKaRa公司PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書操作，選擇β-actin作為內(nèi)參。采用SYBR法進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，檢測(cè)步驟及反應(yīng)條件參照試劑盒說明書進(jìn)行。引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成：DANCR上游引物為：5'-TCGGAGGTGGATTCTGTT-3'，下游引物為5'-TTCGGTGTAGCAAGTCTG-3'；內(nèi)參β-actin上游引物為5'-CCTGGCACCCAGCACAAT-3'，下游引物為5'-GGGCCGGACTCGTCATAC-3'。反應(yīng)體系為20 μl，即：1×SYBR Green I master-mix、0.5 μmol/l特異前向引物、0.5 μmol/l特異反向引物、1 μl反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95 ℃ 10 min后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，40循環(huán)。RT-qPCR使用Applied Biosystems 7600儀器進(jìn)行。所有樣品做3復(fù)孔。根據(jù)待測(cè)標(biāo)本的Ct值，以β-actin為內(nèi)參照，采用相對(duì)定量法對(duì)RT-qPCR結(jié)果進(jìn)行分析，以2-△△Ct計(jì)算?！鰿t=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct，△△Ct=待測(cè)標(biāo)本△Ct-對(duì)照樣本△Ct。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。各組lncRNA數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)，呈偏態(tài)分布，用中位數(shù)和四分位數(shù)間距[M(Q1,Q3)]表示，兩組間比較用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線及曲線下面積(area under the ROC curve，AUC)來評(píng)估血清DANCR診斷NSCLC的效能參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 各組血清DANCR的表達(dá)水平

采用RT-qPCR法檢測(cè)82例NSCLC患者、45例肺良性疾病患者及50例健康體檢者血清中DANCR的表達(dá)差異，結(jié)果顯示，NSCLC組血清中DANCR表達(dá)水平為3.05(1.94，4.29)，顯著高于肺良性疾病組[1.33(0.96，2.48)]及健康對(duì)照組[1.01(0.81，1.50)]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)(圖1A)。肺良性疾病組與健康對(duì)照組血清中DANCR表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，肺部良性疾病組中肺炎患者、慢性支氣管炎患者及慢性阻塞性肺疾病患者血清DANCR水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖1B)。

2.2 NSCLC患者血清DANCR表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清DANCR的表達(dá)水平與患者的性別、年齡、是否吸煙、病理類型、分化程度及是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯關(guān)系(P>0.05)，而與腫瘤大小及臨床分期有關(guān)(P<0.05)(表1和圖2)。

A為NSCLC組、肺良性疾病組及健康對(duì)照組血清DANCR水平；B為肺良性疾病組中肺炎患者、慢性支氣管炎患者及慢性阻塞性肺疾病患者血清DANCR水平。圖1 不同分組中血清DANCR表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

表1 NSCLC患者血清DANCR表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清DANCR作為NSCLC診斷效果的評(píng)估

利用ROC曲線分析血清DANCR對(duì)NSCLC診斷效能，分析結(jié)果顯示，單項(xiàng)檢測(cè)時(shí)，DANCR、CEA和Cyfra21-1的AUC分別為0.830、0.760和0.736。DANCR的敏感度和特異度均為最高，分別為75.61%和84.00%。雙項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，DANCR與CEA聯(lián)合的敏感度最高(85.37%)，DANCR與Cyfra21-1聯(lián)合的特異度最高(90.00%)。當(dāng)聯(lián)合檢測(cè)DANCR、CEA和Cyfra21-1三項(xiàng)指標(biāo)時(shí)，其AUC可達(dá)0.923，敏感度為89.02%，特異度為84.00%。結(jié)果見圖3和表2。

3 討論

LncRNA是近年來腫瘤學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)，參與了腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等多個(gè)環(huán)節(jié)。目前越來越多的證據(jù)表明，lncRNA在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中均扮演著極其重要的角色。已有的研究證實(shí)，DANCR上調(diào)表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[10]。如，Guo等[11]研究發(fā)現(xiàn)DANCR在肝癌組織中表達(dá)顯著升高，且與臨床分期及患者預(yù)后顯著相關(guān)，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)DANCR可作為miRNA海綿吸附miR-27a-3p，調(diào)控下游ROCK1/LIMK1/COFILIN1信號(hào)通路促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展。Wang等[12]報(bào)道DANCR可通過結(jié)合EZH2調(diào)節(jié)FBP1基因啟動(dòng)子組蛋白甲基化，從而調(diào)節(jié)膽管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。對(duì)于肺癌中DANCR表達(dá)的研究見于組織學(xué)和細(xì)胞系。Guo等[13]研究證實(shí)，DANCR在NSCLC癌組織中表達(dá)顯著升高，DANCR可通過抑制p21基因表達(dá)，促進(jìn)NSCLC的發(fā)生發(fā)展。另有研究表明，DANCR能夠吸附miR-496，進(jìn)而調(diào)控其靶基因mTOR表達(dá)促進(jìn)NSCLC進(jìn)展[14]。目前，尚未見有關(guān)NSCLC患者血清中DANCR報(bào)道。

本研究采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)了82例NSCLC患者、45例肺良性疾病患者及50例健康對(duì)照者血清中DANCR的表達(dá)差異，結(jié)果表明，DANCR在NSCLC患者血清中表達(dá)顯著升高。在分析NSCLC患者血清DANCR表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系顯示，DANCR的表達(dá)水平與TNM分期及腫瘤大小顯著相關(guān)，而與其他臨床病理特征無關(guān)，提示NSCLC患者血清DANCR可作為評(píng)估臨床分期及腫瘤大小的潛在指標(biāo)。

A為腫瘤大小分組；B為TNM分期分組。圖2 NSCLC患者不同分組中血清DANCR表達(dá)水平的散點(diǎn)圖

A為單獨(dú)指標(biāo)；B為聯(lián)合指標(biāo)。圖3 NSCLC患者DANCR、CEA和Cyfra21-1單獨(dú)及聯(lián)合的ROC曲線

表2 DANCR、CEA和Cyfra21-1單獨(dú)或聯(lián)合檢驗(yàn)效能

發(fā)掘具有更具特異、敏感的生物學(xué)診斷標(biāo)志物是NSCLC研究的熱點(diǎn)之一。本研究采用ROC曲線及AUC來評(píng)價(jià)血清DANCR對(duì)NSCLC的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示血清DANCR(AUC為0.830)比傳統(tǒng)指標(biāo)CEA(AUC為0.760)和Cyfra21-1(AUC為0.736)有更好的診斷效能，對(duì)NSCLC的輔助診斷有一定幫助。相對(duì)于單個(gè)腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)，綜合多種生物學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)或可提高腫瘤診斷的敏感性及準(zhǔn)確性。本研究結(jié)果顯示，DANCR與CEA聯(lián)合檢測(cè)可顯著提高敏感度(85.37%)，DANCR與Cyfra21-1聯(lián)合檢測(cè)則可顯著提高特異度(90.00%)。當(dāng)三項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測(cè)時(shí)，其AUC最大，為0.923，敏感度最高為89.02%。因此，血清DANCR與CEA、Cyfra21-1聯(lián)合，提高其對(duì)NSCLC診斷的診斷效能和敏感度。

綜上所述，NSCLC患者血清中DANCR表達(dá)明顯升高，血清DANCR與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測(cè)可獲得較好的診斷效能，或可為NSCLC的輔助診斷提供新的靶點(diǎn)。