骨髓增生異常綜合征患者骨髓TIM-3表達水平及意義分析

魏艷利 許蓮蓉

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)系由造血干細胞惡性克隆引起的血液系統(tǒng)疾病，可引起造血功能衰竭，嚴重者可能轉化為急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)，預后差[1]。目前尚未明確MDS發(fā)病機制，多認為造血干細胞基因突變、細胞免疫缺陷參與在MDS發(fā)病過程，主要表現(xiàn)在造血干細胞惡性克隆、逃離免疫監(jiān)視方面[2]。T細胞免疫球蛋白黏液素3(T cell immunoglobulin mucin 3，TIM-3)系細胞表面糖蛋白成分，表達于樹突細胞、T細胞、自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)等免疫細胞表面，同時為免疫負性調(diào)節(jié)因子，參與腫瘤免疫調(diào)控，抑制部分免疫細胞分子表達[3]。報道發(fā)現(xiàn)，TIM-3高度表達于大部分亞型AML患者造血干細胞，但在正常造血干細胞基本無表達，認為其與惡性血液病發(fā)生有關[4]。但對MDS患者TIM-3表達及意義尚少見報道。為探討TIM-3在MDS中的表達及其意義，現(xiàn)對75例MDS及20例非MDS進行了研究，報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2016年8月至2018年8月山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院血液科收治的MDS患者共75例。均符合血液病診斷及療效標準中MDS診斷及分型標準[5]；經(jīng)骨髓形態(tài)學、活檢確診；完成骨髓細胞免疫表型測定；患者及家屬均自愿簽署研究同意書，均可配合完成隨訪調(diào)查。其中男性41例，女性34例；年齡20～75歲，平均(56.8±7.1)歲；其中MDS伴單系發(fā)育異常(myelodysplastic syndrome-single-lineage dysplasia，MDS-SLD)21例，MDS伴多系發(fā)育異常(myelodysplastic syndrome-multiple-lineage dysplasi，MDS-MLD)15例，MDS伴原始細胞增多-1(MDS-excess blasts-1，MDS-EB-1)12例，MDS-EB-2 26例，MDS伴環(huán)狀鐵粒幼紅細胞(myelodysplastic syndrome-ring sideroblasts，MDS-RS)1例；核型：較好核型35例，中等核型23例，差核型12例，極差核型5例；國際預后積分系統(tǒng)修訂評分(revised international prognostic scoring system，IPSS-R)[6]：低危(<3分)21例，中危(3～4.5分)20例，高危(4.5～6分)15例，極高危(>6分)19例。選擇同期收治的20例非MDS但需穿刺抽取骨髓液篩查者作為對照組，其中男性12例，女性8例；年齡21～73歲，平均(55.9±6.9)歲；均自愿采集骨髓標本。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

消毒鋪巾，2%利多卡因局麻，髂后上棘穿刺提取骨髓液5 ml，肝素抗凝并過濾，渦旋振蕩器混合均勻，室溫避光孵育15 min，加入1 ml溶血素，渦旋振蕩器混勻，室溫避光孵育10 min，低速離心(1 500 r/min)10 min，棄上清液，加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)1 ml，振蕩均勻，低素離心10 min，棄上清，加300 μl重懸，應用美國BD PharMingen公司Aria Ⅱ流式細胞儀分選TIM-3+干細胞(TIM-3+CD34+CD38-Lin細胞群)，檢測管內(nèi)預先加入多甲藻黃素葉綠素蛋白(peridinin-chlorophyll-protein complex，PerCP)標記鼠抗人CD34單克隆抗體/別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)標記鼠抗人CD38單克隆抗體/藻紅蛋白(P-phycoerythrin，PE)標記TIM-3單克隆抗體/Lin異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標記鼠抗人Lin單克隆抗體及同型對照單克隆抗體各20 μl，試劑盒均購自美國BD公司，4 ℃避光孵育0.5 h，加紅細胞裂解液2 ml，混合均勻，繼續(xù)室溫閉光孵育10 min，PBS洗滌2次，濾網(wǎng)過濾細胞懸液，收集過濾液，上機測定，每管收集500 000細胞，測定CD34+CD38-Lin-TIM-3+細胞比例。參照文獻[7]進行骨髓染色體核型分析，核型異常均參照人類細胞遺傳學的國際命名體制[8]。所有MDS均從確診MDS隨訪至2019年4月1日或患者死亡，通過電話、門診隨訪形式，明確其生存狀況及是否轉化為AML，統(tǒng)計轉白率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料行χ2檢驗，計量資料組間比較t檢驗，多組比較采用方差分析，組內(nèi)LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MDS、非MDS骨髓TIM-3表達情況比較

MDS患者骨髓液CD34+CD38-Lin-TIM-3+細胞比例高于非MDS(P<0.05)，見表1。

表1 MDS、非MDS骨髓TIM-3表達情況比較

注：①為與非MDS比較，P<0.05。

2.2 不同染色體核型MDS患者骨髓TIM-3表達情況比較

不同染色體核型MDS患者骨髓TIM-3比較差異有統(tǒng)計學意義(F=16.257，P<0.05)，隨核型變差TIM-3表達水平上升，見表2。

表2 不同染色體核型MDS患者骨髓TIM-3表達情況比較

注：①為與較好核型比較，P<0.05；②為與中等核型比較，P<0.05；③為與差核型比較，P<0.05。

2.3 不同IPSS-R評分MDS患者骨髓TIM-3表達情況比較

不同IPSS-R評分MDS患者骨髓TIM-3表達比較差異有統(tǒng)計學意義(F=14.364，P<0.05)，隨著IPSS-R評分上升，骨髓TIM-3表達增加，見表3。

表3 不同IPSS-R評分MDS患者骨髓TIM-3表達情況比較

注：①為與低危比較，P<0.05；②為與中危比較，P<0.05；③為與高危比較，P<0.05。

2.4 不同亞型MDS患者骨髓TIM-3表達情況比較

不同亞型MDS患者骨髓TIM-3表達差異有統(tǒng)計學意義(F=8.154，P<0.05)，隨MDS亞型進展，TIM-3表達增加，見表4。

表4 不同亞型MDS患者骨髓TIM-3表達情況比較

注：①為與MDS-SLD/MDS-RS比較，P<0.05；②為與MDS-MLD比較，P<0.05；③為與MDS-EB-1比較，P<0.05。

2.5 MDS患者骨髓TIM-3表達與轉白率及生存率的關系

本組75例MDS患者均隨訪至死亡或隨訪截止日，其中轉化為AML 24例，轉白率為32.00%；隨訪結束生存68例，死亡7例，MDS轉白患者骨髓TIM-3表達水平高于未轉白組，隨訪死亡組骨髓TIM-3表達水平高于生存組(P<0.05)，見表5。

表5 MDS患者骨髓TIM-3表達與轉白率及生存率的關系

注：①為與轉白組比較，P<0.05；②為與生存組比較，P<0.05。

3 討論

MDS系造血干細胞異質、克隆分化后產(chǎn)生惡性克隆細胞呈現(xiàn)無效或病態(tài)造血，導致造血功能衰竭的血液病，最終可轉化為AML，威脅患者生命安全[9]。目前對MDS發(fā)病機制的研究主要集中于體內(nèi)免疫監(jiān)視系統(tǒng)失衡、造血干細胞遺傳變異方面，以細胞免疫缺陷為主[10]。文獻報道CD123、CD25、CD96及TIM-3均優(yōu)先表達于腫瘤干細胞，可能為惡性克隆重要標志物[11]。也有分子學研究發(fā)現(xiàn)，TMI僅在腫瘤干細胞呈高表達，有較高的特異性[12]。

TIM-3屬TIM家族關鍵成員，可與磷脂酰絲氨酸結合，促進樹突狀細胞及巨噬細胞清除凋亡體，誘導細胞免疫耐受，是免疫調(diào)控負分子，在腫瘤免疫逃逸中有重要作用。TIM-3配體為半乳凝集素9，在免疫球蛋白可變區(qū)其可與TIM-3分子寡聚糖結合，產(chǎn)生免疫負調(diào)控作用，導致Th1細胞凋亡及干擾素-γ釋放減少，誘導骨髓來源的抑制性細胞增殖，引起免疫抑制。徐良靜等[13]發(fā)現(xiàn)，TIM-3+白血病細胞可重建于免疫缺陷小鼠體內(nèi)，但無法在正常小鼠體內(nèi)重建，認為TIM-3+白血病細胞含白血病干細胞功能。MDS為白血病前狀態(tài)，但目前對其造血干細胞TIMI3表達及功能尚未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，MDS患者骨髓液TIMI3在造血干細胞表達情況明顯高于非MDS，且MDS患者骨髓液TIMI3在造血干細胞上表達情況與患者染色體核型、預后評分、亞型均呈現(xiàn)一定的正性相關關系，染色體核型異質性、惡性程度高，預后評分高危及亞型進展MDS患者骨髓液TIMI3在造血干細胞上表達率較高；且隨訪生存及未轉白MDS患者TIMI3在造血干細胞上表達率較隨訪死亡、轉白者低，提示TIM-3可能為MDS造血干細胞惡性克隆的標志物，參與MDS惡性轉化過程，且與疾病預后呈密切相關。但對TIM-3在AML造血干細胞高表達率機制尚未明確，考慮增多TIM-3可能為白血病干細胞分子突變所產(chǎn)生的結果，調(diào)節(jié)髓系分化轉錄因子突變可能直接對TIM-3轉錄產(chǎn)生影響，促進TIM-3+細胞呈長生存。

綜上，TIM-3可能為AML前狀態(tài)標志物，在MDS骨髓造血干細胞呈高表達，但在非MDS造血干細胞表達率極低，且MDS患者骨髓干細胞TIM-3隨病情進展增加，且與患者不良預后存在密切關聯(lián)，推測TIM-3+干細胞可能為MDS病程中惡性克隆性細胞，參與病情進展過程。