表沒食子兒茶素沒食子酸酯對柔紅霉素與人血清白蛋白相互作用影響的光譜學(xué)及細(xì)胞毒性研究

郭慶英，劉 敏,*，趙燕娜，吳玉姝，孫 彬，劉 杰，韓 軍

1.聊城大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 聊城 252059 2.聊城大學(xué)生物制藥研究院，山東 聊城 252059

引 言

柔紅霉素[Daunomycin，DNR，圖1(a)]為第一個臨床應(yīng)用的抗腫瘤抗生素[1]。但其在臨床化療中的不良反應(yīng)，尤其是心臟毒性，使其應(yīng)用受到了限制[2]。微生物藥物學(xué)和腫瘤藥理學(xué)家甄永蘇院士指出：茶多酚與抗腫瘤藥物聯(lián)用具有增效、減毒以及逆轉(zhuǎn)耐藥性的作用，可作為生化調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于臨床[3]。兒茶素類化合物為茶多酚的主要成分，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯[epigallocatechin-3-gallate,EGCG，圖1(b)]含量最高(約占兒茶素的50%)且具有最大活性[3]。

人血清白蛋白(HSA)是血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，因其獨特的分子結(jié)構(gòu)及良好的生物相容性而成為藥物傳輸領(lǐng)域的研究熱點。晶體結(jié)構(gòu)表明HSA由585個氨基酸組成，包括三個結(jié)構(gòu)相似的域(Ⅰ—Ⅲ)。藥物與蛋白的結(jié)合直接影響藥物的吸收、分布和代謝方式，進(jìn)而影響藥效的發(fā)揮。EGCG和DNR單一藥物與人血清白蛋白之間的相互作用已有報導(dǎo)[4-5]。但遺憾的是EGCG對DNR與人血清白蛋白的相互作用及細(xì)胞毒性的影響尚未見文獻(xiàn)報導(dǎo)。本工作利用熒光光譜法、紫外-可見吸收光譜法、圓二色譜法、動態(tài)光散射研究了EGCG存在下DNR與人血清白蛋白的相互作用,測定了其結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)、焓變、熵變等熱力學(xué)參數(shù)，并從微觀結(jié)構(gòu)出發(fā)加以討論。同時考察了單一藥物、聯(lián)合藥物及藥物與蛋白復(fù)合物對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。所得結(jié)果將為EGCG與DNR的聯(lián)合用藥提供理論基礎(chǔ)。

圖1 DNR (a)和EGCG (b)的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Molecular structures of DNR (a) and EGCG (b)

1 實驗部分

1.1 試劑和細(xì)胞

人血清白蛋白(HSA，純度≥98%，分子量為66.5 kDa)，鹽酸柔紅霉素(DNR，純度≥98%)，血晶素(純度≥99%) 和四丁基溴化銨(TBAB，純度≥99%) 購自上海源葉生物科技有限公司；華法林(純度≥99%) 和布洛芬(純度≥99%)購自北京百靈威科技有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(MTT)購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher公司；人宮頸癌HeLa細(xì)胞株購自武漢普賽諾生命科技有限公司。實驗所用其他試劑均為分析純且使用前無需再次純化。實驗中使用Milli-Q水凈化系統(tǒng)中獲得的去離子水制備溶液。實驗所用緩沖溶液為在不同溫度下配制的pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液(0.05 mol·L-1)。人血清白蛋白的儲備液在4 ℃下儲存過夜。

1.2 儀器

熒光分光光度計(F-4600型，日立，日本)；紫外分光光度計(T9CS，北京，中國)；動態(tài)光散射儀(Zetasizer Nano ZS，馬爾文，英國)；圓二色光譜儀(J-810，Jasco，日本)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(HERAcell150i，Thermo，美國)；酶標(biāo)儀(Elx 808，Bio tek，美國)。

1.3 熒光光譜

1.3.1 二元體系熒光光譜

在DNR+HSA二元體系中，HSA的濃度為4×10-6mol·L-1，DNR的濃度為(0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8，3.2，3.6，4.0，4.8)×10-5mol·L-1。激發(fā)波長為295 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm，測量溫度為298.2，302.2，306.2和310.2 K，配制好的樣品恒溫30 min后測定305～420 nm范圍的熒光光譜。固定激發(fā)和發(fā)射的波長差分別為60和15 nm，其他與上述條件相同，掃描DNR存在下HSA的同步熒光光譜。

1.3.2 位點標(biāo)記

為了確定DNR在蛋白上的結(jié)合位置，用血晶素、華法林和布洛芬為標(biāo)記探針，分別標(biāo)記HSA的ⅠB，ⅡA和ⅢA結(jié)構(gòu)域[6]。首先制備標(biāo)記物與HSA的混合溶液，其中標(biāo)記物與HSA的濃度均為4×10-6mol·L-1，平衡30 min后向上述溶液中加入不同量的DNR溶液，DNR的濃度與二元體系熒光光譜實驗中相同，利用1.3.1中的實驗參數(shù)記錄DNR+(標(biāo)記物+HSA)的熒光數(shù)據(jù)。

1.3.3 三元體系熒光光譜

EGCG存在下的DNR+(EGCG+HSA)三元體系中，EGCG與HSA的摩爾比為1∶1，其他條件均與二元體系熒光光譜實驗一致。

1.4 紫外吸收光譜

HSA的濃度為5×10-6mol·L-1，DNR 的濃度分別為(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0和6.0)×10-5mol·L-1，以pH 7.4的Tris-HCl 緩沖溶液為參比，測定DNR存在下HSA在245～305 nm波長范圍內(nèi)的紫外吸收光譜。

1.5 圓二色光譜

所測溶液為HSA (2×10-6mol·L-1)、HSA+DNR (HSA∶DNR=1∶5或1∶15)、HSA+EGCG (HSA∶EGCG=1∶2)與(HSA+EGCG)+DNR(HSA∶EGCG∶DNR=1∶2∶15)。掃描波長為200～250 nm，掃描速率為200 nm·min-1，分辨率為0.1 nm，響應(yīng)時間為1 s，累積次數(shù)3次。

1.6 動態(tài)光散射

HSA的濃度保持為1.5×10-5mol·L-1。HSA+DNR二元體系中，HSA與DNR的摩爾比為1∶5或1∶15。(HSA+EGCG)+DNR三元體系中，HSA∶EGCG∶DNR為1∶2∶15。測量粒徑前所有溶液皆通過0.22 μm的水系過濾頭(Millipore公司，美國)進(jìn)行過濾，測量溫度為25 ℃。

1.7 體外細(xì)胞毒性

所用HeLa細(xì)胞株利用DMEM培養(yǎng)基 (含10%胎牛血清和100 U·mL-1的青霉素、鏈霉素)，于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更換一次培養(yǎng)液，用胰酶消化并傳代，留取對數(shù)期細(xì)胞用于MTT實驗，以測定DNR，HSA+DNR，EGCG+DNR以及HSA+EGCG+DNR復(fù)合物對HeLa細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。將HeLa細(xì)胞以3×103個·孔-1的密度接種在96孔板上，0.1 mL含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，然后用0.1 mL含有藥物或藥物復(fù)合物且不含有血清的培養(yǎng)基替換原先培養(yǎng)基，其中HSA∶DNR=1∶1，HSA∶EGCG∶DNR=1∶1∶1，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入20 μL MTT (PBS配制濃度為5 mg·mL-1)，培養(yǎng)4 h后除去孔中溶液，每孔加入150 mL DMSO使用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜法

2.1.1 DNR對HSA猝滅機(jī)制的研究

如圖2所示，在激發(fā)波長為295 nm時，HSA在338 nm處產(chǎn)生內(nèi)源熒光。隨著DNR濃度的增大，HSA的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)有規(guī)律的降低，峰形和峰位保持不變，表明DNR對HSA存在熒光猝滅現(xiàn)象，二者存在相互作用。

熒光猝滅機(jī)制分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅，可以通過猝滅常數(shù)與溫度的關(guān)系來進(jìn)行判斷。熒光猝滅常數(shù)可利用Stern-Volmer方程求得[7]

F0/F=1+KSV[Q]=1+kqτ0[Q]

(1)

式(1)中，F(xiàn)0和F分別為加入猝滅劑前后HSA的熒光強(qiáng)度，KSV為猝滅常數(shù)，kq為猝滅速率常數(shù)，τ0為HSA的熒光壽命，約為10-8s[8]，[Q]為猝滅劑的濃度。

圖2 pH 7.4，298.2 K下DNR對HSA的熒光猝滅光譜(DNR∶HSA=1～12)Fig.2 Fluorescence emission spectra of HSA in the presence of DNR (DNR∶HSA=1～12) at 298.2 K,pH 7.4

不同溫度下的F0/F對DNR濃度作圖均呈良好線性關(guān)系，所得猝滅速率常數(shù)列于表1中。由表1可見，猝滅速率常數(shù)kq數(shù)量級均為1012，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1，并且可以看出在298.2，302.2，306.2和310.2 K下，隨著溫度的升高HSA的猝滅常數(shù)減小，由此可以推測出DNR與HSA形成復(fù)合物，此過程為靜態(tài)猝滅過程。

紫外吸收光譜法用于DNR與HSA結(jié)合機(jī)制的驗證。不同濃度DNR對HSA紫外吸收光譜的影響如圖3所示，隨著DNR濃度的增加，HSA吸光度增大，表明DNR與HSA之間形成復(fù)合物。另外對于靜態(tài)猝滅來說，蛋白的吸收強(qiáng)度由于生成復(fù)合物而改變，動態(tài)猝滅則不會變化。圖3中插圖所示為紫外差譜圖，圖中(HSA+DNR)-DNR吸收譜線與HSA的吸收譜線存在差異，該結(jié)果進(jìn)一步表明DNR與HSA相互作用為靜態(tài)猝滅過程[9]。

圖3 298.2 K時DNR存在下HSA的紫外吸收光譜圖，插圖為差譜圖，c(HSA)=c(DNR)=5×10-6 mol·L-1Fig.3 Absorption spectra of HSA in the presence of DNR at 298.2 K. The inset corresponds to the absorption spectra of HSA only and the difference absorption spectra between HSA+DNR and DNR at the same concentration,c(HSA)=c(DNR)=5×10-6 mol·L-1

表1 不同溫度下DNR與HSA相互作用的猝滅速率常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)和吉布斯自由能變Table 1 Quenching rate constants,binding constants,the number of binding sites and Gibbs free energy changes for the interaction of DNR with HSA at different temperatures

2.1.2 DNR與HSA結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

對于靜態(tài)猝滅，相互作用過程中的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點數(shù)(n)可以通過下列方程得到[10]

log[(F0-F)/F]=logKa+nlog([Q]0-n(F0-F)[P]0/F0)

(2)

其中[Q]0和[P]0分別為藥物與蛋白的總濃度。如本課題組前期工作[8]中所述，在Microsoft Excel中賦予n的初值為1，log[(F0-F)/F]對log([Q]0-n(F0-F)[P]0/F0)作圖并線性擬合得到一個n值，多次擬合直到n值為定值不再變化。由log[(F0-F)/F]對log([Q]0-n(F0-F)[P]0/F0)的最終線性作圖(圖4)，所得結(jié)合常數(shù)Ka與結(jié)合位點數(shù)n列于表1中。由表1數(shù)據(jù)可見，所測溫度下的結(jié)合位點數(shù)n均約為1，表明利用熒光方法所得DNR在HSA上有一個結(jié)合位點。四個溫度下結(jié)合常數(shù)數(shù)量級均為104，且隨著溫度升高而增加，表明DNR與HSA的結(jié)合為中等強(qiáng)度的結(jié)合，高溫有利于DNR的結(jié)合。

當(dāng)溫度變化不太大時，焓變可看作一個常數(shù)，則焓變和熵變可由298.2，302.2，306.2和310.2 K四個溫度下DNR與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)利用Van’t Hoff方程式(3)求得[11]

lnKa=-ΔHo/RT+ΔSo/R

(3)

吉布斯自由能變ΔGo由式(4)求得[11]

ΔGo=ΔHo-TΔSo=-RTlnKa

(4)

lnKa對1/T作圖得DNR與HSA相互作用的焓變和熵變分別為40.92±0.52 kJ·mol-1和221.83±1.70 J·mol-1·K-1，表明結(jié)合過程主要為熵驅(qū)動，且疏水作用為結(jié)合過程的主要驅(qū)動力[12]。

圖4 不同溫度下，DNR+HSA作用的Stern-Volmer曲線Fig.4 Modified Stern-Volmer plots for DNR+HSA interaction at different temperatures

2.1.3 DNR在HSA上的結(jié)合位點

為了確定DNR在HSA上的結(jié)合位置，在298.2 K下分別用血晶素、華法林和布洛芬作為位點ⅠB，ⅡA和ⅢA的特異性探針進(jìn)行了競爭標(biāo)記實驗。標(biāo)記物存在下，DNR與HSA相互作用的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù)列于表2。與不存在標(biāo)記物相比，存在華法林時DNR與HSA的結(jié)合明顯減弱；布洛芬和血晶素存在下，結(jié)合常數(shù)略有減小，表明DNR與華法林存在競爭作用，即主要結(jié)合在HSA的位點ⅡA上。

表2 298.2 K，標(biāo)記物存在下DNR與HSA的結(jié)合常數(shù)(Ka)與結(jié)合位點數(shù)(n)Table 2 Binding constants (Ka) and the number of binding sites (n) for the binding of DNR to HSA in the presence of site markers at 298.2 K

2.1.4 DNR存在下HSA的同步熒光光譜

當(dāng)Δλ為15和60 nm時，同步熒光分別為酪氨酸和色氨酸殘基的熒光特性。圖5所示為DNR與HSA結(jié)合的同步熒光光譜圖。當(dāng)Δλ=15 nm和Δλ=60 nm時，同步熒光的最大發(fā)射波長均沒有明顯變化，表明DNR的加入不會使色氨酸和酪氨酸周圍的微環(huán)境發(fā)生明顯變化。DNR對HSA同步熒光的猝滅結(jié)果表明Δλ=60 nm時的熒光猝滅程度明顯高于Δλ=15 nm時，這表明Δλ=60 nm時DNR對HSA的猝滅更明顯，即DNR在HSA上的結(jié)合位置更接近色氨酸殘基。

2.1.5 EGCG存在下對DNR與HSA親和力的影響

由標(biāo)記實驗得出DNR結(jié)合于HSA的ⅡA位點，文獻(xiàn)表明EGCG同樣結(jié)合于ⅡA位點[8]。為說明一種藥物的存在對HSA與另一種藥物親和力的影響，進(jìn)行了三元體系競爭實驗。圖6為EGCG存在下DNR與HSA在298.2 K下相互作用的熒光光譜圖。由圖可看見，DNR的加入導(dǎo)致HSA的熒光強(qiáng)度進(jìn)一步降低，表明EGCG存在下DNR繼續(xù)與HSA結(jié)合。

圖5 HSA (4×10-6 mol·L-1)與DNR (0～4.8×10-5 mol·L-1) 相互作用的同步熒光光譜圖Fig.5 Synchronous fluorescence spectra for the interaction of HSA (4×10-6 mol·L-1) with DNR (0～4.8×10-5 mol·L-1)

圖6 DNR與HSA在EGCG存在下的熒光光譜圖1:HSA；2:HSA+EGCG；3～13:(HSA+EGCG)+DNRFig.6 Fluorescence spectra of DNR+HSA in the presence of EGCG1:HSA；2:HSA+EGCG；3～13:(HSA+EGCG)+DNR

由于EGCG和DNR結(jié)合在蛋白的相同位點上，則可如前期工作[8]所述建立三元體系模型。利用EGCG存在下不同濃度的DNR對應(yīng)的HSA熒光強(qiáng)度，通過Matlab進(jìn)行非線性最小二乘回歸使實驗測量的熒光強(qiáng)度Fexp與計算所求熒光強(qiáng)度Fcalc之差的平方和∑(Fexp-Fcalc)2最小，則可擬合得到EGCG存在下DNR與HSA相互作用的Kα2和n(表3)。由表3可知，DNR在EGCG存在下與HSA作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點數(shù)均明顯減小，這主要是由于EGCG和DNR結(jié)合在HSA的相同位點上，EGCG的存在降低了DNR與HSA的親和力，從而導(dǎo)致DNR的游離濃度增加。此外，當(dāng)溫度由298.2 K升高至310.2 K時，三元體系的結(jié)合常數(shù)增大，表明EGCG存在下，DNR與HSA的結(jié)合仍為吸熱過程，即EGCG存在下，DNR與HSA的主要作用力仍為疏水作用。

表3 存在和不存在EGCG下，DNR與HSA結(jié)合的結(jié)合常數(shù)(Ka)和結(jié)合位點數(shù)(n)Table 3 Binding constants (Ka) and the number of binding sites (n) for the binding of DNR to HSA in the absence and presence of EGCG

2.2 EGCG存在下DNR與HSA結(jié)合的二級結(jié)構(gòu)變化

HSA，HSA+DNR及(HSA+EGCG)+DNR的圓二色光譜圖在208和220 nm處出現(xiàn)兩個負(fù)峰，表明體系中主要的二級結(jié)構(gòu)組成為α-螺旋[13-14]。α-螺旋含量可用式(5)和式(6)計算[8]

MRE=observed CD/(cp×n×l×10)

(5)

α-helix(%)=[(-MRE208-4 000)/

(33 000-4 000)]×100

(6)

其中，MRE表示殘基橢圓率，cp表示蛋白的濃度，n和l分別為氨基酸殘基數(shù) (585)和光路徑長度(0.1 cm)。表4中數(shù)據(jù)表明DNR的加入使HSA的α-螺旋含量減少，且隨著DNR濃度增加進(jìn)一步減少，表明DNA的結(jié)合使得HSA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化。EGCG的存在使HSA的α-螺旋含量減少，但是在EGCG存在的三元體系中α-螺旋含量大于相應(yīng)的二元體系的α-螺旋含量，表明兩種藥物存在競爭結(jié)合，即EGCG的存在阻礙了DNR與HSA的結(jié)合。

表4 存在或不存在EGCG時，HSA和DNR+HSA的α-螺旋含量與水合粒徑(Dh)Table 4 The α-helical contents and hydrodynamic diameters of HSA and HSA+DNR in the absence and presence of EGCG

2.3 EGCG存在下DNR與HSA結(jié)合的粒徑變化

HSA，HSA+DNR及(HSA+EGCG)+DNR體系的水合粒徑(Dh)值列于表4中。所測體系的多分散性指數(shù)在0.1～0.2之間，表明即使藥物存在下的二元與三元復(fù)合物的尺寸也呈均勻分布。在DNR與HSA相互作用后，顆粒直徑略微增加，表明由于藥物分子與HSA的結(jié)合導(dǎo)致復(fù)合物結(jié)構(gòu)松散。但是HSA∶DNR=1∶15時，EGCG的存在使Dh的值相較于二元體系減小，表明EGCG與DNR存在競爭結(jié)合，EGCG使DNR與HSA的結(jié)合減弱，與CD結(jié)果一致。

2.4 體外細(xì)胞毒性實驗

通過MTT法測量DNR，HSA+DNR，EGCG+DNR和HSA+EGCG+DNR對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。細(xì)胞毒性的計算方法如式(7)[15]

Cytotxicity=(A-B)/A×100%

(7)

其中，A和B分別為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)及加有藥物或藥物-蛋白復(fù)合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞的吸光度。

圖7 DNR，HSA+DNR(a)，EGCG+DNR以及HSA+EGCG+DNR(b)對HeLa細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性Fig.7 In vitro cytotoxicity of DNR，HSA+DNR (a)，EGCG+DNR and HSA+EGCG+DNR (b) in HeLa Cells

兩種藥物對同一細(xì)胞的協(xié)同作用可通過式(8)計算[16]

CI=(D)1/(Dx)1+(D)2/(Dx)2

(8)

其中，CI表示組合指數(shù)，(Dx)1和(Dx)2為單一藥物作用達(dá)到x%時藥物的濃度，D1和D2為兩種藥物共同作用達(dá)到x%時藥物的濃度。本文中，x%指50%抑制。

圖7(a,b)為DNR，HSA+DNR，EGCG+DNR及HSA+EGCG+DNR對人宮頸癌HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。由圖看見，DNR對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性具有劑量依賴性[圖7(a)]。計算得到上述四個體系的IC50值分別為(0.09，0.04，0.07和0.01)×10-6mol·L-1。IC50值表明HSA的加入使DNR的細(xì)胞毒性增大，其原因可能為DNR+HSA大分子復(fù)合物更容易使藥物通過內(nèi)吞的形式進(jìn)入細(xì)胞，從而更好地發(fā)揮作用。

CI>1，CI=1和CI<1時分別表示兩種藥物的加和、拮抗和協(xié)同作用。EGCG+DNR和HSA+EGCG+DNR復(fù)合物的CI50值分別為0.82和0.78，均小于1，表明EGCG與DNR存在協(xié)同作用，并且HSA存在下協(xié)同作用進(jìn)一步增強(qiáng)。這主要是由于EGCG與DNR結(jié)合在HSA的相同位點上，EGCG的存在導(dǎo)致DNR的游離濃度增加。并且藥物與HSA結(jié)合形成的大分子復(fù)合物更容易內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，從而更好地發(fā)揮作用。此結(jié)果表明EGCG能夠增強(qiáng)DNR對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。此結(jié)果將為EGCG和DNR用于癌癥聯(lián)合治療提供理論依據(jù)。

3 結(jié) 論

通過多種光譜方法研究了模擬生理條件下DNR與HSA的相互作用以及EGCG對DNR與HSA結(jié)合的影響。并且通過MTT法考察了單一藥物、組合藥物及其與HSA的復(fù)合物對HeLa細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性。實驗結(jié)果表明，DNR與HSA的結(jié)合為靜態(tài)猝滅過程，其結(jié)合過程的主要驅(qū)動力為疏水作用力。標(biāo)記實驗表明DNR主要結(jié)合在HSA的位點ⅡA上。同步熒光光譜表明DNR在HSA上的結(jié)合更接近色氨酸殘基。在(HSA+EGCG)+DNR三元體系中，EGCG的存在阻礙了DNR與HSA的結(jié)合，這是由于兩種藥物結(jié)合于HSA的同一位點，而存在競爭結(jié)合。CD光譜和DLS結(jié)果表明與DNR結(jié)合后蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化，α-螺旋含量減少，蛋白粒徑增大。EGCG存在下α-螺旋含量大于相應(yīng)的二元體系，而粒徑相對于二元體系的有所減小。體外細(xì)胞毒性實驗結(jié)果表明EGCG與DNR的組合對HeLa細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同抗腫瘤作用。此外，DNR單一藥物和EGCG+DNR組合藥物的細(xì)胞毒性可通過它們與HSA的結(jié)合在一定程度上得到增強(qiáng)。本研究可為EGCG和DNR聯(lián)合用于癌癥臨床治療提供理論依據(jù)。