低共熔溶劑提取香椿籽總黃酮效率的研究

岳少云，金 鑫，董新月，屈長青,2*

（1.阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 阜陽 236037）

香椿（Toona siensis(A.Juss.)Roem.）屬楝科香椿屬，是多年生落葉喬木，其頂端嫩芽、嫩葉脆嫩多汁，芳香馥郁，風(fēng)味獨特，是我國的傳統(tǒng)木本蔬菜。香椿的根皮、樹皮、芽、于治療各種各樣的疾病[1]。香椿籽富含黃酮類化合物，具有多種藥理活性，如抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等，特別是抗自由基及抗癌、防癌的作用[2-3]。就香椿籽總黃酮的提取方法而言，多是傳統(tǒng)的水提和醇提法[4-6]，這些傳統(tǒng)的方法存在原料損耗大，得率不高等問題。

低共熔溶劑(deep eutectic solvents,DES)是由一定化學(xué)計量比的固體鹵化物鹽的氫鍵受體和氫鍵供體組合而成的低共熔混合物，其熔點顯著低于各個組分物質(zhì)。DES作為一種新型的高級溶劑，是一種可完全生物降解和生物相容性材料[7,8]。DES結(jié)合了離子液體的特點，且廉價無毒，制備工藝簡單，只需加熱和機械攪拌即可。近年來以氯化膽堿為基礎(chǔ)的水溶性DES成功的在各個領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，從物理、材料、化工等領(lǐng)域到藥用植物中高效的提取和分離得到生物堿、黃酮、多糖和酸類等化合物[9-12]。該方法已被證明比傳統(tǒng)的提取方法更廉價、綠色、高效，但利用該溶劑提取香椿籽總黃酮的研究還未見相關(guān)報道，因此本實驗采用不同綠色低共熔法對香椿籽總黃酮進行了提取，與傳統(tǒng)的實驗方法進行了比較，完成了多元醇類氫供體的初篩，且優(yōu)化了水溶性DES的提取香椿籽總黃酮的參數(shù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

香椿籽由安徽省抗衰老中草藥研究中心提供（購自阜陽市太和縣）；1,2-丙二醇、丙三醇、1,4-丙二醇（購自無錫市展望化工試劑有限公司）和氯化膽堿（購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；蘆?。ㄙ徸詿o錫市展望化工試劑有限公司）；乙醇（＞95%）等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

紫外分光光度計（730，Germany）；電子天平(AR224CN，上海精密科學(xué)儀器有限公司)；智能恒溫水浴鍋（HW-SY-P3S，北京東方精瑞科技發(fā)展有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE5203，安徽沃特科學(xué)儀器有限公司）；KQ-50B型超聲波清洗器（50B，昆山超聲有限公司）；傅里葉紅外光譜儀（安捷倫科技公司）

2 方法

2.1 制備DES溶劑

按照Tzia報道的方法[13]，將下表不同醇類氫供體的DES置于錐形瓶中，65℃水浴并攪拌，直至形成均一的液體。待均一的液體形成后，將水按比例加入DES溶劑中,放置備用。

2.2 香椿籽總黃酮的提取

參考Zhao等方法，將0.2 g香椿籽粉末混合于5 mL表1各DES溶劑中，超聲15 min，4 000 r/min離心25 min，過濾，將濾液與等量的鹽酸水溶液混合，并將混合液在65℃磁力攪拌20 min，過濾，棄去沉淀，用蒸餾水定容至100 mL，然后利用AB-8樹脂進行純化，最后用70%～95%梯度乙醇將總黃酮進行回收[14]。將純化回收的香椿籽總黃酮進行減壓蒸餾至4 mL放置,測定總黃酮含量。同時制備水和75%醇法提取香椿總黃酮。

表1 不同類型的DES的配制方法

2.3 香椿籽總黃酮含量的測定

精密稱取蘆丁對照品50 mg，置50 mL容量瓶中，以0.95乙醇溶解并加至刻度，精密吸取10 mL置100 mL容量瓶中，用0.60乙醇稀釋至刻度。用移液槍分別吸取 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對照液（0.1 mg/mL）置于10 mL容量瓶中，向每個容量瓶內(nèi)加入0.3 mL亞硝酸鈉溶液（濃度為5%），震蕩搖勻，室溫下靜置6 min；再加0.3 mL硝酸鋁溶液（濃度為10%），震蕩搖勻，室溫下靜置6 min；最后加4 mL氫氧化鈉溶液（濃度為4%），用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇定容至刻度，搖勻，室溫下靜置12 min，以試劑作空白參比液，于紫外分光光度計510 nm處測定各組吸光值（OD值）[17]，計算其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 DES的紅外表征

根據(jù)不同的氫供體和氫受體合成的DES，具有不同的物理性質(zhì)，如導(dǎo)電率、密度、粘度、表面張力等，本實驗通過DES的初篩比較，確定1，2丙二醇作為氫供體在香椿子總黃酮提取中相比其它多元醇類氫供體具有更高的提取率的條件下，對其進行紅外表征。

2.5 參數(shù)優(yōu)化

在以紅外表征確定最佳多元醇類氫供體的基礎(chǔ)上，分別進行 HBA 和 HDA 的摩爾比（1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5），DES 的含水率(10%，20%，30%，40%，50%)，DES 與香椿籽粉末的液固比（1∶25，1∶50，1∶100，1∶200/（mg·mL-1）及提取時間（15，25，35，45/min）來篩選最佳提取參數(shù)。

2.6 數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計學(xué)的方法，對數(shù)據(jù)進行分析，文中所用的數(shù)據(jù)都是以（平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）表示，采用SPSS 19.0對所得數(shù)據(jù)進行顯著性差異分析。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)2.3的計算結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程Y=11.035x+0.004 7，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7。表明蘆丁濃度在0～0.06 mg/mL范圍內(nèi)與吸光度存在較好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 不同醇類氫供體的DES與傳統(tǒng)方法的比較

本實驗中，氯化膽堿-1,2丙二醇低共熔溶劑所提取的總黃酮平均含量0.015 1 mg/mL，與75%乙醇提?。?.002 7 mg/mL）和水提取（0.002 0 mg/mL）形成顯著性差異，且氯化膽堿-1,2丙二醇DES相比較其他兩種多元醇類DES提取效率更高如圖2。

圖2 不同DES、水、乙醇提取的香椿籽總黃酮濃度比較

3.3 Chcl-1,2-丙二醇的紅外表征

由圖3可知，3 255 cm-1為氯化膽堿的特征吸收峰，其中1 085 cm-1屬于O-H和C-H震動，3B中 3 384 cm-1，2 970 cm-1，2 932 cm-1為 OH-震動峰，與一般的0H-震動相比其峰寬可能是由于形成氫鍵所致，圖3（C）中Chcl:1,2-丙二醇的CH3震動峰為1 402 cm-1。由此可知Chcl:1,2-丙二醇（1∶3）紅外表征成功。

圖3 紅外光譜圖。A：氯化膽堿；B：1,2-丙二醇；C：Chcl:1,2-丙二醇

3.4 提取條件優(yōu)化

在確定為氯化膽堿-1,2丙二醇低共熔溶劑后，發(fā)現(xiàn)摩爾比、含水率、固液比及提取時間對香椿籽總黃酮的提取率均有影響，同時得出含水率30%摩爾比為 1∶3，固液比為 1∶50，提取時間為35 min時，提取香椿籽總黃酮的效率最高如圖4。

4 討論

近年來DES作為一種綠色高效提取介質(zhì)在中草藥活性成分提取方面，展現(xiàn)出了驚人的優(yōu)勢，如基于綠色低共融溶劑法提取總黃酮、一種新型天然低共融溶劑用于玉竹總黃酮的提取等[19-20]，但在香椿的活性成分提取方面大多是以傳統(tǒng)的（水提、醇提）提取方法為主，這不僅使香椿活性成分的提取率低下，也限制了香椿由食品向藥用的轉(zhuǎn)化，因此如何提高香椿的活性成分提取率成為亟待解決的問題。

本研究通過不同多元醇類氫供體篩選了水溶性綠色低共熔溶劑提取香椿籽總黃酮的工藝，利用單因素實驗對提取參數(shù)（摩爾比、含水量、固液比、提取時間）進行了優(yōu)化，獲得了UAE法提取香椿籽總黃酮的最佳工藝條件：以含水率30%的氯化膽堿-1，2-丙二醇為提取劑，摩爾比為1∶3，固液比為1∶50，提取時間為35 min,提取香椿籽總黃酮。通過與傳統(tǒng)的提取方法（水（0.002 0）和75%乙醇（0.002 7））相比，DES從香椿籽中提取總黃酮的效率更高。這說明DES在提取香椿活性成分方面優(yōu)于傳統(tǒng)的提取方法，也為香椿活性成分的提取提供了新的方法。

此外，DES的性質(zhì)如摩爾比及組成對香椿活性成分的提取率均有影響,而DES作為介質(zhì)在與香椿活性成相互作用時，固液比、含水率、提取溫度對提取率亦有重要的作用，不同氫供體的選擇對于DES形成及物理性質(zhì)是非常重要的，氫供體的多少決定著DES提取的高效性和穩(wěn)定性[9]。本實驗中隨著氫供體摩爾比的增加（1∶1～1∶3）提取效率逐漸升高，且在 1∶3 達到最高，1∶4～1∶5 提取效率下降，主要是由于氫供體過多導(dǎo)致氯化膽堿與香椿籽總黃酮結(jié)合力下降所致。同時DES在形成之后，會裸露很多的供體羥基化學(xué)集團，因此，加入適當(dāng)?shù)乃畷c這些集團形成更多的氫鍵，使得DES更加穩(wěn)定，但過多的水在結(jié)合集團飽和之后使得DES的濃度下降，且在中藥活性成分提取中，不同的固液比展現(xiàn)出不同的提取效率，如本實驗DES提取香椿籽總黃酮中，液固比過小會導(dǎo)致DES分子間形成氫鍵，從而對香椿籽中的黃酮不能充分的提取，液固比過大會導(dǎo)致DES不能充分結(jié)合香椿籽總黃酮影響提取效率，此外隨著提取，隨著時間的延長DES揮發(fā)導(dǎo)致提取率下降，因此，在應(yīng)用DES提取活性成分時，對DES自身的性質(zhì)及與介質(zhì)相互作用的參數(shù)的考察的是至關(guān)重要的[19-20]。

圖4 不同處理得到的香椿籽總黃酮量。A：氫供體摩爾比；B：含水率；C:固液比；D:提取時間

5 小結(jié)

本實驗以香椿籽為材料，篩選了多元醇類氫供體的的DES，且用單因素實驗優(yōu)化了提取參數(shù)，證明了在香椿籽總黃酮的提取方面，DES相比傳統(tǒng)的提取方法有著更高的提取效率，這不僅給香椿活性成分的提取提供了一種快速、綠色、高效的方法，也可以為香椿深加工的應(yīng)用提供參考。