二苯乙烯苷和遠(yuǎn)志總皂苷配伍對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的影響

張運(yùn)輝 周小青 伍大華 楊夢琳 鄭彩杏 童天昊 張祺杰

〔摘要〕 目的 探討二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene glycoside， TSG）和遠(yuǎn)志總皂苷（Tenuigenin， TEN）配伍對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的影響。方法 PC12細(xì)胞除空白組外運(yùn)用Aβ25-35誘導(dǎo)建立阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease， AD）模型，被隨機(jī)分成模型組、TSG（200 mmol/L）組、TEN組（100 mg/L）、TSG-TEN配伍組（TSG200 mmol/L+TEN100 mg/L）、多奈哌齊組（10 ？滋mol/L）。采用MTT比色法檢測各組細(xì)胞存活率;取細(xì)胞上清液分別測各組的乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）含量及乙酰膽堿酯酶（AchE）、超氧化物歧化酶（SOD）活力;統(tǒng)計(jì)各組的細(xì)胞分化率。結(jié)果 （1）細(xì)胞存活率的高低為：TSG-TEN組>TSG組>多奈哌齊組>TEN組（P<0.01）;TSG組、TEN組、多奈哌齊組均低于TSG-TEN配伍組（P<0.01，P<0.05）;（2）與模型組比較，TSG組、TEN組、TSG-TEN配伍組可降低LDH含量、MDA含量、抑制AchE活力及增強(qiáng)SOD活力（P<0.05）。且TSG-TEN配伍組對降低LDH含量、MDA含量、抑制AchE活力及增強(qiáng)SOD活力效應(yīng)比TSG或TEN單用組效應(yīng)更好（P<0.01）;（3）PC12細(xì)胞的分化率高低為：TSG-TEN組>多奈哌齊組>TSG組>TEN組（P<0.01，P<0.05）;TSG組、TEN組、多奈哌齊組均低于TSG-TEN配伍組（P<0.01，P<0.05）。結(jié)論 TSG和TEN配伍對Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有顯著的協(xié)同保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與改善膽堿能系統(tǒng)、抗氧化應(yīng)激、降低突觸可塑性損傷有關(guān)，且TSG優(yōu)于TEN。

〔關(guān)鍵詞〕 阿爾茨海默病;遠(yuǎn)志總皂苷;二苯乙烯苷;突觸可塑性

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of tetrahydroxy stilbene glycoside （TSG） and tenuigenin （TEN） on the injury of PC12 cells induced by Aβ25-35. Methods PC12 cells were induced by Aβ25-35 to establish a PC12 cell model of Alzheimer's disease （AD）. After modeling， PC12 cells were randomly divided into a blank group， a model group， a TSG （200 mmol/L） group， a TEN group （100 mg/L）， a TSG-TEN compatibility group （TSG 200 mmol/L + TEN 100 mg/L） and a donepezil group （10 umol/L）.? MTT colorimetry was used to detect cell viability in each group; The lactate dehydrogenase （LDH） and malondialdehyde （MDA） content， acetylcholinesterase （AchE） and superoxide dismutase （SOD） activity in cell supernatant of each group were measured. The cell differentiation rate of each group was caculated. Results （1） The cell survival rate was TSG-TEN group﹥TSG group﹥donepezil group﹥TEN group （P<0.01）. Compared with the TSG-TEN combination group， the TSG group， the TEN group and the donepezil group were lower than the TSG-TEN compatibility group （P<0.01， P<0.05）. （2） Compared with the model group， TSG group， TEN group and TSG-TEN combination group could decrease LDH and MDA content， inhibit the activity of AchE， and increase SOD activity （P<0.05）， and the effect of TSG+TEN compatibility group on reducing the content of LDH and MDA， inhibiting the activity of AchE， and increasing SOD activity was better than that of TSG or TEN alone group （P<0.01）. （3） The differentiation of PC12 cells was： TSG-TEN group﹥donepezil group﹥TSG group﹥TEN group （P<0.01）. Compared with the TSG-TEN combination group， the TSG group， the TEN group and the donepezil group were lower than the TSG-TEN compatibility group （P<0.01）. Conclusion The combination of TSG and TEN has a synergistic protective effect on PC12 cell injury induced by Aβ25-35. The mechanism may be related to the improvement of cholinergic system， anti-oxidative stress and reducing synaptic plasticity damage， and TSG is superior to TEN.

〔Keywords〕 Alzheimer's disease; tenuigenin; tetrahydroxy stilbene glycoside; synaptic plasticity

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種老年人中最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，其主要以進(jìn)行性記憶喪失和認(rèn)知缺陷為臨床特征。近年來，許多學(xué)者研究證實(shí)，補(bǔ)腎化痰益智法對AD具有顯著的防治作用[1-2]，故提出補(bǔ)腎化痰益智法為治療AD的根本大法之一。補(bǔ)腎益智藥何首烏配伍化痰藥遠(yuǎn)志是臨床上治療AD的常用藥對。研究已證明，何首烏的主要藥效物質(zhì)二苯乙烯苷（tetrahydroxy stilbene glycoside， TSG）能通過增高膽堿乙酰基轉(zhuǎn)移酶乙酰/膽堿酯酶的比值、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)神經(jīng)突觸的結(jié)構(gòu)和功能等明顯提高擬AD動(dòng)物模型學(xué)習(xí)記憶功能[3]。已有研究顯示，遠(yuǎn)志的主要藥效物質(zhì)遠(yuǎn)志總皂苷（Tenuigenin， TEN）能顯著調(diào)控膽堿能系統(tǒng)和抑制氧化應(yīng)激損傷[4]。研究團(tuán)隊(duì)前期研究表明，TSG（200 mmol/L）和TEN（100 mg/L）分別是抑制AD損傷的主要有效劑量，且兩者配伍對神經(jīng)細(xì)胞損傷有顯著的協(xié)同保護(hù)效應(yīng)。因此，從膽堿能神經(jīng)損害、氧化應(yīng)激反應(yīng)、突觸可塑性損傷三方面繼續(xù)探究TSG和TEN配伍對AD損傷的作用機(jī)制。

1 材料

1.1? 細(xì)胞

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻瘤細(xì)胞株P(guān)C12（永久性，高分化），購自湖南長沙贏潤生物技術(shù)有限公司，編號(hào)為2015032007。

1.2? 實(shí)驗(yàn)試劑

TSG（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)130725，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）;TEN（北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，批號(hào)111572-200702，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%）;Aβ25-35（美國Sigma公司）;鹽酸多奈哌齊片（中國衛(wèi)材藥業(yè)有限公司）;DMSO（Sigma公司）;FBS（吉泰遠(yuǎn)成生物科技有限公司，批號(hào)1133067）;AchE（批號(hào)20140912）、SOD 試劑盒（批號(hào)20140911）、MTT（批號(hào)20140916）、MDA試劑盒（批號(hào)20140904）、LDH試劑盒（批號(hào)20140911）均來自于南京建成生物工程研究所;DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液[賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司，批號(hào)NZL1253];10%新生小牛血清（Hyclone Lab）;PBS（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20140605）等。

1.3? 主要儀器

DL-CJ-2NDI型超凈工作臺(tái)（中國北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）;Galaxy 170R型CO2培養(yǎng)箱（中國上海百賽生物技術(shù)有限公司）;UV1800ENG240V型紫外分光光度計(jì)（中國島津有限公司）;Primo Vert型倒置顯微鏡（Carl Zeiss Jena德國）;Eppendorf 5804R型低溫高速離心機(jī)（Eppendorf 5810R德國）。

2 方法

2.1? PC12細(xì)胞培養(yǎng)

用含5%馬血清和10%胎牛血清的DMEM，在95% O2、5% CO2、37 ℃條件下培育PC12細(xì)胞，每隔1天傳代1次，待PC12細(xì)胞增長至80%融合時(shí)，取0.25%胰酶消化細(xì)胞，隨后調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)/mL，接種或傳代于細(xì)胞培養(yǎng)板，取對數(shù)生長期細(xì)胞應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2? TSG和TEN配伍劑量的確定

本課題組前期研究表明，TSG（200 mmol/L）和TEN（100 mg/L）是抑制AD損傷的有效劑量，且兩者配伍對神經(jīng)細(xì)胞損傷有明顯協(xié)同保護(hù)作用。故擬定200 mmol/L和100 mg/L分別為TSG和TEN抗AD細(xì)胞損傷的配伍劑量。

2.3? 分組及藥物干預(yù)

待細(xì)胞至對數(shù)生長期時(shí)，將上述方法“2.1”培養(yǎng)的PC12細(xì)胞，以2×105/mL密度，隨機(jī)接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔滴加100 μL細(xì)胞懸液，分為6個(gè)組，每組為8個(gè)孔。用20 μmol/L Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞建AD模型[5]。24 h后6組分別進(jìn)行不同的藥物干預(yù)：（1）空白組（正常的PC12細(xì)胞），（2）模型組（20 μmol/L Aβ25-35），（3）TSG組（20 μmol/L Aβ25-35+200 mmol/L TSG），（4）TEN組（20 μmol/L Aβ25-35+100 mg/L TEN），（5）TSG-TEN組（20 μmol/L Aβ25-35+200 mmol/L TSG+100 mg/LTEN）組，（6）多奈哌齊組（20? μmol/L Aβ25-35+10 μmol/L多奈哌齊）。均繼續(xù)培育24 h。

2.4? MTT比色法檢測各組的細(xì)胞存活率

將5×MTT稀釋成1×MTT溶液;每孔滴加50 μL 1×MTT溶液，37 ℃培養(yǎng)箱孵育4 h;棄上清液，每個(gè)孔滴入200 μL DMSO，并在平板搖床上搖2～3 min使其充分混勻。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測各個(gè)孔的OD，計(jì)算PC12細(xì)胞的存活率。

2.5? 細(xì)胞分化率測定

將96孔培養(yǎng)板置于倒置顯微鏡（10×40）下觀察，每個(gè)孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野記錄細(xì)胞總數(shù)與具有突起的細(xì)胞數(shù)量，算出各組細(xì)胞分化率并進(jìn)行比較，觀察藥物對細(xì)胞突起的保護(hù)作用。細(xì)胞分化率的計(jì)算公式如下。

2.6? PC12細(xì)胞中LDH、MDA含量及AchE、SOD活力檢測

加藥培育24 h后，利用細(xì)胞刮徹底收集細(xì)胞，超聲破碎細(xì)胞后4 ℃下3 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞上清液并按照試劑盒方法測定細(xì)胞均漿中的LDH、MDA含量及AchE、SOD活力。

2.7? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“x±s”表示，用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異比較用單因素方差分析，方差齊者用LSD檢驗(yàn)分析（方差不齊者先將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后使之方差齊），P<0.05說明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 各組PC12細(xì)胞的細(xì)胞存活率和分化率比較

與空白組比較，模型組的PC12細(xì)胞的存活率明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，TSG組、TEN組及TSG-TEN組PC12細(xì)胞的存活率均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且細(xì)胞存活率的大小為：TSG-TEN組>TSG組>多奈哌齊組>TEN組（P<0.01）;與TSG-TEN組相比，TSG組、TEN組、多奈哌齊組均明顯低于TSG-TEN組（P<0.01，P<0.05）。見表1。

與空白組相比，模型組的細(xì)胞分化率明顯降低，差異顯著（P<0.01）;與模型組比較，各組PC12細(xì)胞的細(xì)胞分化率明顯增高，差異明顯（均P<0.05），TSG-TEN組及多奈哌齊組均增高明顯（P<0.01，P<0.05），且比TSG組和TEN單用組增高更顯著（P<0.01）。PC12細(xì)胞的細(xì)胞分化率高低為：TSG-TEN組>多奈哌齊組>TSG組>TEN組（P<0.01）。與TSG-TEN組相比，TSG組、TEN組、多奈哌齊組均明顯低于TSG-TEN配伍組（P<0.01）。見表1。

3.2? 檢測各組PC12細(xì)胞中LDH、MDA含量及AchE、SOD活力

與空白組比較，模型組LDH、MDA含量、AchE活力明顯升高，SOD活力明顯減低，（P<0.01，P<0.05）;與模型組相比，用藥組LDH、MDA含量，AchE活力顯著減低，SOD活力明顯增高（均P<0.05），且TSG-TEN組及多奈哌齊組對降低LDH和MDA含量、抑制AchE活力及增強(qiáng)SOD活力的效應(yīng)比TSG或TEN單用組更好（P<0.01）。見表2。與TSG-TEN組比較，多奈哌齊組、TSG組、TEN組的LDH含量、MDA含量、AchE活力均高于TSG-TEN組，且SOD活力均明顯低于TSG-TEN組（P<0.01，P<0.05）。見表2。

4 討論

AD是一種主要以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙、精神行為障礙、日常生活能力障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)變性性疾病。大量的研究顯示，膽堿能系統(tǒng)損傷和氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致AD產(chǎn)生的兩大重要機(jī)制。多項(xiàng)研究表明，乙酰膽堿（ACh）的缺失和乙酰膽堿酯酶（AchE）活性增高是AD膽堿能損傷的主要表現(xiàn)[6-7]。大量研究證實(shí)，丙二醛（MDA）含量增加、LDH漏出量增多、超氧化物歧化酶（SOD）活性減低是AD氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要表現(xiàn)[8-9]。突觸可塑性能維持神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)環(huán)路的穩(wěn)定性，與細(xì)胞改變緊密相關(guān)，在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮極為重要的作用，同時(shí)也是神經(jīng)系統(tǒng)疾病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制[10-11]。海馬神經(jīng)細(xì)胞的突觸丟失和突觸可塑性改變在AD的早期病理過程中發(fā)揮極為重要的作用，在AD學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能障礙的發(fā)病機(jī)制中具有重要的地位[12]。因此，膽堿能神經(jīng)損傷、氧化應(yīng)激反應(yīng)及突觸的可塑性損傷是導(dǎo)致AD發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制。

本研究主要是在補(bǔ)腎化痰益智法指導(dǎo)下，根據(jù)中藥方劑配伍理論，選擇臨床上常配伍使用的補(bǔ)腎藥何首烏和化痰藥遠(yuǎn)志進(jìn)行配伍，對補(bǔ)腎藥何首烏的有效成分TSG和化痰藥遠(yuǎn)志的有效成分TEN進(jìn)行配伍研究，用中藥有效組分配伍模式研究何首烏和遠(yuǎn)志有效組分配伍治療AD的組方規(guī)律，尋找其治療AD的有效配伍組合，并從Aβ25-35所致AD模型PC12細(xì)胞的神經(jīng)損傷及膽堿能系統(tǒng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、突觸可塑性損傷等方面探討TSG和TEN配伍組方抗AD的作用機(jī)制，從而形成一個(gè)組方簡單、成分清楚、作用明確、機(jī)制明了、質(zhì)量可控、安全有效的新型中藥有效組分配伍組方。

多奈哌齊是第2代膽堿酯酶抑制劑，是全世界唯一一種同時(shí)被美國FDA和英國MCA批準(zhǔn)上市對癥治療輕、中度AD的新藥。它分別在美國、日本和英國進(jìn)行了Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期臨床研究驗(yàn)證，目前已經(jīng)在40多個(gè)國家和地區(qū)上市銷售。該藥對神經(jīng)中樞AchE有顯著的選擇性，其治療作用是通過可逆性、選擇性地抑制AchE對Ach的水解而增加受體部位的乙酰膽堿含量，從而提高阿爾茨海默病患者的認(rèn)知和記憶能力，卻很少出現(xiàn)外周的不良反應(yīng)。多奈哌齊療效與他克林相似，卻有顯著的臨床安全性和很好的耐受性。所以本課究選用多奈哌齊作為陽性對照藥。

AchE是膽堿能系統(tǒng)神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志酶之一，可催化Ach降解，其活性越高，Ach含量越低，兩者呈負(fù)相關(guān)。因此，降低AChE的活性能減少Ach降解，提高Ach含量，從而提高學(xué)習(xí)記憶能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TSG和TEN配伍組能顯著降低Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的AChE的活性，并且比單用組效果更明顯，提示二者配伍能協(xié)同改善Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的膽堿能系統(tǒng)損傷。自由基的產(chǎn)生會(huì)誘發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，所產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA會(huì)導(dǎo)致AD的神經(jīng)元凋亡。所以，MDA含量的高低能間接反映AD自由基的變化。SOD是機(jī)體內(nèi)天然的氧自由基清除劑，是清除自由基酶系統(tǒng)中非常重要的酶類，故SOD活力的高低水平能間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。LDH是一種細(xì)胞內(nèi)的糖酵解酶，廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，LDH是細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志，當(dāng)細(xì)胞受損或細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變時(shí)，LDH會(huì)釋放至胞外，引起培養(yǎng)上清液中LDH活性增強(qiáng)，因此，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 的活性可以客觀衡量細(xì)胞受損程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TSG和TEN配伍組能顯著降低Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的MDA含量和LDH，明顯提高SOD活性，并且比單用組效果更明顯，提示二者配伍能協(xié)同抗Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。神經(jīng)細(xì)胞的突觸可塑性與學(xué)習(xí)記憶關(guān)系密切，其間接反映了整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)回路的可塑性，是AD患者學(xué)習(xí)記憶漸進(jìn)性損害并最終導(dǎo)致癡呆的直接原因。而細(xì)胞分化并長有突起是突觸可塑性的主要表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TSG和TEN配伍組能顯著提高Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的細(xì)胞分化率，并且比單用組效果更明顯，提示二者配伍能協(xié)同改善Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的突觸可塑性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TSG和TEN配伍組能顯著改善Aβ25-35誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷并具有明顯的協(xié)同作用，其作用機(jī)制可能與改善膽堿能系統(tǒng)損傷、抗氧化應(yīng)激、改善突觸可塑性損傷有關(guān)，且TSG的作用優(yōu)于TEN。

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