葛根及其配伍對重癥肌無力大鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)的影響

李蒙 文穎娟 楊俊超 王江 柏魯寧

〔摘要〕 目的 探討葛根及其配伍對重癥肌無力大鼠骨骼肌線粒體結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制。方法 （1）造模：給模型大鼠以腹部、足墊、背部皮下注射200 μL（含R 97-116∶100 μg）免疫乳劑進(jìn)行造模，30 d和45 d后，分別以同樣方法對造模大鼠強(qiáng)化接種，以大鼠Lennon肌力評分≥1級為模型鼠。（2）分組與處理：除空白組外，造模成功鼠隨機(jī)分為模型組、強(qiáng)的松組、葛根組、葛芪組、葛參組、葛妙組、葛芪參妙組，每組20只。造模成功2周后，給予空白組、模型組蒸餾水灌胃，其他組予相應(yīng)藥物灌胃，連續(xù)4周。（3）標(biāo)本檢測：透射電鏡觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu);免疫組化法檢測FGF、NGF、IGFs表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，各組的線粒體形態(tài)均有恢復(fù)，其中葛芪組和葛芪參妙組治療后整體形態(tài)恢復(fù)較好;與模型組比較，各治療組FGF、NGF、IGFs的陽性表達(dá)率都有所升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 葛根及其配伍可能通過改善肌肉生成調(diào)控因子的陽性表達(dá)促進(jìn)線粒體結(jié)構(gòu)的恢復(fù)，達(dá)到治療重癥肌無力的目的。

〔關(guān)鍵詞〕 重癥肌無力;葛根配伍;骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu);肌肉生成調(diào)控因子

〔Abstract〕 Objective To explore the action mechanism of Radix Puerariae and its compatibility on the mitochondrial structure of skeletal muscle in myasthenia gravis rats. Methods （1）modeling： The model rats were established by injecting 200 μL （including r 97-116∶100 μg） immune emulsion into abdomen， foot pad and back subcutaneously. After 30 days and 45 days， the rats were inoculated with the same method， and Lennon score ≥ 1 was used as the model rats. （2）Grouping and treatment： In addition to the blank group， the successfully modeling rats were randomly divided into a model group， a prednisone group， a Radix Puerariae group， a Geqi group， a Geshen group， a Gemiao group and a Geqishenmiao group， with 20 rats in each group. After 2 weeks of successful modeling， the blank group and model group were given distilled water by gavage， and the other groups were given drugs by gavage for 4 weeks. （3）Sample detection： The mitochondrial ultrastructure of skeletal muscle was observed by transmission electron microscope. The expression of FGF， NGF and IGFs was detected by immunohistochemistry. Results Compared with the model group， the mitochondrial morphology of each group recovered， and the whole morphology of the Geqi group and the Geqishenmiao group recovered better after treatment; Compared with the model group， the positive expression rates of FGF， NGF and IGFs in each treatment group increased， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion Radix Puerariae and its compatibility may promote the recovery of mitochondrial structure by improving the positive expression of myogenic regulatory factors， so as to achieve the purpose of treating myasthenia gravis.

〔Keywords〕 myasthenia gravis; compatibility of Radix Puerariae; ultrastructure of skeletal muscle mitochondria; regulation factors of muscle formation

重癥肌無力（myasthenia gravis，MG）是一種難治性自身免疫性疾病，以眼肌或全身肌無力為主要表現(xiàn)[1]，到目前為止，其病理機(jī)制尚不十分清楚，病因以乙酰膽堿受體（acetylcholine receptor， AchR）受損為主，即神經(jīng)肌肉接頭處突觸后膜中因AchR分子數(shù)量減少無法產(chǎn)生足夠的終板電位而導(dǎo)致肌肉傳遞功能障礙[2]，最終產(chǎn)生肌無力的癥狀。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為MG病機(jī)要點(diǎn)為脾氣虛弱無以運(yùn)化水谷精微，使筋脈失養(yǎng)以致“脾無以主肌肉”而發(fā)病，且脾氣虛弱日久見濕熱、瘀血、痰濁等濁邪堆積。本項(xiàng)目前期研究[3]從“脾氣虛弱兼濁邪堆積”的角度為切入點(diǎn)，認(rèn)為本病多以虛實(shí)夾雜證為主，已證實(shí)葛根及其配伍不僅能改善肌無力癥狀[4-7]，且能作用于胃腸平滑肌線粒體[8]，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究通過配制分別含有100 μg肽段的完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和磷酸鹽緩沖液（PBS）的混合乳液誘導(dǎo)自身免疫性重癥肌無力大鼠模型，觀察葛根及其配伍對線粒體超微結(jié)構(gòu)與肌肉生成調(diào)控因子[9]包括成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factors， IGFs）的影響，旨在從促進(jìn)肌肉生長調(diào)控因子的角度探討復(fù)方配伍對抗肌無力的內(nèi)在機(jī)制及主要起效配伍，進(jìn)一步研究葛根及其配伍對MG的作用機(jī)制。

1 材料

1.1? 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

6～8周齡SPF級Lewis雌性大鼠160只，體質(zhì)量（180±20） g，許可證號：SCXK（陜）2013-001，購于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。于陜西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2? 實(shí)驗(yàn)藥物

（1）葛根組：葛根20 g;（2）葛芪方組：葛根20 g，黃芪15 g;（3）葛參方組：葛根20 g，黃芪15 g，丹參15 g;（4）葛根和四妙散方組（簡稱葛妙組）：葛根20 g，蒼術(shù)15 g，黃柏15 g，牛膝15 g，薏苡仁15 g;（5）葛芪參妙方組（簡稱葛芪參妙組）：葛根20 g，黃芪15 g，丹參15 g，蒼術(shù)15 g，黃柏15 g，牛膝15 g，薏苡仁15 g。中藥飲片來源于陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院，陽性對照組藥物：強(qiáng)的松（天律藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司）。實(shí)驗(yàn)藥物均置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3? 試劑與儀器

鼠源性AchR-α亞基97-116肽段序列由南京金斯瑞生物科技公司提供;2.5%磷酸鹽緩沖液、完全福氏佐劑CFA、不完全福氏佐劑IFA（Sigma公司）;兔抗FGF一抗（貨號：ab15080）、兔抗NGF一抗（貨號：ab125219）、兔抗IGFs一抗（貨號：ab13065）、正常山羊血清（貨號：ZLI-9021）均為北京中山金橋生物有限公司提供;FGF、NGF、IGFs免疫組化檢測試劑盒均由上海茁彩生物科技公司提供。H-500IV透射電鏡（日本日立公司），F(xiàn)inesseE切片機(jī)（上海華駿醫(yī)療器材有限公司），ELX550型酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1? 分組方法

將實(shí)驗(yàn)大鼠分為空白組、模型組、強(qiáng)的松組、葛根組、葛芪組、葛參組、葛妙組、葛芪參妙組，每組20只。

2.2? 造模方法

將R97～116、CFA、PBS三者按1∶1.5∶1.5的比例充分混勻制成免疫乳劑;取140只大鼠予以腹部、足墊、背部皮下注射200 μL（含R97～116∶100 μg）乳劑進(jìn)行造模，取20只大鼠為空白組皮下注射相同劑量PBS，完成首次免疫;首次免疫后30 d和45 d，將R97～116、IFA、PBS三者按1∶3∶3的比例充分混勻制成免疫乳劑，取乳劑200 μL（含R97～116：50 μg）對造模大鼠強(qiáng)化接種，空白組同樣注射相同劑量PBS。通過測量體質(zhì)量和Lennon肌力評定[10]來評估造模是否成功，并對大鼠進(jìn)行Lennon肌力評定，以進(jìn)一步確定MG大鼠模型制備成功。

2.3? 成模評估方法

（1）實(shí)驗(yàn)期間每周測1次大鼠體質(zhì)量并記錄，以造模后大鼠體質(zhì)量增加緩慢為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn);（2）Lennon肌力評定標(biāo)準(zhǔn)分級方法按癥狀嚴(yán)重程度分為四級：0級，無明顯的無力表現(xiàn);1級，四肢力量差，光滑地面上前肢打滑，活動(dòng)減少且易疲勞;2級，明顯無力，休息時(shí)身體呈隆起姿勢，頭尾下垂，大腿外展，前肢趾彎曲，動(dòng)作笨拙，行走不穩(wěn);3級，嚴(yán)重?zé)o力表現(xiàn)，無撕咬動(dòng)作，肌肉震顫，呼吸困難，瀕死或死亡。以活動(dòng)減少，動(dòng)作緩慢，抓持時(shí)掙扎力量減弱，叫聲短促低沉，毛發(fā)暗淡，體質(zhì)量開始增長緩慢或者下降趨勢，以及Lennon肌力評分≥1級為成模標(biāo)準(zhǔn)。

2.4? 干預(yù)方法

空白組、模型組給予蒸餾水灌胃，葛根及其配伍組予中藥濃縮液分別給藥。按大鼠每日用藥劑量相當(dāng)于成人（以60 kg為標(biāo)準(zhǔn)）的6.25倍給藥[11]，大鼠用藥量=（成人每日用藥量/60 kg）×6.25。葛根組2.08 g/（kg·d），葛芪組3.65 g/（kg·d），葛參組3.65 g/（kg·d），葛妙組8.33 g/（kg·d），葛芪參妙組11.46 g/（kg·d），強(qiáng)的松組予強(qiáng)的松混懸液5.4 mg/（kg·d）給藥。每日灌胃1次，連續(xù)灌4周。

2.5? 檢測指標(biāo)

2.5.1? 線粒體超微結(jié)構(gòu)? 處死并分離大鼠坐骨神經(jīng)，沿其坐骨神經(jīng)走向找到進(jìn)入脛骨前肌的分支，取神經(jīng)進(jìn)入肌肉部位（連同神經(jīng)）切割修成2 mm×2 mm×2 mm大小，浸于2.5% PBS固定2 h （4 ℃）后，再浸于1%四氧化鋨液固定1 h，進(jìn)行脫水、滲透、包埋，切片、染色等處理后，于透射電鏡下放大20 000倍和40 000倍觀察骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)。

2.5.2? FGF、NGF、IGFs檢測? 采用免疫組化檢測FGF、NGF、IGFs表達(dá)：用磷酸鹽緩沖液PBS溶液沖洗脫蠟、入水處理后的石蠟切片，用枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，滴加山羊血清封閉液，室溫下30 min。滴加FGF、NGF、IGFs一抗，4 ℃過夜。PBS沖洗3次，加入二抗，孵育20 min。PBS溶液沖洗3次，DAB染色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡觀察，ImagePro圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)算積分光密度（IOD）值。

2.6? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，按照“x±s”來表示，對于符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)和方差分析法，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)。其中P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 大鼠體質(zhì)量變化情況

免疫后，造模大鼠在4周后體質(zhì)量增加減慢，尤其在第4周加強(qiáng)免疫后，與空白組比較，造模各組的大鼠體質(zhì)量的增加量明顯減緩;治療后，中藥各組和強(qiáng)的松組比較，葛芪參妙組的大鼠的體質(zhì)量增長值逐漸超過強(qiáng)的松組（P<0.05），其他中藥組雖然體質(zhì)量增長趨勢也在增加，但和強(qiáng)的松組區(qū)別不明顯。見表1。

3.2? Lennon肌力評定結(jié)果

按照Lennon肌力評價(jià)方法給予評分，造模各組老鼠與空白組比較，肌無力癥狀明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;治療一月后，與模形組比較，中藥各組和陽性對照強(qiáng)的松組的肌無力癥狀明顯改善，差有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與強(qiáng)的松組比較，葛芪參妙組的肌力恢復(fù)更加明顯（P<0.05），其他中藥各組肌力恢復(fù)不及強(qiáng)的松組，差異不明顯。見表2。

3.3? 電鏡下骨骼肌線粒體超顯微結(jié)構(gòu)

電鏡下空白組的超微結(jié)構(gòu)正常;模型組中，骨骼肌肌肉間隙相對增寬，細(xì)胞核與核膜保存尚可，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中Z線出現(xiàn)扭曲或消失，大鼠肌原纖維內(nèi)線粒體數(shù)量明顯增多，其大小不一，部分體積增大，有巨大線粒體，線粒體形態(tài)明顯改變?yōu)槎嘈涡?。治療后?qiáng)的松組和各個(gè)中藥組的都有恢復(fù)，巨大線粒體減少，異性線粒體變少，線粒體嵴致密度相對較為均勻，結(jié)構(gòu)較為清晰，排列規(guī)律性恢復(fù)較好，葛芪組和葛芪參妙組經(jīng)過治療后整體形態(tài)恢復(fù)較好。見圖1。

3.4? 肌肉生成調(diào)控因子檢測

3.4.1? FGF? FGF在組織中陽性表達(dá)率以細(xì)胞間質(zhì)中棕黃色顆粒的顏色和區(qū)域大小表示，表達(dá)越多，反應(yīng)的顏色越深，區(qū)域越大。圖中可見空白組中FGF陽性表達(dá)區(qū)域較為廣泛，模型組中因子的顏色表達(dá)區(qū)域減少，并且肌細(xì)胞出現(xiàn)萎縮和衰亡，細(xì)胞間隙較為分散;藥物治療后該因子區(qū)域顏色出現(xiàn)加深，表達(dá)率升高，療效顯著。見圖2。

模型組和空白組比較，陽性表達(dá)IOD值降低（P<0.01）;治療組和模型組比較，陽性表達(dá)率均升高（P<0.01）;各中藥組和強(qiáng)的松組比較，陽性表達(dá)都比較高（P<0.05）;葛根及其配伍組組間比較：葛芪參妙組>葛妙組、葛參組、葛芪組>葛根組，（P<0.05）。見表3。

3.4.2? NGF? 空白組可見NGF廣泛表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞周圍;模型組肌肉及神經(jīng)纖維束可見比較松散，且陽性表達(dá)顯示點(diǎn)顏色及區(qū)域均比較少;治療后強(qiáng)的松組及葛妙組和葛芪參妙組陽性表達(dá)顯示點(diǎn)顏色及區(qū)域又出現(xiàn)恢復(fù)性高表達(dá)。見圖3。

模型組與空白組比較，NGF陽性表達(dá)IOD值大大降低，（P<0.01）;各治療組與模型組比較，NGF陽性表達(dá)IOD值均升高（P<0.01）;治療組中陽性表達(dá)IOD值比較：強(qiáng)的松組、葛妙組、葛芪參妙組>葛參組>葛芪組、葛根組（P<0.05）。見表4。

3.4.3? IGFs? 模型組大鼠在人工造模后，肌細(xì)胞出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的形狀改變，IGFs的陽性表達(dá)明顯少于正常大鼠的表達(dá)，用藥治療后大鼠的肌細(xì)胞均出現(xiàn)了一定程度的修復(fù)，IGFs的表達(dá)也明顯升高，顯示區(qū)域的顏色和面積都增加，可見在肌細(xì)胞受損區(qū)域IGFs表達(dá)較多，成肌細(xì)胞和肌纖維細(xì)胞都出現(xiàn)了一定程度的增殖修復(fù)。見圖4。

與空白組比較，模型組大鼠IGFs陽性表達(dá)IOD值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;與模型組比較，各治療組大鼠IGFs陽性表達(dá)率IOD值升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;各治療組組間相比較，強(qiáng)的松組和葛妙組、葛芪參妙組IOD陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且強(qiáng)的松組高于葛參組、葛芪組、葛根組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表5。

4 討論

根據(jù)MG以肌肉痿廢不用、運(yùn)動(dòng)無力且進(jìn)行性加重[12]為主的臨床特點(diǎn)，將其歸屬于中醫(yī)學(xué)“痿證”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，脾氣虛弱兼濁邪堆積是MG主要發(fā)病機(jī)制[3]，其辨證總屬虛實(shí)夾雜?！端貑枴ゐ粽摗分小爸勿粽擢?dú)取陽明”的基本原則與《素問·熱論》中“陽明主肉，其脈挾鼻絡(luò)于目”的論述為治療MG提供了思路源泉，李東垣亦提出脾胃受損是痿證的根源，而中醫(yī)學(xué)“脾主肌肉”理論又為從脾胃論治MG提供了有力的理論依據(jù)。虛實(shí)夾雜證在MG發(fā)病過程中長期存在，脾氣虛弱既化源不足又無以運(yùn)化水濕，故筋脈失養(yǎng)或痰熱濕瘀等濁邪客于經(jīng)絡(luò)而發(fā)病;脾胃升清降濁功能失常，濁邪堆積與脾氣虛弱又可互為因果，故葛根及其配伍從脾胃論治MG，以單味藥葛根解肌升津，葛根、黃芪配伍升提中氣，葛根、黃芪、丹參相伍既活血又可祛瘀生新，葛根加四妙散活血通經(jīng)、清利濕熱，葛根配伍黃芪、丹參、四妙散共奏升清降濁之效。臨床中，錢春紅等[13-14]用黃芪葛根湯益氣升陽兼以補(bǔ)血養(yǎng)血，并配合溫針灸通過增強(qiáng)機(jī)體免疫功能治療MG，療效顯著。李聲岳[15]用以葛根為君藥的葛根舉陷湯健脾益腎、升陽舉陷治療眼肌型MG取得滿意療效。有學(xué)者提出“脾-肌肉-線粒體”相關(guān)學(xué)說[16]，認(rèn)為中醫(yī)學(xué)的“脾”與肌肉線粒體密切相關(guān)[17]，而MG的病變部位主要在肌肉，其中線粒體功能正常與否是肌肉運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵[18]，本項(xiàng)目前期實(shí)驗(yàn)研究亦表明葛根不僅可作用于胃腸平滑肌線粒體，葛根及其配伍亦能作用于線粒體而改善肌無力癥狀[4-7]。故本項(xiàng)目從脾胃出發(fā)，選用以葛根及其配伍組合，通過其改善線粒體結(jié)構(gòu)與功能來治療MG合情合理。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可見，經(jīng)過治療后觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)，強(qiáng)的松組和各個(gè)中藥組的線粒體都有恢復(fù)，其中巨大線粒體減少，異性線粒體變少，線粒體嵴致密度相對較為均勻，結(jié)構(gòu)較為清晰，排列規(guī)律性恢復(fù)較好，葛芪組和葛芪參妙組經(jīng)過治療后整體形態(tài)恢復(fù)較好。該結(jié)果從實(shí)驗(yàn)角度證實(shí)了選用葛根及其配伍治療MG的可行性。

FGF廣泛存在于機(jī)體組織細(xì)胞中，是一類能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長因子;NGF在肌細(xì)胞的生長、發(fā)育、再生過程中起主導(dǎo)地位，能夠促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞的增殖;IGFs能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長分化[19-20]。三者均能促進(jìn)肌細(xì)胞的增殖，是促進(jìn)肌肉生成的重要調(diào)控因子，故肌肉生成調(diào)控因子是肌肉生長的關(guān)鍵，也是影響MG肌肉生長的關(guān)鍵因子。根據(jù)MG虛實(shí)夾雜的特點(diǎn)，眾醫(yī)家治療本病多主張扶正祛邪，但缺乏藥物配伍療效對比的實(shí)驗(yàn)研究。故本實(shí)驗(yàn)從MG的病機(jī)入手，設(shè)立葛根及其配伍組與強(qiáng)的松組、模型組進(jìn)行對照，在觀察其對肌肉生成調(diào)控因子的影響中發(fā)現(xiàn)，各治療組中，F(xiàn)GF的陽性表達(dá)率：葛芪參妙組>葛妙組、葛參組、葛芪組>葛根組（P<0.05）。NGF治療組中陽性表達(dá)IOD值比較：葛妙組、葛芪參妙組>葛參組>葛芪組、葛根組（P<0.01）。IGFs治療組組間比較：葛妙組、葛芪參妙組>葛參組、葛芪組、葛根組（P<0.01）。該結(jié)果表明，葛根及其配伍均可促進(jìn)肌肉生成調(diào)控因子（FGF、NGF、IGFs）的表達(dá)，其中，葛芪參妙組與葛妙組對肌肉生成調(diào)控因子的促進(jìn)作用更顯著，其次為葛參組與葛芪組，單味藥葛根的促進(jìn)作用最弱。究其原因，葛芪參妙組和葛妙組配伍用藥精良，在單味藥葛根的基礎(chǔ)上分別配伍四妙散、黃芪、丹參，舒肌利濕、益氣活血，治療上扶正祛邪，有效促進(jìn)肌肉生長調(diào)控因子的增殖;而葛參組、葛芪組雖有配伍，由于僅有兩味藥，其藥效不及葛芪參妙組與葛妙組，因此對肌肉生長調(diào)控因子的促進(jìn)作用較弱;單味藥葛根療效不及配伍組，這也凸顯了中醫(yī)配伍用藥的重要性。在進(jìn)一步的研究中，基于辨證論治的前提下可以考慮多增加幾組配伍用藥的數(shù)量，以期通過其對肌肉生成調(diào)控因子的促進(jìn)作用，改善肌無力癥狀，使MG患者受益。

本項(xiàng)目基于“脾主肌肉”理論[21]，通過研究葛根及其配伍組合對MG大鼠骨骼肌線粒體超微結(jié)構(gòu)以及FGF、NGF、IGFs等肌肉生成調(diào)控因子的作用，以期明確葛根與哪一組藥物配伍能有效促進(jìn)肌肉生成調(diào)控因子的表達(dá)，來改善MG大鼠線粒體的結(jié)構(gòu)并影響其功能。采用對照治療的方法，明確了葛根及其配伍組較強(qiáng)的松組有更好的治療效果，同時(shí)發(fā)現(xiàn)單味葛根療效不及配伍組，證實(shí)中醫(yī)配伍用藥的重要性，為臨床用藥提供了思考與啟迪。

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