肝臟類器官構(gòu)建及其對(duì)小鼠部分肝切除術(shù)后肝再生的作用

薛瑞豐，湯寧，，潘晨燕，董春龍，蔡佳暉，袁獻(xiàn)溫，王經(jīng)琳，，，任昊楨，，，施曉雷，，

（1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 普外科，江蘇 南京 210005；2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院 普外科，江蘇 南京 210008；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院 普外科，江蘇 南京 210029）

肝臟是參與能量合成，儲(chǔ)存代謝的中心器官，具有強(qiáng)大的再生能力，增強(qiáng)肝臟的再生能力對(duì)肝臟疾病患者具有重要意義[1]。肝祖細(xì)胞是位于肝臟Hering區(qū)域的、具有向肝膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞分化能力的一類干細(xì)胞[2-3]。在輕度損傷的肝臟中，肝再生通常是以肝細(xì)胞的增殖和肥大來實(shí)現(xiàn)[4-5]。而當(dāng)肝細(xì)胞增殖受到抑制或者肝臟損傷嚴(yán)重的情況下，肝祖細(xì)胞會(huì)分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞，促進(jìn)肝再生[6-7]。肝祖細(xì)胞從受損區(qū)域的門靜脈向外擴(kuò)展，形成導(dǎo)管樣的簇狀結(jié)構(gòu)，稱為導(dǎo)管反應(yīng)[8]。研究證明，在慢性肝臟疾病中，肝祖細(xì)胞能介導(dǎo)肝再生。而肝臟類器官具有分化成功能性肝細(xì)胞、保護(hù)肝細(xì)胞和促進(jìn)肝再生的作用[9]。那么在急性肝臟損傷如肝部分切除術(shù)后，外源性植入肝臟類器官是否發(fā)揮類似肝祖細(xì)胞的促進(jìn)肝臟再生作用？目前尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。本研究基于這個(gè)問題進(jìn)行初步的探討。

1 材料和方法

1.1 類器官的構(gòu)建

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠肝臟在預(yù)冷DMEM/F-12培養(yǎng)基（Glibco）中剪碎至1 mm大小，轉(zhuǎn)移離心管中靜置去上清，加入消化液（Dispase、Collagenase type IV、Advance DMEM F12按1：1：6配比）10 mL，37 ℃水浴消化20 min，機(jī)械吹打靜置去上清。繼續(xù)重復(fù)消化，收集后面5次的組織上清液。分別用100、30 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過濾，收集30 μm篩網(wǎng)截留的肝細(xì)胞。300 g，5 min離心收集細(xì)胞沉淀，基質(zhì)膠重懸細(xì)胞種板，加入750 μL肝臟類器官誘導(dǎo)培養(yǎng)基hepaticult OGM mouse Supplement，于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）

從類器官中提取總RNA，將純化的RNA反向轉(zhuǎn)錄成cDNA，應(yīng)用生物系統(tǒng)7500快速實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行定量。資料采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。使用的引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 免疫熒光檢測(cè)CK8、Desmin、AFP、PCNA表達(dá)情況

制作類器官冰凍切片進(jìn)行鑒定。將切片先吹干，室溫下多聚甲醛固定20 min，1×PBS洗3次，封閉液室溫封閉1 h，一抗4 ℃過夜，清洗3次，避光孵育二抗，清洗3次，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，清洗3次，封片。熒光顯微鏡下觀察。一抗分別是兔抗鼠CK8、Desmin、單克隆鼠源性AFP、兔抗鼠PCNA，二抗分別是山羊抗小鼠IgG H&L和山羊抗兔IgG H&L。

1.4 小鼠70%肝切模型的建立及肝臟類器官移植

雄性C57BL/6小鼠6～8周齡，隨機(jī)分為2組，每組18只，以肝切除術(shù)后第1、4、7天為觀察時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)6只[10]。對(duì)照組：行肝左、中葉切除術(shù)（占全肝70%）+肝包膜注射200 μL PBS；治療組：行肝左、中葉切除術(shù)（占全肝70%）+肝包膜移植200 μL類器官懸液（1×106）。肝包膜下移植類器官方法如下：用鈍性鑷子提起肝包膜，用注射器將約400 μL的0.9%氯化鈉注入肝包膜下，使其肝包膜和肝實(shí)質(zhì)表明分離，再將其抽回，將200 μL肝臟類器官懸液注入肝包膜下。觀察有無(wú)出血、漏液，縫合皮膚[11]。于術(shù)后第1、4、7天處死小鼠，取肝臟，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于進(jìn)一步組織學(xué)分析。

1.5 HE染色和免疫組化分析檢測(cè)Ki67

取石蠟包埋的肝組織切片5 μm用蘇木精和伊紅（HE）染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查，用Ki67（abcam）進(jìn)行免疫組化評(píng)估肝臟再生增殖情況。

1.6 Western blotting檢測(cè)PCNA蛋白水平

剪取適宜肝臟組織，置于磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑和RIPA一定比例混合的蛋白裂解液，于冰上研磨后離心取蛋白上清。BCA法測(cè)蛋白濃度后，取20～30 μg蛋白加樣，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，于5%脫脂奶粉中搖床封閉1～2 h，將PVDF膜置于一抗PCNA、4 ℃孵育過夜，用Tris緩沖洗膜3次，10 min/次，再用二抗室溫孵育2 h，Tris緩沖鹽水加吐溫洗膜3次，10 min/次。凝膠成像系統(tǒng)顯色曝光，用Imaje J對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.7 肝功能評(píng)估

小鼠70%肝切模型建立后，于術(shù)后第1、4、7天摘除眼球取血，同時(shí)收取正常未手術(shù)小鼠血樣標(biāo)本作為正常組。用南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院自動(dòng)化生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、白蛋白（albumin，ALB）水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 類器官構(gòu)建

肝臟類器官具有高度克隆性，在特定的培養(yǎng)條件下，可以從少量起始細(xì)胞快速擴(kuò)增，且擴(kuò)增后的肝臟類器保留了分為成熟肝細(xì)胞的能力[12]。因此我們首先從細(xì)胞形態(tài)方面觀察，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞經(jīng)3天誘導(dǎo)懸浮培養(yǎng)后從直徑20 μm左右囊性結(jié)構(gòu)聚集組裝形成125 μm的類器官（P＜0.05），直徑擴(kuò)增近6倍。當(dāng)類器官直徑超過200 μm時(shí)，類器官逐漸出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象。因此在皺縮發(fā)生前，類器官能保持較好的傳代活力。由此可見，我們構(gòu)建的肝臟類器官具有較強(qiáng)的自我增殖和組裝能力。見圖1。

圖1 肝臟類器官形態(tài)及其細(xì)胞直徑量化

2.2 肝臟類器官表型鑒定

類器官培養(yǎng)技術(shù)開始于腸道組織的研究，之后迅速在其他器官中應(yīng)用普及，Huch等[13]從人源性肝臟中分離出EPCAM（+）上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞，體外三維培養(yǎng)，EPCAM（+）的上皮細(xì)胞大量擴(kuò)增為肝臟類器官，在擴(kuò)增過程中保持高度的遺傳穩(wěn)定性，且具有雙分化潛能，可分化為肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。因此我們將傳代前后的類器官與肝組織進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)類器官中肝臟干細(xì)胞的標(biāo)志基因EPCAM、SOX9和CK19較肝組織呈明顯上調(diào)（P＜0.05），且傳代前后EPCAM、SOX9、CK19、TBX3、AFP、SOX17、FOXA2、HNF4A、CEBPA和CEBPB未見明顯改變。免疫熒光發(fā)現(xiàn)CK8和Desmin、AFP、PCNA呈陽(yáng)性表達(dá)，說明肝臟類器官具有肝臟上皮細(xì)胞部分屬性和增殖能力。由上述結(jié)論可以證明：我們成功將肝細(xì)胞誘導(dǎo)成具有肝臟干細(xì)胞屬性和增殖能力的肝臟類器官。見圖2。

2.3 肝臟類器官移植能保護(hù)70%肝切除術(shù)后的肝細(xì)胞，促進(jìn)肝再生

圖2 肝臟類器官表型鑒定

HE顯示對(duì)照組和治療組小鼠在術(shù)后第1天肝索結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞排列紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，存在大量的脂肪空泡，且治療組肝臟脂肪空泡更嚴(yán)重。再生的第4天，對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞核仁染色加深，仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分區(qū)域存在肝細(xì)胞壞死區(qū)。治療組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)大小基本恢復(fù)正常，形態(tài)較清晰，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)脂肪或氣球樣變。在術(shù)后第7天，兩組小鼠肝再生結(jié)束，小鼠肝細(xì)胞呈條索狀規(guī)則，肝血竇間隙清晰，肝細(xì)胞形態(tài)大小正常，無(wú)脂肪或氣球樣變，Ki67結(jié)果顯示，70%肝切除術(shù)后第1天，對(duì)照組小鼠增殖明顯強(qiáng)于治療組，第4天兩組均顯示增殖狀態(tài)，為了確認(rèn)在70%肝切除術(shù)后第4天增殖狀態(tài)的差異，我們通過Western blotting檢測(cè)PCNA水平再一次確認(rèn)，量化結(jié)果顯示在術(shù)后第4天治療組增殖顯著上調(diào)，接近對(duì)照組3倍（P＜0.05）。這說明肝臟類器官有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖作用。見圖3。

圖3 肝臟損傷及增殖情況

2.4 肝臟類器官移植改善70%肝切除術(shù)后肝功能

既往研究表明，70%肝切除術(shù)后小鼠肝臟損傷嚴(yán)重，肝酶會(huì)顯著升高。因此我們對(duì)兩組小鼠70%肝切除術(shù)后肝功能進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)術(shù)后第1天兩組ALT、AST、TBIL和DBIL均顯著升高，且治療組ALT高于對(duì)照組。但在術(shù)后第4天，治療組ALT、AST、總膽紅素（direct bilirubin direct，TBIL）和直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）明顯下降，同時(shí)肝臟ALB明顯升高（P＜0.05）。因此判斷肝臟類器官對(duì)70%肝切除術(shù)后小鼠肝功能有改善作用。見圖4。

圖4 肝功能相關(guān)指標(biāo)隨時(shí)間恢復(fù)情況

3 討論

肝臟部分肝切除術(shù)之后，剩余功能正常的肝細(xì)胞會(huì)響應(yīng)再生誘導(dǎo)信號(hào)如腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor-alpha，TNF-α）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）等，在經(jīng)過一周時(shí)間增殖再生恢復(fù)到器官的初始重量[14-15]。既往研究表明，在毒素介導(dǎo)的肝臟損傷或慢性肝病中，肝再生主要是肝祖細(xì)胞激活通過導(dǎo)管反應(yīng)，增殖分化重新填充肝臟[16-19]。那么在急性肝損如肝部分切除術(shù)后，肝臟類器官是否能發(fā)揮類似肝祖細(xì)胞的促進(jìn)肝再生作用，尚無(wú)相關(guān)的報(bào)道。單純的肝干細(xì)胞移植面臨植入效率低，植入后細(xì)胞存活時(shí)間短、植入后無(wú)法保證固定在理想位置等問題[20-21]。有研究表明，3D立體結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的增殖、分化[22]，這也是我們選擇肝臟類器官作為切入點(diǎn)的另一個(gè)原因。

首先我們對(duì)體外構(gòu)建的肝臟類器官進(jìn)行初步的鑒定。鏡下對(duì)肝臟類器官形態(tài)進(jìn)行初步的觀察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過3天的誘導(dǎo)培養(yǎng)，肝臟類器官?gòu)哪倚越Y(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成球狀團(tuán)塊，直徑擴(kuò)增了近5倍，說明其具有快速增殖擴(kuò)增的能力，與既往研究基本吻合[23]。進(jìn)一步將傳代前后的類器官與肝組織進(jìn)行基因表型鑒定，發(fā)現(xiàn)類器官顯示代表肝臟干細(xì)胞屬性的基因明顯上調(diào)，且在傳代前后均基因未見明顯差異[24-25]。免疫熒光顯示，肝臟上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK8、Desmin、AFP、PCNA為陽(yáng)性，以上結(jié)論說明我們體外構(gòu)建的肝臟類器官具有肝臟干細(xì)胞、上皮細(xì)胞屬性、具有增殖能力、基因能穩(wěn)定遺傳。

其次進(jìn)行70%肝切除再生小鼠模型構(gòu)建。肝臟再生整個(gè)周期大約是7 d。此前主要觀察時(shí)間點(diǎn)集中在第1、2、7天。在沒有外界干預(yù)的條件下，肝細(xì)胞增殖將在術(shù)后第2天將達(dá)到一個(gè)峰值[26]。經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的摸索，我們發(fā)現(xiàn)，治療組增殖在第4天達(dá)到峰值，因此本實(shí)驗(yàn)觀察的時(shí)間點(diǎn)選在70%肝切除術(shù)后第1、4、7天。HE顯示，在術(shù)后第1天時(shí)，兩組均呈現(xiàn)一個(gè)典型的肝細(xì)胞損傷表現(xiàn)，出現(xiàn)大量的脂肪空泡，細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)消失。同時(shí)出現(xiàn)治療組較對(duì)照組損傷嚴(yán)重的現(xiàn)象，初步判斷可能是外源性移植導(dǎo)致的短暫的免疫排斥，加重?fù)p傷現(xiàn)象。而在第4天的時(shí)候，治療組小鼠肝細(xì)胞基本結(jié)構(gòu)率先恢復(fù)正常，形態(tài)較清晰，無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)脂肪或氣球樣變。免疫組化和Western blotting顯示，治療組在術(shù)后第1天增殖減弱，術(shù)后第4天增殖達(dá)到峰值，是對(duì)照組的近3倍，整體趨勢(shì)與HE顯示的損傷恢復(fù)相同。

最后通過血清肝功能指標(biāo)來進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組在術(shù)后第4天ALT、AST、TBIL和DBIL明顯下降，ALB合成明顯增加，說明治療組肝臟整體的損傷恢復(fù)情況較對(duì)照組好。綜上所述，具有肝臟干細(xì)胞屬性和增殖能力的肝臟類器官，能通過保護(hù)肝細(xì)胞、改善部分肝切除術(shù)后小鼠肝功能，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)肝再生作用，但是否通過類似肝祖細(xì)胞的導(dǎo)管反應(yīng)還需要進(jìn)一步論證。