人血清白蛋白的生物制備工藝優(yōu)化

蔡燕飛， 陳 蘊(yùn)， 金 堅(jiān)

(江南大學(xué) 藥學(xué)院， 無錫 214122)

人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)是人血漿中的蛋白質(zhì)，其在血漿中的濃度為42 g/L，約占血漿總蛋白的60%。在體液中HSA可運(yùn)輸脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子和許多治療分子等，同時(shí)維持血液正常的滲透壓。在臨床上人血清白蛋白可用于治療休克與燒傷，用于補(bǔ)充因手術(shù)、意外事故或大出血所致的血液丟失，也可以作為血漿增容劑[1]。HSA具有半衰期長(zhǎng)、生物相容性好、低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，是理想的藥物載體，各種基于HSA的長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物也到了廣泛的研究和應(yīng)用[2]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)于蛋白質(zhì)藥物分子與HSA的融合蛋白的研究已較為成熟，目前該類蛋白的主要表達(dá)系統(tǒng)仍然是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，其產(chǎn)物易降解的缺陷也已十分明了，其原因主要?dú)w納為：1)甲醇對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生影響；2)過表達(dá)外源蛋白導(dǎo)致分泌途徑的過載；3)分泌途徑中的信號(hào)肽加工酶等其他宿主蛋白酶對(duì)HSA融合蛋白的“錯(cuò)誤加工”[3-7]。因此，解析HSA及其融合蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中的優(yōu)劣意義重大。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(Chinese hamster ovary， CHO)具有完善的翻譯后修飾功能，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有低免疫原性的優(yōu)勢(shì)，已成為真核表達(dá)系統(tǒng)中最常用的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前通過CHO系統(tǒng)表達(dá)的與治療有關(guān)的重組蛋白藥物占生物藥總量的比例已達(dá)到60%～70%，包括胰島素、EPO、人體生長(zhǎng)激素、抗體等等[8-11]。近年來，本研究室開展了蛋白質(zhì)藥物分子與HSA的融合蛋白在CHO系統(tǒng)中的制備及藥效學(xué)評(píng)價(jià)的研究，部分研究成果顯示融合蛋白在藥物半衰期和穩(wěn)定性方面存在很大優(yōu)勢(shì)，其結(jié)構(gòu)解析和評(píng)價(jià)指標(biāo)還有待進(jìn)一步細(xì)化和研究[12-13]。同時(shí)，研究CHO系統(tǒng)制備的HSA單體的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于HSA融合蛋白的制備和應(yīng)用也具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)嘗試通過CHO表達(dá)系統(tǒng)制備HSA蛋白，并與實(shí)驗(yàn)室前期制備的酵母表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行比較，為HSA融合蛋白質(zhì)藥物制備及功能研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

CHO-S 細(xì)胞和pMH3 質(zhì)粒由杭州安瑞普生物技術(shù)有限公司饋贈(zèng)；含HSA基因的模板質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自invitrogen公司；G418購(gòu)自sigma公司；無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基B001，無血清流加培養(yǎng)基F001，AP20激流式生物反應(yīng)器均購(gòu)自杭州安瑞普生物技術(shù)有限公司；酵母來源的HSA樣品由本研究室前期制備[14]；鼠抗人HSA(HRP)抗體購(gòu)自abcam公司；尿微量白蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海名典生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pMH3-HSA的分子構(gòu)建

通過引物設(shè)計(jì)，在HSA基因的N端引入Igκ信號(hào)肽，將目的基因HSA插入表達(dá)載體pMH3的多克隆位點(diǎn)中，重組表達(dá)質(zhì)粒圖譜如圖1所示。

1.2.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CHO-S細(xì)胞

收集3×106個(gè)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的CHO-S細(xì)胞，PBS洗滌1次，離心后用200 μL PBS重懸。配置電轉(zhuǎn)反應(yīng)體系：200 μL細(xì)胞懸液、20 μg質(zhì)粒、10 μg鮭魚精DNA，混勻后加入2 mm電極杯中，冰浴1 min后160 V，15 ms電擊1次，冰浴1 min后再電擊1次，隨后冰浴1 min。在細(xì)胞培養(yǎng)皿中提前加入10 mL培養(yǎng)基(DMEM/F12，含10% FBS)，將電極杯中的懸液加入培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pMH3-HSA圖譜

1.2.3 陽(yáng)性單克隆篩選

電轉(zhuǎn)24 h后換液，加入2.0 mg/L G418進(jìn)行壓力篩選，2～3 d后細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，將剩下的活細(xì)胞通過有限稀釋法進(jìn)行鋪板，按照0.5個(gè)細(xì)胞/孔鋪96孔板，共10塊板，培養(yǎng)5～7 d，通過顯微鏡觀察單克隆的生長(zhǎng)情況。挑選單克隆并用胰酶消化后，接至96孔板中，隔天后孔板的細(xì)胞匯集度約70%～80%，將有血清培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基，每孔100 μL。24 h后取上清做Dot Blot檢測(cè)。

Dot Blot檢測(cè)方法：取上述上清液，按照每點(diǎn)5 μL點(diǎn)NC膜，37 ℃烘干，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗滌1次，鼠抗人HSA (HRP) 抗體室溫孵育1 h，TBST洗滌3次后ECL顯影。

1.2.4 懸浮馴化

根據(jù)Dot Blot結(jié)果篩選6～8個(gè)高表達(dá)陽(yáng)性克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后，通過逐級(jí)降血清的方式，將有血清培養(yǎng)基逐步替換成無血清培養(yǎng)基，待替換成100%無血清培養(yǎng)基后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至搖瓶中進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，直至細(xì)胞大小均一，無成團(tuán)現(xiàn)象，密度每天翻倍，活率在98%以上視為懸浮馴化成功。

1.2.5 高密度發(fā)酵

運(yùn)用無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基B001和無血清流加培養(yǎng)基F001，在5 L一次性細(xì)胞培養(yǎng)袋上，通過機(jī)械震蕩傳氧的方式進(jìn)行高密度發(fā)酵培養(yǎng)(圖2)。

按照以下步驟進(jìn)行高密度發(fā)酵：1)電極校準(zhǔn)，裝罐。2)接種：種子培養(yǎng)基為無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基B001，接種后細(xì)胞初始密度為1.0×106個(gè)/mL，總體積4 L。3)參數(shù)設(shè)定，振蕩器轉(zhuǎn)速：55 r/min；Do 20%～40%；pH 6.8～7.4；Tm：37 ℃。4)流加：正常情況下，至第3天細(xì)胞密度可達(dá)(6.0～8.0)×106個(gè)/mL，此時(shí)可開始流加并降溫，每天流加無血清流加培養(yǎng)基F001，流加體積按照使糖濃度保持在3.0 g/L左右計(jì)算。溫度降至34 ℃。5)取樣：接種后4 h作為第0天取樣樣品，之后每天取樣，部分樣品用于細(xì)胞計(jì)數(shù)及葡萄糖濃度測(cè)定，部分樣品離心取上清后冷凍備用。6)下罐：待細(xì)胞活率下降至90%時(shí)停止發(fā)酵。

a:設(shè)備圖像；b:安裝圖片；c：參數(shù)設(shè)置系統(tǒng)

圖2AP20激流式生物反應(yīng)器

Figure 2 The torrent bioreactor of AP20

1.2.6 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將上罐過程中的取樣樣品進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并通過臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)算細(xì)胞活率，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.7 目的蛋白表達(dá)情況測(cè)定

1)SDS-PAGE 檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。將上罐過程中的上清液樣品進(jìn)行SDS-PAGE，并設(shè)置酵母表達(dá)系統(tǒng)制備的HSA樣品作為對(duì)照組，分離膠濃度為10%。

2)尿微量白蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。尿微量白蛋白檢測(cè)試劑盒原本主要用于人尿液中微量白蛋白濃度的體外定量分析，也可用于發(fā)酵樣本中白蛋白的含量檢測(cè)。其具體使用方法詳見說明書。

3)蛋白質(zhì)免疫印跡Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。首先進(jìn)行SDS-PAGE，每孔加入等體積樣品，設(shè)置畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的HSA對(duì)照。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，樣品轉(zhuǎn)至NC膜后使用5%脫脂牛奶37 ℃封閉2 h，用HSA一抗雜交，TBST漂洗3次，每次15 min，ECL顯色成像。

2 結(jié)果與分析

2.1 陽(yáng)性單克隆篩選

將1.2.3篩選的單克隆細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)情況檢測(cè)，圖3顯示部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，大部分單克隆均表達(dá)了目的蛋白HSA，挑選其中顯色較深的8個(gè)克隆用于進(jìn)一步篩選和表達(dá)。

圖3 Dot Blot篩選陽(yáng)性單克隆

2.2 發(fā)酵過程中的細(xì)胞生長(zhǎng)情況測(cè)定

在5 L一次性培養(yǎng)袋的高密度發(fā)酵過程中，每天取樣，計(jì)算細(xì)胞密度及活率，結(jié)果如圖4所示。圖4-a顯示，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)展，前3 d細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，也稱為擴(kuò)種期，第3天開始補(bǔ)料并降低溫度后，細(xì)胞密度不再持續(xù)增長(zhǎng)，處于相對(duì)平穩(wěn)期。圖4-b也表明，在10 d的發(fā)酵過程中，前9 d細(xì)胞活率均大于90%，到第10天，細(xì)胞活率下降至90%停止發(fā)酵。

a：隨著發(fā)酵過程的進(jìn)展，細(xì)胞密度隨時(shí)間的變化曲線；b：隨著發(fā)酵過程的進(jìn)展，細(xì)胞活率隨時(shí)間的變化曲線

圖4發(fā)酵過程中的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Figure 4 The cell growth curve during fermentation

2.3 發(fā)酵過程中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況

2.3.1 SDS-PAGE及Elisa法檢測(cè)HSA蛋白的表達(dá)情況

發(fā)酵結(jié)束后，通過SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)酵液上清樣品中HSA蛋白的表達(dá)情況，并設(shè)置酵母表達(dá)系統(tǒng)制備的HSA樣品作為對(duì)照組。與此同時(shí)，運(yùn)用尿微量白蛋白檢測(cè)試劑盒對(duì)表達(dá)液上清中HSA蛋白進(jìn)行定量，結(jié)果如圖5所示。CHO表達(dá)系統(tǒng)與酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的HSA蛋白的蛋白質(zhì)分子量保持一致，均在66 ku左右，隨著CHO發(fā)酵過程的進(jìn)展，目的蛋白表達(dá)量在逐漸升高，當(dāng)細(xì)胞密度處于穩(wěn)定期時(shí)，蛋白積累量顯著升高，但進(jìn)入第8天后，蛋白積累量并無顯著提升，此時(shí)細(xì)胞的活率也已開始下降，表明細(xì)胞已開始逐步進(jìn)入衰亡期，其產(chǎn)蛋白能力也開始下降。Elisa結(jié)果顯示，最高表達(dá)量約為180 μg/mL。

2.3.2 Western Blot檢測(cè)HSA蛋白的表達(dá)情況

為進(jìn)一步檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，運(yùn)用Western Blot法對(duì)發(fā)酵液上清進(jìn)行檢測(cè)，設(shè)置酵母表達(dá)系統(tǒng)制備的HSA樣品為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖6)顯示，酵母表達(dá)系統(tǒng)制備的HSA有明顯的降解顯現(xiàn)，蛋白濃度為200 μg/mL的樣品的降解現(xiàn)象最為明顯。而在CHO表達(dá)系統(tǒng)中，目標(biāo)蛋白HSA的降解問題就不太明顯，Western Blot并沒有檢測(cè)到明顯的降解條帶，進(jìn)一步驗(yàn)證了CHO 表達(dá)系統(tǒng)更適合表達(dá)該類生物蛋白。

a為SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)酵液上清樣品中HSA蛋白的表達(dá)情況(M：marker；C1:酵母表達(dá)的HSA對(duì)照品 200 μg/mL；C2:酵母表達(dá)的HSA對(duì)照品 100 μg/mL；0 d～10 d：第0～10天的發(fā)酵液上清樣品)。b為尿微量白蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)發(fā)酵液上清樣品中HSA蛋白的表達(dá)情況

圖5發(fā)酵過程中HSA的表達(dá)情況

Figure 5 The expression level of HSA during fermentation

M: Marker; C1:酵母表達(dá)的HSA對(duì)照品200 μg/mL； C2： 酵母表達(dá)的HSA對(duì)照品100 μg/mL; 0 d～10 d：第0～10天的發(fā)酵液上清樣品

圖6WesternBlot檢測(cè)發(fā)酵過程中目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況

Figure 6 The expression level of HSA during fermentation detected by Western Blot

3 討論與結(jié)論

本研究實(shí)現(xiàn)了人血清白蛋白HSA在CHO系統(tǒng)中的表達(dá)，將CHO表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的HSA蛋白進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明HSA蛋白更適合在CHO系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，其蛋白完整性優(yōu)勢(shì)在該系統(tǒng)中表現(xiàn)得尤為明顯。因?yàn)镃HO表達(dá)系統(tǒng)具有準(zhǔn)確的翻譯后修飾能力，其表達(dá)的糖基化蛋白質(zhì)在分子結(jié)構(gòu)、理化特性及生物學(xué)活性方面更接近于天然蛋白質(zhì)。該實(shí)驗(yàn)也為后期功能性HSA融合蛋白的表達(dá)和研究提供了依據(jù)。當(dāng)然，CHO表達(dá)系統(tǒng)也存在成本高、產(chǎn)量低的缺點(diǎn)，針對(duì)這些問題目前普遍實(shí)行的策略包括[9,15 ]：1)改造表達(dá)載體。主要包括通過定點(diǎn)整合的基因靶向技術(shù)和順式作用元件增加基因的表達(dá)。2)以組學(xué)為基礎(chǔ)的方法應(yīng)用于細(xì)胞系開發(fā)的全過程。以組學(xué)為基礎(chǔ)的方法包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)，其應(yīng)用范圍包括上游的克隆篩選、細(xì)胞工程、培養(yǎng)條件到下游的蛋白質(zhì)純化。3)利用細(xì)胞工程技術(shù)對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行改造。即通過對(duì)宿主細(xì)胞的一系列改造來減少細(xì)胞的死亡率，并提高最終的蛋白產(chǎn)量，包括細(xì)胞凋亡抵抗、細(xì)胞自噬抵抗、細(xì)胞周期調(diào)控及翻譯后修飾等。