常溫纖維素降解細菌的篩選及其復合系的構建

孟建宇， 冀錦華， 郭慧琴， 陶 羽， 馮福應， 趙鴻彬

(內蒙古農業(yè)大學 生命科學學院應用與環(huán)境微生物研究所， 呼和浩特 010011)

纖維素是一種不溶于有機溶劑與水的大分子多糖，是自然界中最豐富的碳水化合物[1-2]，物理或化學手段處理纖維素普遍存在成本高、利用不充分、有害副產物多等問題[3]，而高效、環(huán)保的微生物法日益被用于轉化利用纖維素資源，是處理纖維素廢棄物的重要手段。在降解纖維素的微生物中，真菌的降解能力較強，但因其生長緩慢、相關酶類結構復雜且熱穩(wěn)定性較差和不耐堿性等缺點限制了其工業(yè)化發(fā)展[4]，而細菌具有來源更廣、種類更多、生長快等優(yōu)點，能在各種極端環(huán)境生存，易于大規(guī)模工業(yè)生產而顯現(xiàn)了潛在的應用前景，而國內外對細菌降解纖維素的研究報道較少[5-7]。

以往研究主要針對單一的底物分離纖維素降解菌，獲得的菌株普遍存在酶活較低、適應性不強等缺陷。復合微生物處理主要是利用不同菌株各自的優(yōu)勢特點進行組合，復合菌系中微生物間的協(xié)作關系大大提高了它們對纖維素的降解能力，達到更好的處理效果[8-9]。目前，利用復合菌系降解纖維素已受到廣泛關注。分離高效降解纖維素菌的研究已有較多報道，但對細菌組成的復合菌系的研究相對較少[10-11]。

常溫復合菌系能高效分解纖維素、半纖維素等成分，在寒區(qū)農業(yè)廢棄物資源化利用方面有著一定的應用潛力[12]。內蒙古自治區(qū)屬于溫帶寒冷區(qū)，秋冬季周期長，纖維素降解菌資源豐富。因此，認識和挖掘該地區(qū)纖維素降解菌資源，篩選高效的纖維素降解菌群，將為開發(fā)降解纖維素復合菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

樣品采集自內蒙古自治區(qū)呼倫貝爾森林的帶腐爛落葉的表層土壤，放冰盒運回實驗室，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基及試劑配方

1)富集培養(yǎng)基：纖維素(秸稈末、濾紙漿)5 g，蛋白胨 5 g，CaCO32 g，NaCl 5 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，ddH2O 1000 mL，pH 自然。2)篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉/微晶纖維素/D-水楊苷 5 g，酵母粉 2 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，瓊脂 20 g，ddH2O 1000 mL，pH值自然。3)鑒別培養(yǎng)基：(NH4)2SO42 g，MgSO40.5 g，K2HPO41 g，NaCl 0.5 g，羧甲基纖維素鈉/微晶纖維素/D-水楊苷 2 g，剛果紅 0.4 g，瓊脂 22 g，ddH2O 1000 mL。4)濾紙培養(yǎng)基：濾紙條(每條1 cm×3.6 cm，約0.03 g)5 g，酵母粉 2 g，KH2PO40.5 g，MgSO40.5 g，ddH2O 1000 mL，pH值自然。5)1% 羧甲基纖維素鈉/微晶纖維素/D-水楊苷溶液：10 g 羧甲基纖維素鈉/微晶纖維素/D-水楊苷溶解于檸檬酸緩沖液(pH 4.8，0.2 mol/L)并定容至1000 mL。

1.3 纖維素降解菌的篩選

將采集的土樣充分混勻，取適當樣品接入含有富集培養(yǎng)基的燒杯中，置25 ℃培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)15 d后，轉接新鮮培養(yǎng)基再次富集培養(yǎng)，共轉接3次。取10 mL富集培養(yǎng)液加入含90 mL無菌水的三角瓶中，置于 120 r/min搖床中25 ℃振蕩1 h，充分混勻，稀釋成10-2、10-3和10-43個濃度梯度(每個梯度3個重復)，涂布到3種含不同碳源的篩選培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)1～2周。挑取不同形態(tài)、顏色的菌落進行分離純化，然后將純化的單菌落分別接種到對應的碳源-剛果紅鑒別培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)，進一步觀察菌株生長情況，根據(jù)水解圈的大小篩選纖維素酶活性高的菌株。

1.4 菌株的鑒定及其系統(tǒng)發(fā)育分析

參考胡曉紅等[13]的方法對細菌DNA的進行提取。選用細菌通用引物對27F和1492R進行PCR擴增，產物進行純化后用pEASY-T1 Cloning Kit(北京全式金生物技術有限公司)將目的片段與載體連接，并將其轉入EscherichiacoliDH5α中。用M13引物對陽性克隆子進行菌落PCR擴增檢測，由上海生物工程有限公司進行測序。將測序結果中的載體序列刪除，然后選取峰圖整齊的序列利用EzTaxon數(shù)據(jù)庫對各個核酸序列進行比對及相似性比較。

1.5 酶活性測定

以150 μL 1%(W/V)的微晶纖維素/CMC-Na/D-水楊苷緩沖液分別作為反應底物，加入50 μL粗酶液，于50 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，然后加入200 μL DNS終止反應，并將混合物在沸水浴中煮5 min，待反應混合物冷卻，加入650 μL蒸餾水，混勻，取出200 μL加至96孔酶標板上，用酶標儀測定540 nm下的吸光值(OD540)。分別測定外切葡聚糖酶、內切葡聚糖纖維二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶的酶活性。

以150 μL的醋酸緩沖液和1.5 mg濾紙作反應的底物，加入50 μL粗酶液，于50 ℃恒溫水浴鍋中反應30 min，然后加入200 μL DNS終止反應，并將混合物在沸水浴中煮5 min，待反應混合物冷卻，加入650 μL蒸餾水混勻，取出200 μL加至96孔酶標板上，用酶標儀測定540 nm下的吸光值(OD540)，測定總酶活(濾紙酶活)。

酶活力定義：在50 ℃的反應條件下，1 min內催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1 U/mL。

1.6 常溫細菌降解復合系的構建

從分離純化得到的互不拮抗菌株中，對應每種纖維素碳源分別篩選出3株酶活性較高的菌株，共9株，進行復合系構建。

1.6.1 單菌株的濾紙酶活性測定

把互不拮抗的菌株單獨接種到濾紙培養(yǎng)基中，于25 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔24 h檢測一次發(fā)酵液的OD540值，以測定濾紙酶活。

1.6.2 降解復合系的構建及其酶活性測定

把互不拮抗的菌株接種到對應碳源的液體培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)，當OD600均接近時，分別在3種不同碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株當中任意選擇一株菌組合成復合系。各取1 mL復合系培養(yǎng)液分別接種到50 mL已滅菌的濾紙培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h測定一次發(fā)酵液的濾紙酶活。

1.6.3 降解復合系的濾紙降解率

將烘干至恒重的濾紙加入到降解復合系的培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)結束后將培養(yǎng)液于5400 r/min離心6 min，去除上清液后水洗，于6000 r/min離心6 min，再用鹽酸和硝酸的混合溶液洗除菌體后，用清水洗滌，105 ℃烘干至恒重，稱重，計算失重率，每組3個平行[14]。

2 結果與分析

2.1 常溫纖維素降解細菌的分離篩選

用3種含不同碳源的培養(yǎng)基分離篩選常溫纖維素降解細菌，共得到258株細菌。菌落顏色主要以白色、深紅色、乳白色、黃色、淺黃色、橘紅色為主，多為圓形或近圓形的凸起，邊緣光滑，光澤不透明；無規(guī)則的菌落很少，邊緣粗糙、扁平的菌落較少。

2.2 不同碳源篩選的常溫纖維素降解菌群結構分析

圖1 以微晶纖維素為底物篩選的常溫細菌群落組成

對得到的16S rDNA序列在EzTaxon數(shù)據(jù)庫中進行分類及同源性分析發(fā)現(xiàn)，在258株常溫纖維素降解細菌中，可以利用微晶纖維素(Avicel)的細菌有69株(圖1)，其中，18株屬于變形菌門中的α-變形菌綱(α-Proteobacteria)，占全部菌株的26%；26株屬于變形菌門中的γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)，占38%；12株屬于放線菌門(Actinobacteria)中的Micrococcales綱，占17%；5株屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)中的Flavobacteria綱，占7%；8株屬于厚壁菌門(Firmicutes)中的桿菌綱(Bacilli)，占12%(圖1-A)。在屬分類水平上，假單胞菌屬(Pseudomonas)，共16株占23%為降解微晶纖維素的優(yōu)勢菌屬。其次是根瘤菌屬(Rhizobium)，共8株占12%；Lelliottia，共8株占12%；厄氏菌屬(Oerskovia)，共8株占12%；芽孢桿菌屬(Bacillus)，共8株占12%，見圖1-B。

能利用羧甲基纖維素(CMC)的細菌有97株(圖2)，其中，20株屬于變形菌門中的α-變形菌綱(α-Proteobacteria)，占全部菌株的21%；33株屬于變形菌門中的γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)，占34%；18株屬于放線菌門(Actinobacteria)中的Micrococcales綱，占19%；8株屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)中的Flavobacteria綱，占8%；6株菌屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)中的Sphingobacteriia綱，占6%；12株屬于厚壁菌門中(Firmicutes)的桿菌綱(Bacilli)，占12%(圖2-A)。在屬水平上，假單胞菌屬(Pseudomonas)共23株占24%，為降解CMC的優(yōu)勢菌群。其次是厄氏菌屬(Oerskovia)，共15株占15%、芽孢桿菌屬(Bacillus)，共12株占12%；根瘤菌屬(Rhizobium)，共10株占10%；Lelliottia，共10株占10%，見圖2-B。

圖2 以羧甲基纖維素為底物篩選的常溫細菌群落組成

可以利用D-水楊苷的細菌有92株(圖3)，其中，21株屬于變形菌門中的α-變形菌綱(α-Proteobacteria)，占全部菌株的23%；35株屬于變形菌門中的γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)，占38%；有18株屬于放線菌門(Actinobacteria)中的Micrococcales綱，占20%；5株屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)中的Flavobacteria綱，占5%；4株屬于擬桿菌門(Bacteroidetes)中的Sphingobacteriia綱，占4%；9株屬于厚壁菌門(Firmicutes)中的桿菌綱(Bacilli)，占10%(圖3-A)。在屬的分類水平上，假單胞菌屬(Pseudomonas)，共24株占26%，為降解D-水楊苷的優(yōu)勢菌群。其次是厄氏菌屬(Oerskovia)，共18株占20%；芽孢桿菌屬(Bacillus)，共9株占10%；根瘤菌屬(Rhizobium)，共9株占10%，見圖3-B。

2.3 常溫纖維素降解菌的酶活測定

對篩選得到的258株常溫纖維素降解菌在25 ℃下進行其相對酶活的測定，將其中酶活性相對較高的前10株菌列于表1。其中，以微晶纖維素為碳源篩得的菌株的酶活性大部分在50～80 U/mL之間，菌株DCXA31和DCXA5-3的酶活性分別為25.7 U/mL和33.3 U/mL，DCXA22酶活性最高，達83.0 U/mL；菌株DCXC48的CMC酶活性最低，為7.6 U/mL，菌株DCXC16酶活性最高，達37.3 U/mL，其余菌株的酶活性均在10～30 U/mL之間；菌株DCXD7和DCXD43的β-葡糖苷酶活性較低，分別為10.9 U/mL和13.7 U/mL，其余菌株均在15～30 U/mL之間。

表1 3種不同碳源篩選的常溫纖維素降解菌的酶活性

注：表中Avicel表示微晶纖維素；CMC表示羧甲基纖維素；D-Salicin表示D-水楊苷

圖3 以D-水楊苷為底物篩選的常溫細菌群落組成

2.4 常溫纖維素降解復合系的構建及其降解濾紙能力

從對應每種纖維素碳源分別篩選出3株酶活性較高的菌株，然后組合成27個復合系。降解微晶纖維素能力較強的菌株為DCXA52、DCXA22和DCXA58，分別編號為1、2、3；降解CMC能力較強的菌株為DCXC50、DCXC10和DCXC16，分別編號為1′、2′、3′；降解D-水楊苷能力較強的菌株為DCXD27、DCXD7-1和DCXD68，分別編號為1″、2″、3″。9株菌經(jīng)測序得到其16S rDNA序列，經(jīng)過EzTaxon數(shù)據(jù)庫比對，與最近緣模式種的同源性均大于98%，其所屬菌種信息如表2所示。其中，菌株DCXA52、DCXA58屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，DCXA22屬于根瘤菌屬(Rhizobium)，DCXC10屬于黃桿菌屬(Phyllobacterium)，DCXC16屬于Chitinophaga，DCXC50和DCXD7-1屬于厄氏菌屬(Oerskovia)，DCXD68屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，DCXD68屬于Lelliottia。

表2 常溫降解復合系所用菌株的序列同源性

2.4.1 降解復合系所用單菌株在濾紙培養(yǎng)基中的酶活

將構建常溫降解復合系所用的單菌株分別接種到濾紙液體培養(yǎng)基中25 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h測定1次酶活性，結果如圖4所示。酶活均在第4天達到最大。降解微晶纖維素的菌株DCXA52、DCXA58、DCXA22的酶活分別為29.38、26.08和26.00 U/mL；降解CMC的菌株DCXC10、DCXC50、DCXC16的酶活分別為20.20、21.36和28.96 U/mL；降解D-水楊苷的菌株DCXD7-1、DCXD27、DCXD68的酶活分別為22.24、22.75和30.15 U/mL。

圖4 構建常溫降解復合系的單菌株的濾紙酶活性

2.4.2 降解復合系的濾紙酶活及濾紙降解率

把27個降解復合系組合分別接種到濾紙液體培養(yǎng)基中25 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔24 h對各個組合的濾紙酶活性進行測定，結果如圖5所示。 降解復合系在發(fā)酵的過程中，14個組合的濾紙酶活性出現(xiàn)了兩個峰值，剩余13個組合的酶活性只出現(xiàn)一個峰值。其中，組合C13′1″、C13′3″、C21′1″、C21′3″、C23′1″、C32′1″、C33′3″在第4天和在第6天出現(xiàn)兩個峰值；組合C11′3″、C22′1″、C31′3″、C31′2″、C32′2″、C33′2″在第3天和第5天出現(xiàn)兩個峰值；組合C31′2″在第2天和在第4天出現(xiàn)兩個峰值；而組合C11′1″、C11′2″、C12′2″、C22′2″、C32′3″、C33′1″只在第5天出現(xiàn)一個峰值；C12′2″、C13′2″、C21′2″、C22′3″、C23′2″、C23′3″只在第4天出現(xiàn)一個峰值；C12′1″只在第6天出現(xiàn)一個峰值。

圖5 常溫降解復合系的濾紙酶活性

降解復合系中酶活性比較高的組合是C11′3″、C22′1″、C31′1″、C32′2″、C33′2″、C12′2″和C22′2″。這些復合系濾紙酶活性約在194～200 U/mL范圍內，而其中最高的為復合系C11′3″、C32′2″和C33′2″，酶活性分別為200.60、200.05和208.79 U/mL，是復合系中單獨菌株的6～10倍，濾紙降解率分別為26.8%、22%和32.4%(圖6)，為常溫降解濾紙的優(yōu)勢菌群組合。

圖6 常溫降解復合系7 d內的濾紙降解率

3 討論

本文分別以微晶纖維素、羧甲基纖維素和D-水楊苷為唯一碳源共篩選得到258株常溫纖維素降解細菌。其中，γ-Proteobacteria為第一優(yōu)勢菌群，α-Proteobacteria為第二優(yōu)勢菌群，在所有降解纖維素細菌中占絕對的數(shù)量優(yōu)勢，為主要菌群，這與很多文獻報道類似[15]；其次為Actinobacteria。分離到的降解纖維素細菌分屬于21個不同的屬，其中假單胞菌屬(Pseudomonas)、根瘤菌屬(Rhizobium)、劍菌屬(Ensifer)、芽孢桿菌屬(Bacillus)和黃桿菌屬(Flavobacterium)為主要的纖維素降解細菌，蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、Lelliottia、厄氏菌屬(Oerskovia)、葉桿菌屬(Phyllobacterium)、桿菌屬(Ancylobacter)、地桿菌屬(Pedobacter)、短小桿菌屬(Curtobacterium)、新鞘脂菌屬(Novosphingobium)、拉恩氏菌屬(Rahnella)、氨基桿菌屬(Aminobacter)、Prolinoborus和Shinella等屬的細菌在降解纖維素方面鮮有報道。

程仕偉等[16]篩選得到菌株B29的外切葡聚糖酶活性為50 U/mL，崔海洋等[17]篩選到菌株B16的微晶纖維素酶活為16.39 U/mL，本文用于構建常溫降解復合系所用的菌株中，微晶纖維素酶活性在60～85 U/mL范圍內，大致處于較高水平。陳晶晶等[18]篩選到一株常溫高活性降解纖維素細菌XWS-12，其CMC酶活為21.08 U/mL；黃春凱等[19]篩選到的常溫高效纖維素降解菌KZ-1、KZ-2、KZ-3和KZ-4，其CMC酶活為43.52、80.38、47.24和25.61 U/mL，張云峰等[20]從堆肥和林場腐殖層土壤樣品中分離到6株細菌，CMC酶活在14.75～30.58 U/mL之間，本文用于構建常溫降解復合系所用的CMC降解菌中，CMC酶活在22.93～37.34 U/mL范圍內，處于中等水平。方尚玲等[21]篩選到一株高β-葡萄糖苷酶活性菌株HGS-3，其活性在優(yōu)化條件下為93.48 U/mL，張建芬等[22]從白蟻腸道內篩選到的菌株Z-4的β-葡萄糖苷酶活性為18.2 U/mL，本文用于構建常溫降解復合系的D-水楊苷降解菌，酶活性大約在20～30 U/mL范圍內，處于中等水平。

自然環(huán)境中纖維素的降解是由多種纖維素降解微生物協(xié)同完成的。單獨菌株在纖維素降解過程中存在底物抑制和產物反饋抑制，使其降解效率和水平下降。微生物復合系降解纖維素的效率及活性均比單獨菌株作用高。Gurdeep等[23]從堆肥中篩選出了纖維素降解菌群WSUCF1，其生長率和酶活均較高，其CMC酶活在24 h內仍能維持在89%左右。侯敏等[24]將分離到的枯草芽孢桿菌M22 與產朊假絲酵母J1、植物乳桿菌J2和地衣芽孢桿菌J3組成復合系，濾紙酶活達19.420 U/L。潘林等[25]構建的常溫復合菌系在培養(yǎng)6 d時有最大濾紙酶活性(0.17 U/mL)，濾紙降解率10.81%；潘虎等[26]篩選構建了一個高效纖維素降解菌群SYF，其培養(yǎng)10 d后，濾紙酶活性為126.3 U/mL，濾紙降解率為71.5%，酶活性低于本實驗常溫降解復合系的最高濾紙酶活性，但其濾紙降解率很高；趙聽[27]構建了小麥秸稈降解復合菌群FWD1，其濾紙酶活性為75.74 U/mL，其在7 d內的濾紙降解率為10%，低于本文中的常溫濾紙降解復合系的濾紙降解率。Yuan等[28]從堆肥中篩選出的復合菌系MC1 3 d內濾紙降解率為88%；Wang 等[29]從高溫期堆肥中富集獲得的復合菌系10 d可降解99%的濾紙，降解效率遠高于同類復合菌系。本文構建的常溫降解濾紙降解復合系中，濾紙酶活性最高的降解復合系為C11′3″、C32′2″和C33′2″，酶活性分別為200.60、200.05和208.79 U/mL，是復合系中單獨菌株的6～10倍，25 ℃下7 d內濾紙降解率分別為26.8%、22%和32.4%，為常溫降解復合系最優(yōu)菌群組合，具有較高的應用潛力，值得進一步研究。