長期魔芋低聚甘露糖處理可改善小鼠焦慮樣行為

王曉琴， 馬艷芳， 唐湘華， 王功伍

(1. 云南師范大學(xué) 體育學(xué)院 國家級高原訓(xùn)練實驗教學(xué)中心； 2. 云南師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點實驗室, 昆明 650500)

魔芋低聚甘露糖(Konjac mannan-oligosaccharides, KMOS)，又稱魔芋葡甘露低聚糖，是由魔芋塊莖中含量豐富的葡甘露聚糖通過降解得到的一類主要由二糖到十糖等低聚糖的混合物[1]。KMOS具有促進腸道益生菌增殖[2-5]、維持腸道正常形態(tài)功能[3, 6-7]、提高機體抗氧化和免疫[7-9]、降血脂[10]等多種作用。而腸道功能和機體免疫的增強以及益生菌可通過腸-腦軸(Gut-brain axis)促進認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)海馬內(nèi)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)表達和神經(jīng)元增殖[11]，并具有抗抑郁效應(yīng)[12-13]。KMOS作為益生元和食品添加劑已廣泛使用，但尚不清楚長期食用是否具有抗焦慮和抗抑郁作用。本研究以小鼠為實驗動物，研究了長期飼喂KMOS對小鼠抑郁和焦慮相關(guān)情緒行為及情緒相關(guān)腦區(qū)腹側(cè)海馬(Ventral hippocampus, VH)神經(jīng)元密度的影響，為KMOS的心理健康效應(yīng)研究和應(yīng)用提供實驗證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

清潔級健康成年雄性昆明(KM)小鼠50 只用于本實驗(4周齡，購自成都達碩實驗動物公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2015-030)。動物共分為5組，包括對照組和4個給藥組，分籠飼養(yǎng)，每籠10只。自由飲食。飼養(yǎng)間保持12 h /12 h 的明暗周期變化，室內(nèi)溫度保持在(22±1) ℃。給藥前動物先在實驗室適應(yīng)一周。KMOS(純度≥95%，由生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心提供)每天處理1次，每次0.2 mL[劑量分別為0(對照組)、650、1400、3000和6500 mg/kg，生理鹽水溶解，灌胃給藥]，連續(xù)處理30 d。本研究總體實驗流程如圖1所示。

KMOS： Konjac mannan-oligosaccharides; OFT： open field test; EPM： elevated plus maze; FST： forced swimming test

圖1本研究實驗流程圖

Figure 1 Timeline flow chart of experiments in present study

1.2 行為學(xué)實驗方法

1.2.1 曠場實驗(Open field test, OFT)

實驗箱是規(guī)格為60 cm×60 cm×50 cm的淺灰色PVC塑料敞口箱。將動物放入中央?yún)^(qū)域，觀察5 min，并用動物行為視頻軟件(北京天鳴宏遠)記錄并分析其行為數(shù)據(jù)。在軟件中將箱底平均分為16個正方形小格(邊長15 cm)，外周12個格子為周圍區(qū)，中央4個格子為中央?yún)^(qū)。分析指標(biāo)包括直立次數(shù)、理毛、排便及其在中央和四周區(qū)域活動的時間和路程以及進出中央?yún)^(qū)域的次數(shù)。測完用75%酒精擦拭曠場箱。

1.2.2 高架十字迷宮(Elevated plus maze, EPM)

迷宮為木制，由閉臂、開臂各一對及中央平臺組成。閉臂長75 cm，寬7.5 cm，高10 cm；開臂僅有底板。中央平臺為邊長7.5 cm的正方形區(qū)域。迷宮距地面60 cm。實驗時，將小鼠放入中央平臺區(qū)域，頭向開臂，讓其自由探索。用視頻軟件記錄5 min動物活動軌跡，并分析其在閉臂和開臂中的時間、路程、進入次數(shù)、潛伏期、速度、靜止時間等指標(biāo)。測完用75%酒精擦拭迷宮。

1.2.3 強迫游泳測試(Forced swimming test, FST)

該測試采用敞口的圓筒狀透明玻璃水缸(高30 cm，直徑15 cm)。缸內(nèi)注入清水，深20 cm，水溫維持在(23±1) ℃。將小鼠尾部向下，置于水中。小鼠會在缸中掙扎和游動，但無法逃脫。記錄5 min內(nèi)小鼠漂浮不動的時間。若其為維持身體平衡，僅僅輕輕擺動肢體仍算作不動。

1.2.4 腦組織學(xué)檢查

待所有行為學(xué)實驗完成后，將動物深度麻醉(4%戊巴比妥鈉，80 mg/kg，腹腔注射)后，生理鹽水經(jīng)主動脈灌流，4%甲醛溶液固定，取腦后將其在4%甲醛溶液中繼續(xù)固定至少7 d。從固定后的腦上切取海馬部分，用振動切片機行冠狀切片(20 μm)，經(jīng)焦油紫染色、脫水透明后封片。在20倍物鏡下選取腦切片的VH-CA3亞區(qū)拍照，在固定位置選取長30 μm的主細胞條帶，使用ImageJ 1.52k軟件計數(shù)神經(jīng)元數(shù)目。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 腦組織學(xué)檢查

在本研究整個飼喂和實驗中，KMOS組小鼠總體狀態(tài)良好。腦組織學(xué)檢查結(jié)果表明，VH-CA3亞區(qū)神經(jīng)元數(shù)目存在組間差異(ANOVA:F(3,34)=10.265,P=0.000)。KMOS組神經(jīng)元形態(tài)正常，但密度增大，條帶增寬，6500 mg/kg組動物的神經(jīng)元數(shù)目較對照組增加(P=0.000，圖2)。Pearson相關(guān)分析也表明，各組VH-CA3亞區(qū)神經(jīng)元數(shù)目與KMOS劑量間存在顯著的正相關(guān)(R2=0.699，P=0.000)，提示KMOS應(yīng)能促進該亞區(qū)神經(jīng)元增殖或存活。

A:對照(control)；B:650 mg/kg；C:1400 mg/kg；D:3000 mg/kg；E:6500 mg/kg; F:神經(jīng)元計數(shù)分析結(jié)果(Result of neuron number analysis)。**P<0.01，vs.對照相(vs. control)；在顯微照片中，比例尺代表10 μm (the scale bar is 10 μm in the microphotographs)

圖2小鼠腹側(cè)海馬CA3亞區(qū)顯微照片(焦油紫染色，20×，A-E)及KMOS對該亞區(qū)神經(jīng)元數(shù)目(30μm條帶)的影響(F)
Figure 2 Microphotographs of ventral hippocampal CA3 subarea (cresyl violet staining, 20×, A-E) and the effect of KMOS on its neuron number (in 30 μm cell band) in mice (F)

2.2 OFT

在OFT實驗中，計數(shù)數(shù)據(jù)(圖3)顯示，除了排便顆數(shù)無明顯組間差異(F(4,41)=0.938,P=0.452)外，見圖3-D，各組在中央?yún)^(qū)進入次數(shù)(F(4,39)=5.384,P=0.002，見圖3-A，直立次數(shù)(F(4,40)=4.765,P=0.003，見圖3-B及理毛次數(shù)(F(4,41)=4.935,P=0.002)，見圖3-C方面均有明顯差異。多重比較表明，KMOS 650 mg/kg組理毛次數(shù)(P=0.048)及1400、3000 mg/kg組的中央進入次數(shù)(均P≤0.002)和直立次數(shù)(均P≤0.003)均高于對照組。

在計量數(shù)據(jù)方面，與周圍區(qū)相比，各組動物在中央?yún)^(qū)的時間、路程、速度及靜止時間方面均有差異顯著性(GLM-RM，均F(1,4)≥33.518，P=0.000)，見圖4，且無明顯區(qū)域×藥物處理交互效應(yīng)(均F(1,4)≤1.663，P≥0.179)，說明所有動物具有正常的感覺、運動和動機能力，能明確分辨曠場環(huán)境并作出傾向性行為反應(yīng)。GLM-RM同時表明，除靜止時間(F(1,4)=0.995;P=0.422)外，其余各參數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果(均F(1,4)≥2.734;P≤0.043) 均提示有顯著的藥物處理效應(yīng)。配對T檢驗表明，除對照組外(P=0.097)，KMOS處理組動物在中央?yún)^(qū)的速度均明顯高于周圍區(qū)(均P≤0.044)。ANOVA分析提示，速度指標(biāo)存在組間差異顯著性(F(4,39)=3.002,P=0.030)，其余指標(biāo)無明顯差異(均P≥0.124)；多重比較表明，KMOS_1400 mg/kg組中央?yún)^(qū)速度顯著高于對照組(P=0.007)，見圖4-D。

A:中央?yún)^(qū)進入次數(shù)(central area entries)；B:直立次數(shù)(rearing times)；C:理毛次數(shù)(grooming times)；D:排便顆數(shù)(defecation number); #P<0.05, ##P<0.01,vs.對照組(vs. control)

圖3KMOS對小鼠曠場一般行為(計數(shù)指標(biāo))的影響
Figure 3 Effect of KMOS on general behaviors (count data) of open field test in mice

A:時間(time)；B:路程(pathway)；C:靜止時間(static time)；D:速度(speed)。*P<0.05，**P<0.01與周圍區(qū)相比(vs. peripheral area)；#P<0.05，vs.對照組(vs. control)

圖4KMOS對小鼠曠場水平運動(計量指標(biāo))的影響
Figure 4 Effect of KMOS on horizontal motor of in open field behavior (measurement data) mice

2.3 EPM

GLM-RM分析表明，動物在總體上的開臂時間、路程、進入次數(shù)和潛伏期、速度、靜止時間方面均明顯低于閉臂(均F(1,4)≥10.579，P≤0.020)，見圖5。開閉臂×藥物處理交互效應(yīng)方面，除靜止時間一項交互效應(yīng)較為明顯(F(1,4)=3.339,P=0.020)外，其余各參數(shù)均無顯著性(均F(1,4)≤2.261,P≥0.080)。藥物處理方面，除進入次數(shù)存在明顯差異(F(1,4)=4.776,P=0.003)外，其余各參數(shù)均無顯著性(均F(1,4)≤2.485,P≥0.060)。ANOVA分析發(fā)現(xiàn)，開臂進入次數(shù)(F(4,41)=3.591,P=0.013)和閉臂靜止時間(F(4,38)=3.093,P=0.027)存在明顯組間差異,見圖5-C、F，其余各數(shù)據(jù)組間差異不顯著(均P≥0.080)；多重比較表明，KMOS_3000 mg/kg組開臂進入次數(shù)高于對照組(P=0.012)，見圖5-C；而各KMOS組閉臂靜止時間與對照組相比差異不顯著(均P≥0.095)，提示組間差異應(yīng)主要由KMOS組間產(chǎn)生。

2.4 FST

在FST實驗中，所有組動物的不動時間如圖6所示。ANOVA分析表明，各組間差異不顯著(F(4,42)= 0.141，P=0.996)，提示KMOS處理對小鼠FST行為無明顯影響。

A：時間(time)；B：路程(pathway)；C：進入次數(shù)(entries)；D：進入潛伏期(latency)；E：速度(speed)；F：靜止時間(static time)。CA：閉臂(close arms)；OA：開臂(open arms)；*P<0.05, **P<0.01,vs.閉臂(vs. CA)；#P<0.05,vs.對照組(vs. control)

圖5KMOS對小鼠高架十字迷宮任務(wù)的影響
Figure 5 Effect of KMOS on performances of in mice elevated plus maze

圖6 KMOS對小鼠強迫游泳不動時間的影響Figure 6 Effect of KMOS on forced swimming immobile time in mice

3 討論與結(jié)論

OFT常用于評價小動物的運動、焦慮、探究等情緒相關(guān)行為。EPM是測量小動物焦慮水平的重要方法。本研究行為學(xué)實驗表明，KMOS處理30 d的昆明小鼠在OFT中進入中央?yún)^(qū)次數(shù)和直立次數(shù)、中央?yún)^(qū)運動速度均顯著增加(圖3-A、B,圖4-D)，且在EPM中進入開臂次數(shù)也顯著增加(圖5-C)。OFT中央?yún)^(qū)和EPM開臂對小動物來說均為較危險區(qū)域，焦慮水平高的動物較少進入。KMOS處理動物中央?yún)^(qū)和開臂進入次數(shù)、曠場直立次數(shù)的增加均可反映動物焦慮水平的降低和探究活動的增加。而其中央?yún)^(qū)平均速度較快，推測其應(yīng)是進入次數(shù)增加，活動較為放松和頻繁的表現(xiàn)。上述結(jié)果提示，長期KMOS處理可減少小鼠的焦慮樣行為。

VH與杏仁核和前額葉等情緒和認(rèn)知相關(guān)腦區(qū)有密切聯(lián)系[14-15]，也是微生物-腸-腦軸影響腦內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生和情感相關(guān)精神疾病(如抑郁癥、焦慮癥等)發(fā)生的靶點[11-13]，同時是抗抑郁藥物的靶點之一[15-16]。益生菌可通過迷走神經(jīng)腸支發(fā)揮抗抑郁和促進海馬BDNF表達和神經(jīng)元增殖作用[11]。由于KMOS具有很強的益生作用，可促進腸道益生菌增殖，改善腸道微環(huán)境，從而在多方面促進腸道健康[2-7]。因此，從理論上推測，KMOS可通過益生作用和腸-腦軸改善腦功能，發(fā)揮其情緒調(diào)控作用。在本研究中，KMOS處理小鼠VH-CA3亞區(qū)主細胞帶神經(jīng)元的數(shù)目顯著增加(圖2)，說明長期攝入KMOS可促進VH神經(jīng)元的增殖或者存活。而這可能是本研究發(fā)現(xiàn)KMOS具有抗焦慮作用的重要機制之一。

人們已發(fā)現(xiàn)，巴戟天和菊薯中的菊粉類低聚糖具有抗應(yīng)激、抗抑郁、抗焦慮和改善動物模型創(chuàng)傷應(yīng)激癥狀的作用[17-22]。動物實驗和臨床實驗均表明，巴戟天低聚糖的抗抑郁作用與其增強腦內(nèi)BDNF神經(jīng)信號通路相關(guān)[19, 23]。而BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子可促進腦內(nèi)，特別是海馬等腦區(qū)神經(jīng)元增殖和神經(jīng)功能的改善和保持[11]。因此本研究組織學(xué)結(jié)果與這些研究是一致的，支持KMOS也應(yīng)具備神經(jīng)生物學(xué)效應(yīng)，可以促進海馬CA3亞區(qū)神經(jīng)元的增殖或存活，從而發(fā)揮抗焦慮作用。FST是經(jīng)典的獲得性無助行為模型，常用于抗抑郁藥物篩選。但本研究未在FST實驗中觀察到KMOS的抗抑郁效果。一方面，菊粉類低聚糖主要是低聚果糖，而KMOS屬低聚甘露糖，結(jié)構(gòu)不同，其抗焦慮和抗抑郁的分子機制應(yīng)有一定差異。另一方面，本實驗是在正常動物而非疾病模型動物上進行的。這兩點可能是KMOS對FST實驗結(jié)果影響不明顯的原因。因此我們有必要采用疾病造模的方式，進一步研究KMOS的抗抑郁效應(yīng)及作用機制。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)，長期KMOS處理可提高小鼠VH-CA3亞區(qū)神經(jīng)元增殖或存活率，并有抗焦慮樣作用，提示KMOS作為重要的益生元，在焦慮情緒改善方面有潛在應(yīng)用價值。

致謝：云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李彥明、馬瑜、古麗柯孜·圖爾貢、何丹婷和周麗娟等同學(xué)參與了行為學(xué)和組織學(xué)實驗；中科院昆明動物所蔡景霞研究員和徐林研究員提供了實驗條件。在此表示感謝。