水稻稻瘟病抗性基因Pik-2的遺傳變異及進(jìn)化分析

牛玉芳， 肖 貴， 吳 俊， 柏 斌， 周 波,3， 肖應(yīng)輝

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院， 長(zhǎng)沙 410128； 2. 雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 湖南省雜交水稻研究中心， 長(zhǎng)沙 410125； 3. 國(guó)際水稻研究所， 菲律賓 馬尼拉 0900)

由子囊真菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病，是在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的水稻病害之一。在對(duì)抗稻瘟菌不斷變異的進(jìn)化過程中，水稻形成了復(fù)雜多變的抗病機(jī)制和豐富多樣的抗性基因。已有文獻(xiàn)概述了編碼NBS-LRR蛋白的Pb1、Pia、Pib、Pid3、Pik、Pik-h/Pi54、Pik-m、Pik-p、Pish、Pit、Pita、Piz-t、Pi1、Pi2、Pi5、Pi9、Pi25、Pi36、Pi37、Pi56、Pi63、PiCO39、Pi50、Pi65(t)和Pigm，以及分別編碼B-Lectin蛋白激酶的Pid2和富含脯氨酸蛋白的pi21等28個(gè)稻瘟病抗性基因[1]。最近又報(bào)道了不同于以往抗性機(jī)制的新基因Ptr[2]、Bsr-d1[3]和bsr-k1[4]。

位于水稻第11染色體的稻瘟病抗性基因座Pik，是水稻稻瘟病抗性基因成簇分布的3個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域之一。Kiyosawa[5]最先報(bào)道了Pik、Pikh、Pikm、Pikp和Piks5個(gè)等位基因，Pan等[6]在該位點(diǎn)鑒定到抗性反應(yīng)不同于前5者的Pikg，后來陸續(xù)鑒定出Pi1[7]、Pi7[8]、Pilm2[9]、Pi43[10]、Pi46[11]和Pi47[1]等多個(gè)新基因。Ashikawa等首次報(bào)道Pik抗性由Pikm-1、Pikm-2兩個(gè)NBS-LRR類基因共同控制，Pik功能的實(shí)現(xiàn)需要兩個(gè)NBS-LRR蛋白共同作用，相應(yīng)的無毒蛋白AvrPik只與其中的Pik-1蛋白直接互作[12]，Pik-2與Pik-1能夠形成異源二聚體[13]。

隨著Pik座位中基因的不斷克隆，其序列差異與進(jìn)化研究也取得顯著進(jìn)展。Ashikawa等[14]克隆了Kanto51中的稻瘟病抗性基因Pik-KA，與大多Pik等位基因相比，該基因的Pik-1中編碼決定Pik的抗性特異性的CC結(jié)構(gòu)域序列發(fā)生了顯著變異，而其Pik-2與其他Pik基因編碼的氨基酸序列完全一致，暗示Pik基因中的Pik-2非常保守。Constanzo等用特異性PCR引物擴(kuò)增測(cè)序分析了15個(gè)美國(guó)水稻品種Pik-m基因的DNA序列，發(fā)現(xiàn)核酸多態(tài)性都發(fā)生在Pikm-1的DNA序列，而Pikm-2等位基因即使在親緣關(guān)系甚遠(yuǎn)的品種中仍然保守[15]。目前關(guān)于Pik-2基因的多樣性及其抗性功能方面研究鮮有報(bào)道。

為了深入研究Pik-2的遺傳變異機(jī)制，本研究對(duì)來自不同國(guó)家的400份非洲稻和400份亞洲稻在Pik-2基因編碼區(qū)進(jìn)行了測(cè)序分析，擬通過分析Pik-2核苷酸水平上的多態(tài)性，明確非洲稻種和亞洲稻種Pik-2序列變異特點(diǎn)及其與地理分布的關(guān)系，為進(jìn)一步挖掘非洲和亞洲水稻品種中蘊(yùn)含的稻瘟病抗性基因提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試材料

400份非洲稻(Oryzaglaberrima)和400份亞洲稻(Oryzasativa)種質(zhì)取自國(guó)際水稻所種質(zhì)資源庫(kù)。水稻種質(zhì)CO39、麗江新團(tuán)黑谷(LTH)、日本晴、Taipei309、IR64、IRBLKp-K60和IRBLK-Ka由雜交水稻國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，其中IRBLKp-K60和IRBLK-Ka為含有Pikp和Pik-KA基因的單基因系。

1.2 水稻基因組DNA的提取及檢測(cè)

取3～4葉期水稻植株的新鮮組織100 mg，裝入2 mL離心管中，用液氮研磨成粉末。采用CTAB法進(jìn)行DNA基因組的提取[16]。

1.3 Pik-2同源基因的PCR擴(kuò)增與測(cè)序

分析已克隆的9個(gè)Pik等位基因的Pik-2 LRR區(qū)域，發(fā)現(xiàn)氨基酸多態(tài)性存在于該基因編碼蛋白的627與754位點(diǎn)[5，14,17-19]，相應(yīng)的DNA堿基序列位于1879～2457 bp之間，因此根據(jù)已知的Pik-2基因的保守序列設(shè)計(jì)引物對(duì)(RGA5-F:5′-ACAAAAGGCCTGAACTTGGCTCAAGTG-3′；RGA5-R: 5′-TCATGCAGTGACGATGCCATCAAC-3′)，由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系包括：0.25 μLTaqDNA 聚合酶(5 U/μL)，5.0 μL 10×bufffer，4.0 μL dNTPs(10 μmol/L)，1.0 μL 正向和反向引物(10 μmol/L)，2 μL 模板 DNA，加 ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電泳后于紫外投射儀下檢測(cè)條帶合格后，PCR產(chǎn)物委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.4 序列分析

用Sequencher 5.4.6軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。用軟件DNAMAN、BioEdit以及DNASP進(jìn)行單倍型以及差異性分析。然后用軟件MEGA 6.06構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。變異頻率以某位點(diǎn)堿基變異的種質(zhì)份數(shù)/總種質(zhì)份數(shù)×100%表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pik-2序列擴(kuò)增及變異分析

采用特異性引物RGA5擴(kuò)增Pik-2的LRR區(qū)域，在含有Pik-2的水稻品種中均能擴(kuò)增出特異性單一條帶(圖1)，而不含Pik-2序列的水稻品種中均未出現(xiàn)任何條帶，表明該引物對(duì)能有效擴(kuò)增特異性的Pik-2序列。利用該引物擴(kuò)增400份非洲稻和400份亞洲稻的全基因組DNA，分別獲得336份非洲稻和306份亞洲稻的Pik-2序列。

對(duì)Pik-2基因堿基位置1879～2457的核苷酸變異分析發(fā)現(xiàn)，在非洲稻中共檢測(cè)到113個(gè)變異位點(diǎn)，包含20個(gè)轉(zhuǎn)換與94個(gè)顛換位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的變異頻率為0.30%～99.70%，平均突變頻率為43.11%。在亞洲稻中共檢測(cè)到78個(gè)變異位點(diǎn)，包含18個(gè)轉(zhuǎn)換與65個(gè)顛換位點(diǎn)，變異頻率為0.33%～99.35%，平均突變頻率為37.68%。值得一提的是，在非洲稻和亞洲稻中突變頻率最高的位點(diǎn)均發(fā)生在1879堿基位點(diǎn)，其突變頻率分別為99.70%和99.35%。數(shù)據(jù)顯示，與亞洲稻對(duì)比，Pik-2基因在非洲稻中的變異更豐富。

圖1 特異性引物鑒定

2.2 Pik-2單倍型和遺傳多樣性分析

基于水稻稻瘟病抗性基因Pik-2 LRR結(jié)構(gòu)域部分序列的核苷酸差異，將336份非洲稻劃分為17種單倍型(圖2)，分別命名為OG-H1—OG-H17；將306份亞洲稻劃分為12種單倍型，命名為OS-H1—OS-H12。

圖2 非洲稻和亞洲稻的單倍型分布

非洲稻中，單倍型OG-H12為優(yōu)勢(shì)單倍型，有204份水稻種質(zhì)屬于該單倍型。OG-H12與OG-H13僅有2個(gè)堿基位點(diǎn)(一個(gè)氨基酸位點(diǎn))差異，而OG-H13卻只存在1份非洲稻中。亞洲稻中，單倍型OS-H1和OS-H3為優(yōu)勢(shì)單倍型，分別在93和141份材料中檢測(cè)到這兩個(gè)單倍型(表1)。

17種非洲稻單倍型共包含51個(gè)氨基酸位點(diǎn)的變異，其中單倍型OG-H2、OG-H4、OG-H5和OG-H6中堿基變異并未引起氨基酸變化，又如單倍型OG-H1與Pik-2相比有14個(gè)堿基變異位點(diǎn)，而僅在697、709、718、737和800 5個(gè)位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生改變(表2)，說明非洲稻不同單倍型的堿基變異大多為同義突變。12種亞洲稻單倍型的78個(gè)堿基位點(diǎn)改變卻導(dǎo)致41個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異。非洲稻和亞洲稻沒有相同的單倍型，但有36個(gè)相同的氨基酸變異位點(diǎn)。結(jié)果顯示，Pik-2的LRR區(qū)域在非洲稻與亞洲稻中可能存在不同的進(jìn)化模式，非洲栽培稻的變異更為豐富但同義突變較多，亞洲栽培稻的變異較少但多為非同義突變。

表1 亞洲稻 Pik-2不同單倍型氨基酸序列變化

2.3 Pik-2單倍型在非洲與亞洲各地區(qū)分布

非洲稻Pik-2基因的17種單倍型在西非國(guó)家都有分布，中非國(guó)家只有OG-H1、OG-H2與OG-H12 3種單倍型，南非分布的單倍型有OG-H5、OG-H11與OG-H12(圖3-A)，總體上呈現(xiàn)出大聚集、小分散的分布特點(diǎn)。非洲水稻種植主要集中在西非國(guó)家，本研究收集的非洲稻有95%來自西非國(guó)家，可能是導(dǎo)致上述結(jié)果的原因。在這些單倍型中，OG-H12分布最廣泛，在大多西非國(guó)家中都存在該單倍型,部分單倍型只在某些特定國(guó)家中發(fā)現(xiàn)。如在非洲國(guó)家布基納法索發(fā)現(xiàn)了3種特有的單倍型OG-H3、OG-H10和OG-H13，在尼日利亞發(fā)現(xiàn)2種特有的單倍型OG-H14和OG-H15，且這些單倍型都只存在其中一份水稻種質(zhì)中。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)只在特定國(guó)家多份水稻種質(zhì)中存在的單倍型，如包含單倍型OG-H4的16份水稻種質(zhì)均來源于尼日利亞，而3份OG-H17單倍型的水稻種質(zhì)均來源于利比里亞。從非洲國(guó)家的單倍型分布來看，尼日利亞、馬里和布基納法索擁有較多類型的單倍型。

圖3 非洲稻(A)和亞洲稻(B)不同單倍型的地理分布

注：圖中圓環(huán)中不同扇形顏色代表不同的單倍型；扇形面積大小代表該單倍型在該地區(qū)的分布比例； 周邊有黑色線條的圓環(huán)代表亞洲稻材料，無黑色線條者代表非洲稻材料

本研究中的亞洲稻來自63個(gè)國(guó)家或地區(qū)(圖3-B)，其中亞洲、非洲、美洲、歐洲和大洋洲的比例分別為70.3%、7.26%、15.84%、5.94%和0.66%。亞洲稻的12種Pik-2單倍型中，OS-H4、OS-H7和OS-H9 只分布于南亞國(guó)家，OS-H1和OS-H3在四大洲都有分布。亞洲稻的4個(gè)單倍型OS-H8、OS-H9、OS-H10和OS-H11都只在單份水稻種質(zhì)中檢測(cè)到，這些材料分別來自多米尼加、孟加拉、中國(guó)和不丹。與非洲稻相比，亞洲稻單倍型分布相對(duì)廣泛。

表2 非洲稻Pik-2不同單倍型氨基酸序列變化

2.4 Pik-2不同單倍型的進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，取遺傳距離為0.015為閾值，可以將非洲稻和亞洲稻的所有單倍型以及已經(jīng)克隆的Pik-2 等位基因(Piks-2、Pikm-TS-2、Pik-KA-2、Pik-KU-2、Pik-LTH-2、Pikp-2、Pikh-2、Pi7-2和Pi1-6)分為4類(圖4)。其中，Pik-2等位基因與非洲稻6個(gè)單倍型(OG-H1、OG-H2、 OG-H3、OG-H4、OG-H5、OG-H6)及亞洲稻6個(gè)單倍型(OS-H3、OS-H4、OS-H8、OS-H10、OS-H11、OS-H12)歸為一類，這一類亞洲稻和非洲稻種質(zhì)與已報(bào)道的Pik-2基因往往只有1～2個(gè)編碼氨基酸的差異。第2類包括的單倍型有OG-H12、OG-H17、OG-H7、OG-H13、OG-H11和OG-H10，這一類群均為非洲稻種質(zhì)，627-703、717-720、727-733、737-773和799-803位置的氨基酸序列完全一致。第三類包括的單倍型有OG-H8和OG-H15，這兩個(gè)單倍型在堿基2247-2249和2251-2253處都發(fā)生了堿基缺失變異。第4類包括的單倍型有OS-H5、OG-H9、OS-H7、OG-H14、OG-H16、OS-H9、OS-H1、OS-H2和OS-H6，在627、660、661、697、703、730、756、759、762、773、776、777、800、807和809號(hào)位置的氨基酸完全一致。

進(jìn)化樹分析表明，依據(jù)水稻稻瘟病抗性基因Pik-2 LRR結(jié)構(gòu)域核苷酸單倍型分類，不能將非洲稻與亞洲稻明確分組，暗示非洲稻與亞洲稻在Pik-2 LRR結(jié)構(gòu)域的進(jìn)化可能相互獨(dú)立，在各自進(jìn)化的過程中又形成了大致相似的單倍型。如第一類中的亞洲稻單倍型OS-H3和非洲稻單倍型OG-H5、OG-H2的相似系數(shù)極高，只有627、630和638處3個(gè)氨基酸的差異。

圖4 Pik-2單倍型進(jìn)化樹分析

3 討論與結(jié)論

目前已有30多個(gè)稻瘟病抗性基因被克隆，進(jìn)一步挖掘新的抗性基因難度越來越大，不斷挖掘已知抗性基因的不同等位基因，用來對(duì)抗不同生態(tài)區(qū)域復(fù)雜易變的稻瘟病生理小種，將是今后稻瘟病抗性基因資源挖掘的主要方向。已報(bào)道克隆的稻瘟病抗性基因大多成簇分布，多基因簇的序列高度相似。例如，Pi2、Pi9以及Piz-t互為復(fù)等位基因，對(duì)不同國(guó)家的稻瘟病菌株表現(xiàn)出廣譜抗性；3個(gè)基因的序列高度一致，Pi2和Piz-t只有8個(gè)氨基酸差異，Pi2、Piz-t與Pi9分別有43和46個(gè)氨基酸差異[20-21]。許多保守結(jié)構(gòu)在新基因或者等位基因挖掘中具有重要作用，利用已知基因的保守序列，設(shè)計(jì)特異性功能分子標(biāo)記，結(jié)合PCR及遺傳分析等多種方法即可克隆目標(biāo)基因的等位基因。因此，對(duì)這些抗性基因的遺傳多樣性分析，有助于挖掘抗譜更廣的新等位基因。

Pik基因座是稻瘟病抗性等位基因數(shù)目最多的位點(diǎn)[22]，且這些等位基因?qū)χ袊?guó)不同稻區(qū)的稻瘟病生理小種大多具有較廣譜及持久的抗性[23]。目前多數(shù)研究認(rèn)為Pik-2是Pik-1基因的“helper”，協(xié)助Pik-1基因行使抗病功能，對(duì)Pik-2功能的認(rèn)識(shí)往往是基于Pik-2序列保守性而設(shè)想的，這是因?yàn)槠窨寺〉?個(gè)Pik-2等位基因只在4個(gè)氨基酸位點(diǎn)有多態(tài)性[24]。本研究在336份非洲稻和306份亞洲稻中分別檢測(cè)到Pik-2基因的113和78個(gè)堿基變異，相應(yīng)51和41個(gè)氨基酸位點(diǎn)變異，表明Pik-2在非洲稻和亞洲稻種質(zhì)資源中存在比預(yù)期更為豐富的遺傳多樣性，這一研究將有助于了解和利用不同種質(zhì)資源中Pik位點(diǎn)豐富多變的基因型。

本研究根據(jù)Pik-2等位基因堿基變異的多樣性，將非洲稻和亞洲稻分別劃分為17和12種單倍型。有些稀有單倍型只在單獨(dú)或者少量種質(zhì)中發(fā)生變異，這些種質(zhì)將是進(jìn)一步挖掘Pik-2新等位基因的重點(diǎn)。非洲稻Oryzaglaberrima病蟲害抗性和耐高溫干旱能力較亞洲稻有明顯優(yōu)勢(shì)[25]，同時(shí)保留了更多的遺傳多樣性。因此，挖掘和利用非洲稻中的Pik及其他稻瘟病抗性等位基因，對(duì)于亞洲稻區(qū)培育抗病品種具有重要價(jià)值。