陜西民間醋醅中高產(chǎn)酸醋酸菌的篩選和發(fā)酵特性

謝錦明，趙秀芳，袁江蘭，康旭

(湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢，430068)

中國是食醋釀造大國，有幾千年的釀醋歷史。傳統(tǒng)的食醋發(fā)酵工藝為固態(tài)發(fā)酵[1]，但隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，液態(tài)深層發(fā)酵法因生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品穩(wěn)定、產(chǎn)量高、成本低等優(yōu)點[2-3]受到眾多食醋企業(yè)的青睞[4]。醋酸菌菌種是影響液態(tài)深層發(fā)酵醋品質(zhì)的主要因素[5]，目前中國釀醋工業(yè)常用的醋酸菌為巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)，如 AS1.41和滬釀1.01[6]，但是它們的產(chǎn)酸能力不高且條件耐受性不強(qiáng)，影響了液態(tài)深層發(fā)酵醋的品質(zhì)[7]。因此，篩選產(chǎn)酸能力強(qiáng)且條件耐受性好的醋酸菌，對促進(jìn)我國食醋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義[8]。

從中國民間或工業(yè)醋醅中篩選優(yōu)良醋酸菌，是當(dāng)前研究熱點之一[9]，近年來，關(guān)于這方面的研究報道較多。劉陽[10]等從保寧醋曲篩選出1株產(chǎn)酸量為54.28 g/L、乙醇和乙酸耐受性較好的醋酸桿菌。CHEN等[11]從工業(yè)醋醅中篩選出1株產(chǎn)酸量高達(dá)61.2 g/L的巴氏醋酸桿菌，并且可以耐受體積分?jǐn)?shù)為12%的乙醇和42 ℃的高溫，具有潛在應(yīng)用價值。

中國陜西民間有釀醋的習(xí)俗，因此民間醋醅資源豐富，是篩選醋酸菌的良好來源，但這方面鮮有研究報道。本研究采集到一種評價良好的陜西民間醋醅，通過初篩和復(fù)篩從中篩選高產(chǎn)酸醋酸菌，并與應(yīng)用廣泛的醋酸菌菌種AS1.41進(jìn)行深層發(fā)酵特性比較，然后將比較得到的最優(yōu)菌株進(jìn)行16S rDNA同源序列分析鑒定。本研究旨在獲得高產(chǎn)醋酸且具有較好耐受性的醋酸菌菌株，為推進(jìn)醋酸行業(yè)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醋醅樣品，取自陜西民間。菌株為巴氏醋酸桿菌(Acetobacterpasteurianus)AS1.41，湖北工業(yè)大學(xué)實驗室保藏菌種。

CaCO3(輕質(zhì)，99%)，上海麥克林；酵母提取物(YEAST EXTRACT)，Oxid; 葡萄糖、無水乙醇、NaOH、酚酞、FeCl3等(均為分析純)、瓊脂條(BR)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司； HNY恒溫培養(yǎng)振蕩器，天津市歐諾儀器儀表有限公司；303電熱培養(yǎng)箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司；TGL-18M臺式高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(GYa)：10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、體積分?jǐn)?shù)為2%的無水乙醇。

分離培養(yǎng)基(GYb)：10 g/L葡萄糖、110 g/L酵母提取物、20 g/L CaCO3、20 g/L瓊脂、體積分?jǐn)?shù)為3%的無水乙醇。

種子培養(yǎng)基(GYc)：10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、體積分?jǐn)?shù)為3.6%的無水乙醇。

發(fā)酵培養(yǎng)基(GYd)：10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物。使用前，根據(jù)實驗設(shè)計添加不同體積分?jǐn)?shù)的無水乙醇。

以上培養(yǎng)基使用前，均在0.1 MPa、121 ℃條件下蒸汽滅菌20 min。

1.3 實驗方法

1.3.1 醋醅中醋酸菌的富集培養(yǎng)

采集新鮮的陜西民間醋醅，于4 ℃下保存。首先富集醋醅中醋酸菌。在250 mL搖瓶中，醋醅與GYa培養(yǎng)基按1∶20的質(zhì)量比稀釋至100 mL， 30 ℃、 180 r/min富集培養(yǎng)48 h，使醋酸菌快速增殖。

1.3.2 醋酸菌的初篩

在滅菌后熱的GYb培養(yǎng)基添加體積分?jǐn)?shù)為3%的無水乙醇，倒平板。用無菌生理鹽水將富集的醋醅醋酸菌培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，分別取 10-5、10-6和10-7稀釋度培養(yǎng)液200 μL涂布于篩選平板上，30 ℃培養(yǎng)72 h。挑取透明圈直徑比大的單菌落進(jìn)行劃線分離，4 ℃下斜面保存。

1.3.3 醋酸菌的復(fù)篩

斜面保藏的分離菌株進(jìn)行革蘭氏染色試驗[12]和產(chǎn)酸定性試驗[13]。產(chǎn)酸定性試驗操作為將分離菌株接種于GYc培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)72 h。然后取10 mL培養(yǎng)液5 000 r/min離心10 min，取5 mL 上清液用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，然后煮沸，加入5滴0.1 mol/L FeCl3溶液，產(chǎn)生紅褐色沉淀者初步確認(rèn)為醋酸菌。

1.3.4 醋酸菌種子活化

斜面保藏的分離菌株接種至GYc中，30 ℃、180 r/min 搖瓶活化24 h。

1.3.5 高產(chǎn)酸醋酸菌的復(fù)篩

以AS1.41菌株作為對照。將各活化菌株培養(yǎng)液按10%接種量接種于含體積分?jǐn)?shù)5%乙醇的GYd培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)5 d，測定產(chǎn)酸量。

1.3.6 醋酸菌耐受性試驗

1.3.6.1 乙醇耐受性

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為1.8%、3.6%、5.4%、7.2%、9%、10%、11%的GYd培養(yǎng)基中分別接入體積分?jǐn)?shù)10%的活化菌液，培養(yǎng)基裝液量均為100 mL/250 mL三角瓶，30 ℃、180 r/min搖瓶培養(yǎng)，每隔24 h測定OD600和產(chǎn)酸量，直至穩(wěn)定。

1.3.6.2 溫度耐受性

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%的GYd培養(yǎng)基中接入體積分?jǐn)?shù)10%的活化菌液，裝液量同上，180 r/min搖瓶培養(yǎng)，溫度分別設(shè)定為26、30、34、37、40、42 ℃，取樣測定同上。

1.3.6.3 乙酸耐受性

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%，乙酸體積分?jǐn)?shù)分別為0、1%、2%、3%、4%、5%的GYd培養(yǎng)基中接入體積分?jǐn)?shù)10%的活化菌液，裝液量、培養(yǎng)條件和取樣測定同1.3.6.1。

1.3.6.4 鹽耐受性

在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%，鹽質(zhì)量濃度分別為0、3.0、6.0、9.0、12.0、14.0、16.0、18.0 g/L的GYd培養(yǎng)基中接入體積分?jǐn)?shù)10%的活化菌液，裝液量、培養(yǎng)條件和取樣測定同1.3.6.3。

1.3.7 菌種鑒定

選擇產(chǎn)酸量和條件耐受性最優(yōu)的分離菌株進(jìn)行菌種鑒定?；蚪MDNA提取按參考文獻(xiàn)操作[14-15]。利用16S rDNA兩端引物和聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增目的菌株16S rRNA基因[16]，引物序列分別為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-TACGGCTACCTTGTTACG-ACTT-3′。DNA電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，然后對擴(kuò)增的16S rRNA基因進(jìn)行測序。最后將測序結(jié)果與GenBank中的已知序列進(jìn)行同源比對，判定細(xì)菌種類，將細(xì)菌劃分到屬或種[17]。利用MEGA 5.0軟件采用相鄰法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[18]。

1.3.8 指標(biāo)測定方法

菌體生物量用分光光度計測定波長600 nm處的光密度，用OD600值來表示菌體的生物量；產(chǎn)酸量測定參照GB/T 12456—2008食品中總酸的測定指示劑法。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酸醋酸菌的篩選與初步鑒定

2.1.1 醋酸菌的初篩

由圖1可知，在富集培養(yǎng)液稀釋度為10-5篩選平板上，有32個單菌落產(chǎn)生了透明圈。從中挑取3個透明圈直徑比明顯較大的單菌落，進(jìn)行劃線分離，最后從篩選分離平板上挑取單菌落進(jìn)行斜面保藏，編號分別為JM1、JM2、JM3。

圖1 菌株篩選平板Fig.1 Screening plate of strains

2.1.2 醋酸菌定性

由于固態(tài)醋醅中菌相較為復(fù)雜，僅從篩選特征和菌落形態(tài)難以確認(rèn)為符合要求的醋酸菌，因此對初篩菌株JM1、JM2、JM3進(jìn)行革蘭氏染色和產(chǎn)酸定性實驗，結(jié)果如表1所示。由表1可知，3個初篩菌株均為G-，均為醋酸產(chǎn)生菌。

表1 醋酸菌初步鑒定結(jié)果Table 1 Preliminary identification of acetic acid bacteria

注：-為陰性；+為陽性

2.1.3 高產(chǎn)酸醋酸菌的復(fù)篩

將所有試驗菌株分別接種于乙醇體積分?jǐn)?shù)為5%的GYd培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d，產(chǎn)酸結(jié)果如圖2所示。JM1、JM2、JM3、AS1.41產(chǎn)酸量分別為37.0、42.0、38.5、26.0 g/L。篩選菌株的產(chǎn)酸量均顯著高于AS1.41(P<0.05)。

圖2 各菌株發(fā)酵5 d的產(chǎn)酸量Fig.2 Acid-producing yield of the strains after fermented for 5 days

2.2 醋酸菌條件耐受性

2.2.1 乙醇耐受性

試驗菌株在乙醇體積分?jǐn)?shù)不同的發(fā)酵液中生長和產(chǎn)酸情況如圖3所示。所示由圖3可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)從1.8%增加至11%的過程中，各醋酸菌生物量均呈現(xiàn)下降趨勢，而產(chǎn)酸量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，表明試驗體積分?jǐn)?shù)的乙醇對各醋酸菌的生長均有一定程度的抑制作用，而一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇對產(chǎn)醋酸有利。乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%時，AS1.41產(chǎn)酸量最大，達(dá)到30.6 g/L；而JM1、JM2、JM3在乙醇體體積分?jǐn)?shù)為5.4%時產(chǎn)酸量均最大，其中JM2產(chǎn)酸量最高，可達(dá)49.8 g/L。在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3.6%～7.2%，JM1、JM2、JM3的產(chǎn)酸較強(qiáng)且穩(wěn)定。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增至10%以上時，所有試驗菌株生長和產(chǎn)酸均明顯受抑制，AS1.41甚至停止產(chǎn)酸，這與乙醇抑制細(xì)菌生長和代謝的作用有關(guān)[19-20]。比較可知，JM2具有相對較好的乙醇耐受性，產(chǎn)酸能力也明顯高于AS1.41。

A-菌體生物量；B-產(chǎn)酸量圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on bacterial biomass and acid production

2.2.2 溫度耐受性

溫度耐受性試驗結(jié)果如圖4所示。在26～37℃，所有試驗菌株生長和產(chǎn)酸均較穩(wěn)定，37～40 ℃時，生長和產(chǎn)酸均趨于停滯狀態(tài)。JM1、JM2、JM3最適培養(yǎng)和產(chǎn)酸溫度為30 ℃左右，且在26～37 ℃產(chǎn)酸能力均較強(qiáng)，其中JM2的產(chǎn)酸量最高，達(dá)38.9 g/L。AS1.41適宜的培養(yǎng)溫度為30～34 ℃，適宜的產(chǎn)酸溫度30～37 ℃，產(chǎn)酸達(dá)到32 g/L。在一定的培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，溫度上升會有利于醋酸菌的生長和代謝，而溫度過高會導(dǎo)致醋酸菌產(chǎn)酶能力降低，因此產(chǎn)酸下降[21]。綜合分析可知，JM2具有更好的溫度耐受性。

A-菌體生物量；B-產(chǎn)酸量圖4 溫度對菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.4 Effect of temperature on bacterial biomass and acid production

2.2.3 乙酸耐受性

試驗菌株的乙酸耐受性結(jié)果如圖5所示。乙酸對4株醋酸菌的生長均具有一定抑制作用，而體積分?jǐn)?shù)1%的乙酸似乎可以促進(jìn)醋酸菌的產(chǎn)酸，使JM1、JM2和AS 1.41的產(chǎn)酸量均達(dá)到最高，此時JM2的產(chǎn)酸量最高為40.5 g/L，而AS1.41產(chǎn)酸量為32.7 g/L；當(dāng)乙酸體積分?jǐn)?shù)增加至4%以上時，醋酸菌的生長和產(chǎn)酸均受到明顯抑制，因為過酸的環(huán)境會影響醋酸菌的生長[22]。過酸和堿性的環(huán)境都會導(dǎo)致相關(guān)酶活性的下降，從而影響醋酸菌的生長和產(chǎn)酸能力[23]。綜合分析，在相同乙酸濃度下，AS1.41的生長情況好于3株分離醋酸菌菌株，而JM2在乙酸為體積分?jǐn)?shù)為0%～2%的條件下，乙酸耐受性最強(qiáng)。

A-菌體生物量；B-產(chǎn)酸量圖5 乙酸體積分?jǐn)?shù)對菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.5 Effect of acetic acid volume fraction on bacterial biomass and acid production

2.2.4 鹽耐受性

由圖6可知，在鹽質(zhì)量濃度為0～16.0 g/L時，3個篩選菌株表現(xiàn)出較好的耐鹽性，其中JM2耐鹽能力最強(qiáng)。在低于質(zhì)量濃度為3.0 g/L的鹽溶液中，鹽對JM1、JM2、JM3的生長和產(chǎn)酸均沒有顯著影響，而AS1.41的產(chǎn)酸有明顯降低；當(dāng)鹽質(zhì)量濃度從3.0 g/L增至14.0 g/L，AS1.41的生長及產(chǎn)酸量呈現(xiàn)明顯下降的趨勢，并且在質(zhì)量濃度為14.0 g/L時，幾乎停止產(chǎn)酸；而當(dāng)鹽質(zhì)量濃度從3.0 g/L增至12.0 g/L，JM1、JM2、 JM3的生長及產(chǎn)酸量所受影響較小，當(dāng)鹽質(zhì)量濃度從12.0 g/L增至18.0 g/L，JM1、JM2、JM3生長和產(chǎn)酸量呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，其中JM2產(chǎn)酸量一直高于JM1和JM3。低鹽質(zhì)量濃度對醋酸菌生長影響較小，但隨著鹽質(zhì)量濃度的增加，醋酸菌的生長受到嚴(yán)重抑制，并且影響其產(chǎn)酸能力[24]。綜合分析，JM2的鹽耐受性最好。

A-菌體生物量；B-產(chǎn)酸量圖6 鹽濃度對菌體生物量和產(chǎn)酸量的影響Fig.6 Effect of salt concentration on bacterial biomass and acid production

對耐受性試驗結(jié)果進(jìn)行綜合分析可知，在各試驗條件下，AS1.41的生長適應(yīng)能力較強(qiáng)，而JM1、JM2、JM3的產(chǎn)酸能力卻明顯高于AS1.41。以滬釀1.01為對照菌株時，文獻(xiàn)報道也有類似規(guī)律發(fā)生[25]。最終試驗確定JM2產(chǎn)酸能力最強(qiáng)、條件耐受性最好，需要進(jìn)一步對JM2進(jìn)行菌種鑒定。

2.3 目的菌株的16S rDNA測序及系統(tǒng)發(fā)育分析

2.3.1 DNA的提取及其PCR擴(kuò)增

以JM2菌株的DNA為模板，采用特定的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖7所示，基因擴(kuò)增的產(chǎn)物大小約為1 500 bp，結(jié)合參考文獻(xiàn)[26]可知，實驗結(jié)果符合預(yù)期。

圖7 JM2醋酸菌的16S rDNA擴(kuò)增電泳圖Fig.7 Electrophoresis pattern of 16S rDNA amplification of acetic acid bacteria JM2

2.3.2 同源序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將JM2菌株的16S rDNA序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，結(jié)果表明菌株JM2與熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)的16S rDNA序列相似度達(dá)到100%，結(jié)合文獻(xiàn)[27]可以確認(rèn)JM2為熱帶醋酸菌。然后采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖8所示。

圖8 采用NJ法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining method

由圖8可知，菌種JM2顯示與熱帶醋酸桿菌(AcetobactertropicalisSCMA19)具有最親近的關(guān)系。結(jié)合16S rDNA序列同源性和系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，確定JM2菌株為熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)。

3 結(jié)論

陜西民間有釀醋的傳統(tǒng)，有豐富的醋醅資源，因此陜西民間醋醅是優(yōu)良醋酸菌菌種的寶庫。本研究從新鮮的陜西民間醋醅中篩選到3株醋酸菌JM1、JM2、JM3，與AS1.41進(jìn)行產(chǎn)酸和條件耐受性比較，發(fā)現(xiàn)JM2的條件耐受性和產(chǎn)酸能力相對較強(qiáng)，在其他條件適宜的情況下，可耐受的乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙酸體積分?jǐn)?shù)、鹽質(zhì)量濃度分別為9%、3%和16.0 g/L，在26～37 ℃具有較強(qiáng)而穩(wěn)定的產(chǎn)酸能力。經(jīng)16S rDNA基因測序和分析，確定JM2為熱帶醋酸桿菌(Acetobactertropicalis)。JM2是1株高產(chǎn)酸且耐受性較好的醋酸菌，具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。