鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6通過影響腸道內短鏈脂肪酸的水平緩解小鼠由葡聚糖硫酸鈉導致的結腸炎

鄭雨星，朱慧越，焦婷，楊樹榮，劉倩，王剛，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種易復發(fā)的胃腸道炎癥性疾病，目前其發(fā)病機制尚不清楚，研究顯示主要與遺傳因素，腸道屏障，免疫紊亂，腸道菌群以及環(huán)境因素有關[1]。IBD患者的腸道屏障受到破壞，主要表現為腸道黏液層變薄甚至消失；腸道緊密連接結構損傷，腸道上皮組織(包括腸上皮細胞，杯狀細胞，神經內分泌細胞，潘氏細胞和M細胞)破壞；腸道固有層免疫細胞異常應答并產生大量促炎癥細胞因子，導致腸黏膜炎癥反應[1-3]。IBD患者的臨床表現主要是腹痛、腹瀉、便血和體重下降。目前常用的IBD治療藥物作用比較局限，且副作用較多[2]。

腸道菌群與宿主共同進化形成復雜的互利共生關系，參與宿主許多的生理功能[3]。腸道穩(wěn)態(tài)的破壞與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，包括炎癥性腸病，抑郁癥，糖尿病等[3-5]。研究顯示，與健康人相比，IBD 患者腸道菌群的穩(wěn)定性降低，表現為腸道菌群多樣性和豐富度降低以及腸道菌群組成和結構改變[3]。GOPHNA等[6]發(fā)現克羅恩病患者腸道中變形菌門和擬桿菌門數量顯著增加，梭狀芽孢桿菌豐度降低。研究顯示，IBD患者的糞便樣品中丁酸產生菌的數量顯著減少，炎癥反應相關的菌群數量增加[7-8]。此外，腸道菌群對于IBD的影響還體現在參與宿主的代謝，ZELANTE等[9]發(fā)現腸道菌群參與宿主色氨酸代謝生成芳香烴受體激活配體并影響DSS誘導結腸炎小鼠的恢復。

短鏈脂肪酸(short chain fatty acids, SCFAs)是腸道菌群發(fā)酵膳食纖維產生的代謝產物，主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸。研究顯示乙酸，丙酸和丁酸具有增強腸道屏障功能，改善腸黏膜損傷的作用，主要途徑包括通過識別腸上皮細胞膜受體GPR41、GPR43等激活下游的信號通路,增加Treg細胞增殖，抑制Th1細胞和Th17細胞分化，降低炎癥因子水平[10];激活核受體PPARγ, 抑制NF-κB信號通路, 減少促炎因子表達；通過激活轉錄因子(包括STAT3和SP1等)[11]誘導編碼緊密連接相關組件的基因促進緊密連接蛋白表達, 保持腸上皮完整；丁酸作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑, 能夠抑制炎癥基因表達, 增加抗菌肽分泌從而減少黏膜炎癥[12]。

鼠李糖乳桿菌作為益生菌的一種，安全性高且具有多種健康功能而被廣泛應用于食品生產。已有大量的研究報道鼠李糖乳桿菌在緩解結腸炎上的益處[13-14]。本文選取了來自于2個不同地區(qū)(浙江臺州，內蒙古二連浩特)，全基因組比對分析后處于進化樹不同分支上親緣關系較遠的2株鼠李糖乳桿菌，探究其對于DSS誘導的小鼠結腸炎的緩解效果及作用機制，以期為進一步探究鼠李糖乳桿菌緩解結腸炎的研究打下基礎，為有益于健康的益生菌產品開發(fā)利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6、FNMGEL5-1，均來源于江南大學食品生物技術中心菌種保藏庫。其中，菌株FZJTZ46L6，分離自浙江臺州人群糞便樣本，菌株FNMGEL5-1，分離自內蒙古二連浩特人群糞便樣本。

1.2 試劑與儀器

葡聚糖硫酸鈉,美國MP Biomedicals；美沙拉嗪緩釋顆粒，上海愛的發(fā)制藥有限公司；糞便隱血試劑盒，珠海貝索生物技術有限公司；髓過氧化物酶檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所；TNF-α，IL-1β，IL-6，IFN-γ酶聯免疫試劑盒，美國R&D Systems公司； HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit，康為世紀生物科技有限公司；PCR 擴增引物以及合成序列，上海生工生物工程有限公司; 糞便DNA快速提取試劑盒，美國MP biomedicals有限公司；膠回收試劑盒，倍沃醫(yī)學科技有限公司。

HWS-80隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；GCMS-QP2010單四級桿氣相色譜質譜聯用儀，島津公司；CFX ConnectTMReal-time System實時熒光定量基因擴增儀，伯樂公司；Pannoramic MIDI 數字切片掃描儀，匈牙利3DHistech；Illumina miseq pe300高通量測序儀，Illumina公司。

1.3 菌株活化和培養(yǎng)

用接種環(huán)蘸取少量鼠李糖乳桿菌凍存菌液,在MRS固體平板上劃線并置于37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)48 h。挑取單菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)15 h，接著以2%體積分數接種量擴增培養(yǎng)18 h后，以5 000 r/min轉速在4 ℃下離心 5 min收集菌體，用無菌的 PBS 洗 3 次后用300 g/L蔗糖溶液重懸菌體凍存于-80 ℃。

1.4 動物試驗設計

實驗動物為4周齡SPF級健康雄性C57BL/6J 小鼠，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物倫理審查編號為JN.No20190430c0900605[101]，飼養(yǎng)于(23±2)℃，相對濕度(50±10)%，12 h光照12 h黑夜交替的屏障環(huán)境內。30只小鼠隨機分為空白組、模型組、藥物組、鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6，鼠李糖乳桿菌FNMGEL5-1共5組，每組6只。適應飼養(yǎng)1周，適應期內所有組均給予正常飲水與飼料。從第2周開始，空白組、模型組每日灌胃30 g/L蔗糖溶液0.2 mL，藥物組每日灌胃含美沙拉嗪(給藥劑量300 mg/kg)的30g/L蔗糖溶液0.2 mL，實驗組每日灌胃1×109CFU鼠李糖乳桿菌的3%蔗糖溶液0.2 mL，持續(xù)27 d。第29天，在小鼠飲水中添加 25 g/L DSS，連續(xù)飼喂7 d誘導小鼠急性結腸炎。動物試驗設計如表1所示。

表1 動物實驗設計方案Table 1 Animal experimental design

1.5 試驗指標測定

1.5.1 體重變化和疾病活動指數計算

造模期間，每天定時稱量小鼠體重并計算其變化的百分比。此外，每日觀察小鼠的糞便性狀，根據BERBERAT等[15]的方將其分為3個等級： 第一， 正常小鼠的糞便成型， 且為顆粒狀； 第二，糞便黏度增加且易散，但不黏附于肛門則為“松散”；第三，糞便呈稀水樣或不成形且黏附于肛門，即為“稀便”。同時，使用匹拉米洞法測定小鼠糞便隱血情況，若小鼠糞便含有肉眼可見的紅褐色或鮮紅色血液，則判定為肉眼便血。最后，根據 BERBERAT等[15]的評分標準，計算得出小鼠的疾病活動指數(disease activity index，DAI)，具體評分項目得分如表2所示。

表2 動物疾病活動指數評分系統(tǒng)Table 2 Scoring standard of the disease activity index

1.5.2 結腸HE染色及組織損傷評分

小鼠結腸石蠟切片和HE染色參考王俊通[7]的方法。使用Pannoramic MIDI 數字切片掃描儀對HE染色切片進行掃描拍照，所得照片從腸黏膜上皮病變、腸隱窩損害、炎癥浸潤和纖維組織增生4個方面進行組織損傷評分。

1.5.3 結腸組織髓過氧化物酶活性測定

按照MPO試劑盒說明書測定小鼠結腸中的髓過氧化物酶活性。

1.5.4 小鼠結腸中細胞因子含量測定

根據ELISA試劑盒說明書測定小鼠結腸組織中的細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量。

1.5.5 RT-QPCR測定結腸緊密連接相關蛋白基因表達水平

在PrimerBank上查找得到小鼠4種緊密連接相關蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin和GAPDH基因的引物序列，由上海生工有限公司合成引物，序列如表3所示。

根據王俊通[7]的方法提取小鼠結腸RNA，按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA并進行熒光定量PCR實驗。QPCR的反應體系為5 μL SYBR Green Supermix，3 μL去離子水，0.5 μL上游引物(10 μmol/L)，0.5 μL下游引物(10 μmol/L)和1 μL的cDNA模板(100 ng/μL)。QPCR運行程序設定為94 ℃,2 min，(94 ℃，30 s；61 ℃，30 s；72 ℃,20 s)39個循環(huán)。確保擴增產物溶解曲線為單峰，且CT值均在可信范圍之內，陰性對照NTC無擴增。

表3 引物序列Table 3 Primer sequence

1.5.6 小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量測定

根據毛丙永[16]的方法利用島津單四級桿氣質聯用儀測定小鼠凍干糞便中的短鏈脂肪酸含量。

1.5.7 小鼠腸道16S rDNA宏基因組測序

收集小鼠解剖前1天的糞便，用DNA快速提取試劑盒按說明書方法步驟提取糞便中的DNA，參照文獻[17]的研究方法對樣本16S rDNA的V3～V4區(qū)進行PCR擴增，用膠回收試劑盒對擴增片段進行純化回收，在Illumina miseq pe300平臺進行高通量測序，采用 QIIME2分析平臺對擴增子進行分析。

1.6 數據統(tǒng)計方法

數據表示為“平均值±標準差”(Means±S.D.)，使用 GraphPad Prism 5繪圖。應用 SPSS 軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)或者 t 檢驗(student’s t-tests)分析進行差異顯著性檢驗，采用pearson方法進行相關性分析，PCA分析在網站https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/home.xhtml完成。LEfSe分析在網站http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/完成。

2 結果與分析

2.1 鼠李糖乳桿菌改善結腸炎小鼠腸道黏膜損傷

本文采用DSS誘導小鼠結腸炎并通過測定造模期間小鼠的體重變化，疾病活動指數，小鼠結腸病理評分以及小鼠結腸髓過氧化物酶活性來評估2株鼠李糖乳桿菌對于小鼠腸道損傷的改善作用。造模期間，模型組小鼠出現明顯的便血，糞便松散并從第5天開始體重顯著下降(圖1)。與模型組相比，鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6和FNMGEL5-1均能顯著減少DSS引起的體重下降并改善糞便性狀，降低DAI值，且效果優(yōu)于300 mg/kg的藥物美沙拉嗪(圖1，表4)。

通過HE染色對小鼠結腸病理進行觀察并評分，由圖2可知空白組小鼠結腸形態(tài)良好，腸上皮完整，隱窩結構完整，排列有序且含有大量的杯狀細胞，沒有發(fā)現炎癥細胞浸潤；模型組小鼠結腸可見大量黏膜上皮細胞變性、壞死，杯狀細胞數量明顯減少和腸隱窩損傷，炎細胞浸潤及纖維組織增生等病理變化，其結腸組織損傷評分顯著高于空白對照組；鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6能夠顯著減少上述組織病變，除極個別隱窩結構損壞，其結腸結構與正常組相似，組織損傷評分顯著低于模型組；陽性對照藥物美沙拉嗪也較好地保護了結腸組織結構，但仍可見部分上皮結構和隱窩結構損壞以及炎癥浸潤。而鼠李糖乳桿菌FNMGEL5-1對結腸黏膜病理損傷沒有顯著改善效果，可見與模型組類似程度的隱窩結構破壞和炎癥侵潤。

圖1 DSS造模期間小鼠體重變化Fig.1 Changes of mice body weight during DSS treatment注： *表示P < 0.05(下同)

髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)富含于中性粒細胞和單核細胞中，在受到外界刺激時，中性粒細胞嗜天青顆粒釋放MPO并造成炎癥損傷[18]。腸道炎癥反應是結腸炎的病理基礎，而中性粒細胞和單核細胞的吞噬作用是炎癥反應的中心環(huán)節(jié)[19]。故MPO活性可作為以中性粒細胞為主的炎癥浸潤指標并作為評價結腸炎炎癥嚴重程度的指標[19-20]。由圖3可知，造模組的MPO值顯著高于空白組，而鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6組的MPO值幾乎回到了正常水平，表明菌株FZJTZ46L6能夠顯著減輕結腸炎癥浸潤。而藥物干預和菌株FNMGEL5-1均不能抑制DSS引起的MPO升高，可見美沙拉嗪和FNMGEL5-1不能減輕結腸炎癥細胞浸潤。該結果與病理結果相一致，表明鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6可以通過減少中性粒細胞的數量，減輕炎癥反應，實現對小鼠結腸炎的緩解作用。

表4 小鼠造模期間疾病活動指數Table 4 Disease activity index during DSS treatment

注：表中同一列標注相同小寫字母表示不同組間無顯著差異，否則具有顯著差異(P<0.05)(下同)

a-空白組；b-藥物組；c-模型組；d-FZJTZ46L6；e-FNMGEL5-1；f-結腸病歷組織評價圖2 小鼠結腸HE染色和組織損傷評分Fig.2 HE staining and histological score of mice colon注：柱形圖中標注相同字母表示不同組間無顯著差異，否則具有顯著差異(P<0.05)(下同)

圖3 小鼠結腸MPO值Fig.3 MPO activity of mice colon

2.2 鼠李糖乳桿菌降低小鼠結腸中促炎細胞因子含量

大量研究表明，結腸中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ等細胞因子的含量與結腸炎的發(fā)生發(fā)展密切相關[14, 21-27]。本文測定了小鼠結腸中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量，結果顯示，與對照組相比模型組小鼠結腸中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ含量顯著增高,尤其是TNF-α和IL-6的水平顯著增高；與模型組相比，鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6和FNMGEL5-1顯著降低了結腸中TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量，且效果優(yōu)于藥物美沙拉嗪(圖4)。研究顯示，TNF-α與結腸炎的嚴重程度呈正相關，且IBD患者的IL-6含量可見顯著增高[21-23]，這與本文的研究結果一致。說明DSS造模后小鼠體內促炎因子含量顯著上升，鼠李糖乳桿菌能夠通過降低結腸中的促炎因子含量減少結腸炎癥反應的產生。

a-小鼠結腸組織TNF-α含量;b-小鼠結腸組織IL-1β含量;c-小鼠結腸組織IL-6含量;d-小鼠結腸組織IFN-γ含量圖4 小鼠結腸細胞因子含量Fig.4 Content of cytokines in mice colon

2.3 鼠李糖乳桿菌提高結腸緊密連接蛋白基因轉錄水平

腸道上皮細胞間的緊密連接相關蛋白在維持腸上皮結構穩(wěn)定，發(fā)揮腸道屏障功能中起到重要的作用[28-30]。本文測定了小鼠結腸中4種主要緊密連接蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin的基因表達水平。結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠4種緊密連接蛋白轉錄水平均發(fā)生了顯著下調，提示DSS造成了腸上皮緊密連接結構的破壞，而本文所用的2株鼠李糖乳桿菌均能在一定程度上提高結腸緊密連接蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin的轉錄水平(圖5)，提示鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6和FNMGEL5-1可能通過上調緊密連接蛋白Claudin-3、ZO-1、ZO-2和Occludin的表達，從而增強腸道緊密連接，提高腸道屏障功能。

2.4 鼠李糖乳桿菌提高小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量

短鏈脂肪酸是腸道菌群的代謝產物，能夠為結腸細胞提供能量，調節(jié)腸腔內的pH值，參與宿主免疫調節(jié)并增強腸道屏障作用[24]。研究顯示，IBD患者中短鏈脂肪酸含量顯著減少[25]，施用短鏈脂肪酸合成酶混合物顯著改善結腸炎癥和疾病活動指數得分并抑制促炎癥細胞因子的表達。在本文中，與空白組相比，模型組小鼠糞便中短鏈脂肪酸總量顯著減少，尤其是丁酸含量顯著減少；與模型組相比，菌株FZJTZ46L6顯著提高了小鼠糞便中短鏈脂肪酸的含量，包括乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸和戊酸；而菌株FNMGEL5-1雖然能在一定程度上提高小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量，但是沒有顯著差異(表5)。該結果與病理結果基本一致，提示FZJTZ46L6對于小鼠結腸損傷的改善作用與其提高短鏈脂肪酸含量密切相關。

圖5 小鼠結腸緊密連接蛋白基因相對轉錄水平Fig.5 mRNA transcription levels of tight junction proteins in mice colon注：**表示P < 0.01

表5 小鼠糞便中短鏈脂肪酸含量 單位：pmol/mg

2.5 鼠李糖乳桿菌調節(jié)小鼠腸道菌群

大量研究顯示IBD患者腸道菌群表現為多樣性降低，菌群組成和結構發(fā)生變化，從而導致腸道菌群穩(wěn)態(tài)受到破壞[21,26-27]。在本研究中，與空白組相比，模型組小鼠Shannon指數顯著降低，說明DSS結腸炎小鼠腸道菌群多樣性顯著降低。FZJTZ46L6和FNMGEL5-1顯著抑制了DSS引起的Shannon指數降低，提高群落多樣性(圖6)。此外，beta多樣性分析顯示，DSS造模后小鼠腸道菌群群落構成與空白組形成明顯差異，而FZJTZ46L6和FNMGEL5-1均能在一定程度上減少這種差異(圖7)從而維護腸道菌群結構的穩(wěn)定性。腸道菌群主要由厚壁菌門，擬桿菌門，放線菌門和變形菌門四大類組成[28]，如圖8-a所示，DSS結腸炎小鼠的腸道菌群組成發(fā)生了顯著變化。與空白組相比，模型組小鼠中的厚壁菌門(Firmicutes)豐度顯著降低，而擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度顯著升高，即厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)的比值下降(圖8-b)，而F/B比率被作為評估病理狀態(tài)的生物標志物[28]。Bacteroidetes擁有的參與脂類和碳水化合物代謝的酶基因比Firmicutes要少[29]，因此這也可能是造成小鼠體重下降的原因。此外，DSS造模后引起了變形菌門(Proteobacteria)豐度的顯著上升(圖8-b)，表明DSS處理造成了小鼠腸道菌群結構失調。據報道，Proteobacteria等革蘭氏陰性菌的LPS與宿主炎癥有關[8]。鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6和FNMGEL5-1干預后在一定程度上降低了擬桿菌門的豐度并增加厚壁菌門的豐度，從而減輕厚壁菌門/擬桿菌門的比例失調，改善菌群結構失衡。

圖6 腸道菌群α多樣性分析Fig.6 α diversity of gut microbiota

圖7 腸道菌群beta多樣性分析Fig.7 Beta-diversity of gut microbiota

進一步對腸道菌群進行分析，利用LEfSe分析找到不同分組間豐度顯著差異的物種，進化樹分支圖(圖9)顯示了在不同分組間具有重要影響的標記物種，找出其中具有顯著差異的菌屬進一步分析，結果顯示DSS造模后除了顯著增加Bacteroides(擬桿菌屬)豐度外，還提高了與炎癥反應相關的菌屬Fusobacterium豐度，而Coprococcus(糞球菌屬)和Oscillospira(顫螺菌屬)豐度顯著降低，其中Coprococcus是丁酸和丙酸的主要產生菌屬，Oscillospira與健康相關，并在炎癥人群腸道內豐度減少。與模型組相比，FZJTZ46L6和FNMGEL5-1干預后提高了Coprococcus和Oscillospira的豐度。值得注意的是FNMGEL5-1顯著提高了Dorea和Mucispirillum的豐度(圖10)。研究顯示[30]，Dorea在DSS結腸炎小鼠中豐度顯著增加，而Mucispirillum是一種黏液層共生菌，在宿主產生炎癥時Mucispirillum數量增加，并在一定條件下誘導免疫系統(tǒng)產生IgG反應，故被認為是導致疾病產生的病原體[10]?？梢奆NMGEL5-1雖然提高了腸道菌群的多樣性并減輕腸道菌群失調，但是顯著增加了有害菌屬Dorea和Mucispirillum的豐度，這很可能是其無法改善結腸黏膜損傷的原因之一。上述結果表明，DSS處理后使腸道中有害菌的數量增加，同時減少有益菌的數量，而鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6干預后緩解了這種情況。

a-門水平群落結構分析;b-Bacteroidetes差異性分析；c-Proteobacteria差異性分析；d-Acidobacteria差異性分析；e-Firmicutes差異性分析圖8 鼠李糖乳桿菌對小鼠腸道菌群門水平的影響Fig.8 Effects of Lactobacillus rhamnosus on the Phylum level of microbiota in mice

圖9 LEFSE分析Fig.9 LEFSE analysis

a-Adlercreutzia;b-Bacterodes;c-Bifiobacterium;d-Coprococcus;e-Dorea;f-Fusobaterium;g-mucispirillum;h-Oscillospira;i-Strptococcus圖10 腸道菌群屬水平差異性分析Fig.10 Genus-level changes in the faecal microbiota

2.6 糞球菌屬和短鏈脂肪酸緩解結腸炎的相關性分析

乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽能夠經由轉運受體MCT1, SMCT1等被結腸細胞吸收并通過細胞表面G蛋白偶聯受體參與一系列免疫級聯反應中，降低促炎因子TNF-α、IL-6，IL-12、IFN-γ的產生，增加抑炎因子IL-10水平，從而減少炎癥反應，維護腸道屏障功能[28]。此外，研究顯示[8, 10, 29-30]，IBD患者腸道中Coprococcus數量顯著減少。說明鼠李糖乳桿菌FZJTZ-46L6對于結腸炎的緩解作用可能主要是通過影響腸道短鏈脂肪酸產生菌的豐度并增加腸道短鏈脂肪酸的產量。為進一步確定產短鏈脂肪酸菌屬Coprococcus和短鏈脂肪酸在FZJTZ46L6緩解結腸炎中的重要作用，本文利用SPSS做了pearson相關性分析。結果顯示，Coprococcus與小鼠體重呈極顯著的正相關且與DAI評分呈極顯著的負相關，此外，Coprococcus與結腸病理評分、TNF-α以及IL-6的含量也呈強相關性，說明鼠李糖乳桿菌對于Coprococcus豐度的影響與其緩解結腸炎疾病癥狀，改善結腸黏膜損傷和調節(jié)腸道免疫反應密切相關。丁酸與結腸IL-6含量呈顯著負相關，且與結腸炎各項疾病指標都有強相關性；乙酸和丙酸均與促炎因子IL-1β、IFN-γ呈顯著負相關，此外丙酸與緊密連接蛋白Claudin-3表達水平呈顯著正相關；值得注意的是，整體上6種短鏈脂肪酸與結腸促炎因子含量表現出明顯的負相關性，與結腸緊密連接相關蛋白基因表達水平呈明顯正相關，說明短鏈脂肪酸與鼠李糖乳桿菌修復腸道緊密連接和降低促炎因子水平密切相關。綜上，鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6極可能是通過提高腸道短鏈脂肪酸產生菌的豐度并增加腸道短鏈脂肪酸的含量從而抑制促炎因子產生，上調緊密連接蛋白表達水平達到緩解結腸炎的效果。

表5 糞球菌屬和短鏈脂肪酸與結腸炎疾病指標的相關性分析Table 5 Correlation analysis of coprococcus and scfas with disease indexes of colitis

注：*表示P< 0.05,**表示P<0.01

3 結論

本文使用的2株鼠李糖乳桿菌均能在不同程度上緩解小鼠結腸炎，但2株菌對于結腸炎的緩解效果具有明顯差異。鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6的效果優(yōu)于FNMGEL5-1，FZJTZ46L6不僅顯著抑制了小鼠在DSS造模期間的體重下降，改善糞便性狀和便血情況，還顯著改善了DSS引起的小鼠結腸黏膜損傷，而FNMGEL5-1雖然在一定程度上緩解了DSS引起的疾病癥狀，但是對于結腸炎癥浸潤和病理損傷沒有改善作用。本研究中，鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6緩解結腸炎的途徑主要體現在以下4個方面：(1)提高腸道菌群多樣性，增加菌群結構穩(wěn)定性；(2)提升短鏈脂肪酸產生菌屬豐度，提高短鏈脂肪酸水平；(3)增強腸道緊密連接蛋白轉錄水平；(4)降低促炎因子水平，減少炎癥反應。相比于FNMGEL5-1，菌株FZJTZ46L6能夠更大程度地降低促炎因子IL-1β、IL-6和IFN-γ的含量，且顯著增加糞便中短鏈脂肪酸含量，尤其是乙酸、丙酸和丁酸的含量；而FNMGEL5-1雖然也提高了短鏈脂肪酸產生菌Coprococcus的豐度，并在一定程度上增加糞便中總的短鏈脂肪酸含量，但是并不能顯著提高乙酸，丙酸和丁酸的含量，此外FNMGEL5-1還增加了有害菌屬Dorea和Mucispirillum的豐度。通過進一步的相關性分析，結果顯示Coprococcus與改善結腸損傷，緩解結腸炎癥狀以及降低促炎因子水平顯著相關；短鏈脂肪酸水平的提高與促炎因子含量的降低及緊密連接蛋白轉錄水平的增加強相關，表明Coprococcus和短鏈脂肪酸在緩解結腸炎中的重要作用?？梢奆ZJTZ46L6與FNMGEL5-1對于小鼠結腸炎的緩解效果差異主要與腸道菌群變化、短鏈脂肪酸含量和免疫調節(jié)相關，且最關鍵的是能否通過提高短鏈脂肪酸產生菌屬豐度進一步提高腸道內短鏈脂肪酸含量。綜上所述，說明鼠李糖乳桿菌緩解結腸炎的效果存在個體差異，且鼠李糖乳桿菌FZJTZ46L6對于結腸炎的改善效果主要與其提高腸道短鏈脂肪酸產生菌豐度，增加短鏈脂肪酸含量有關。