河南豫北地區(qū)196例成人急性髓系白血病臨床病理特征分析

楊 翠，李敬東，字友梅，高攀科，韓效林

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科，河南 衛(wèi)輝 453100)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是一種造血干/祖細胞的異質性惡性克隆性疾病，是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤。白血病的形成是一個復雜、多步驟的過程，基因組異常在AML的發(fā)生中發(fā)揮著至關重要的作用，這種異常包括染色體異位、基因突變等，其可形成具有腫瘤特征的融合基因參與AML的發(fā)生、發(fā)展、診斷及預后[1]。目前這種基因組學可用于AML的診斷、分型、療效監(jiān)測和預后評估等。因此，本研究通過回顧性分析，收集本院196例初診原發(fā)AML患者的臨床資料，細胞形態(tài)學、免疫組織化學，免疫分型，融合基因及5種常見基因突變[FMS樣酪氨酸激酶3-內(nèi)部串聯(lián)重復(fms-like tyrosine kinase 3-internal tandem duplication, FLT3-ITD)、脫氧核糖核酸甲基轉移酶3A(deoxyribonucleic acid methytransferase 3A, DNMT3A)、核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin gene 1,NPM1)、CCAAT/增強結合蛋白A(CCAAT/enhancer binding protein A,CEBPA)、C-KIT基因突變]，旨在探討河南豫北地區(qū)AML患者的臨床病理特征。

1 資料與方法

1.1 臨床資料入組我院2013年1月至2018年12月收治的臨床資料完整的初診原發(fā)AML患者為研究對象，均經(jīng)骨髓細胞形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學、分子生物學等檢查證實符合AML的診斷標準[2]。排除標準：排除骨髓增生異常綜合征、骨髓增殖性腫瘤、慢性粒細胞白血病等轉變的AML。共篩選出符合條件的患者196例，均為河南豫北地區(qū)戶籍，入住我院前未接受任何抗白血病治療。196例患者中，男109例、女87例，初診年齡18～85歲，根據(jù)患者年齡分為老年組(≥60歲，75例)、青年組(<60歲，121例)。

1.2 主要試劑和儀器Trizol購自美國Gibcol-BRL公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國HyClone公司，胎牛血清購自北京賽奧吉諾生物科技有限公司，PTC-200聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)儀、371型二氧化碳細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，CK40型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，F(xiàn)ACS Calibur型流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 骨髓細胞形態(tài)學檢查取患者骨髓液制作成涂片，干燥后進行瑞氏染色和組織化學染色，并于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.4 免疫學檢查抽取患者骨髓液2 mL，經(jīng)肝素抗凝后，制備成單個核細胞的細胞懸液，通過熒光標記的單克隆抗體和流式細胞儀檢測分析白血病細胞的表面抗原，陽性細胞數(shù)以幼稚細胞抗原在細胞總數(shù)中的表達比例表示；陽性表達定義為細胞質在細胞總數(shù)中的表達百分比≥10%，細胞膜抗原表達百分比≥20%，比對抗原表達陽性率進行計算[3]。

1.5 融合基因檢測抽取患者骨髓液2～3 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀抗凝后，Trizol提取有核細胞RNA，通過多巢式PCR檢測AML的43種融合基因，分別為：NUP98-HoxD13、NPM-ALK、TCF3-HLF、ETV6/PDGFRA、FLP1L1-RARa、STAT5b-RARa、BCR-ABL1、PML-RARa、AML1-ETO、NUP98-HoxC11、NUP98-HoxA13、NUP98-HoxA11、TEL-JAK2、CBFβ-MYH11、PLZF-RARa、FLP1L1-PDGFRA、DEK-CAN、AML1-MDS1/EV11、AML1-MTG16、E2A-PBX1、NPM-MLF、MLL-AF9、MLL-AF10、NUMA1-RARa、PRKAR1A-RARa、NUP98-PMX1、MLL-AFX、MLL-ENL、MLL-AF17、MLL-AF1p、MLL-AF1q、MLL-ELL、MTT-SEPT6、MLL-AF6、MLL-AF4、NPM-RARa、SIL-TAL1、SET-CAN、TEL-AML1、TEL-PDGFRB、TLS-ERG、TEL-ABL1、NUP98-HoxA9。

1.6 基因突變檢測抽取患者骨髓液2～3 mL，經(jīng)乙二胺四乙酸二鉀抗凝后，送檢鄭州金域檢驗公司，通過一代或二代基因測序的方法檢測DNMT3、FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、C-KIT等5種常見AML突變基因。

2 結果

2.1 2組外周血指標及骨髓原始細胞比例的比較老年組患者外周血紅細胞、血紅蛋白及血小板水平均較青年組患者顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)；2組患者外周血白細胞和骨髓原始細胞比例比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>005)。見表1。

表1 2組外周血指標及骨髓原始細胞比例的比較

2.2 2組免疫分型結果比較FAB分型顯示：老年組患者以M2型為主，青年組患者以M3型為主，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 2組免疫分型結果比較 n(%)

2.3 2組融合基因分析結果比較196例患者中共有72例檢測出融合基因，檢出率為36.7%，未檢測到攜帶≥2種融合基因者，檢出的融合基因分別為AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11、BCR-ABL1、MLL-AF9、NUP98-HoxA9。2組患者各種融合基因檢測結果比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表3。

2.4 2組基因突變分析結果比較196例患者5種基因突變總檢出率為37.2%。老年組患者DNMT3A突變發(fā)生率高于青年組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；2組患者FLT3-ITD、NPM1、CEBPA、C-KIT突變率比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表4。

2.5 2組基因突變數(shù)目分析結果比較老年組患者發(fā)生2種及以上基因突變的比例高于青年組患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2組患者發(fā)生1種基因突變的比例比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 2組基因突變數(shù)目分析結果比較 n(%)

3 討論

AML是血液系統(tǒng)高發(fā)的惡性腫瘤之一，AML的發(fā)病中位年齡大于60歲，且隨著年齡的增長，治療效果逐漸下降。隨著中國老齡化社會的到來，AML的發(fā)病率逐漸增加，同時老年AML亦會逐年增加[4]。老年AML國際標準定義為≥60歲，因此本文根據(jù)患者年齡分為老年組(≥60歲)和青年組(<60歲)。

AML的診斷方式，自20世紀以來已經(jīng)從依靠形態(tài)學、組織化學這種單一的診斷模式，發(fā)展為形態(tài)學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學等多種診斷技術的精準診斷。診斷技術的發(fā)展使得人們對AML的腫瘤細胞生物學特性更加了解，從而衍生出不同的靶向治療。靶向藥物的治療可提高AML的治療效果，但因為體質差、并發(fā)癥多、化療耐受性差、具有獨特的不良反應等眾多因素的影響[5]，使得老年AML患者從靶向藥物的治療中獲益低于年輕患者。綜合來說，即為腫瘤的生物學特性、治療的耐受性和老年的病理生理特征影響了其治療效果。已有學者[6]報道不同年齡AML患者具有不同的分子生物學特性，且AML患者的分子生物學特征不同的研究小組報道存在地域差異。因此本文根據(jù)河南豫北地區(qū)的經(jīng)濟情況、機體生理狀態(tài)等，分析豫北地區(qū)≥60歲和<60歲的AML患者的一般特征及常見的生物學特性，希望總結本地區(qū)的AML不同年齡組患者的疾病特征，為今后AML患者的治療提供參考。本研究結果顯示：老年組AML患者紅細胞減少、血紅蛋白下降和血小板減少的發(fā)生率均高于青年組，而2組患者白細胞計數(shù)和骨髓原始細胞比例相近。從FAB分型方面分析，老年AML以M2型高發(fā)，青年AML以M3型高發(fā)。

目前已有多種分子生物學標記用于疾病的診斷、分型及預后的評估。2016版WHO的AML診斷分型強調(diào)了遺傳學信息異常在急性白血病診斷中的價值，部分伴重現(xiàn)性遺傳學異常AML成為了獨立的分類。這種細胞遺傳學的改變與形態(tài)學特征的關系尚不明確，少數(shù)異?；蛟谔囟ǖ腁ML中檢出率較高，可以用于診斷某些特殊類型的AML。PML-RARAα融合基因由t(15；17)(q22;q21)染色體易位形成，主要見于AML-M3，陽性率超過80%。AML1-ETO融合基因t(8；21)(q22;q22)染色體易位形成，其陽性多見于AML-M2，劉恒[7]報道其陽性率為17.4%，高于國外學者的研究，但其在M2b型的陽性率高達90%，因此其是M2b分型診斷重要的分子標志。還有一部分融合基因在多種疾病中可以檢測到，在AML中檢出率較低，但多與AML的預后密切相關，提示預后欠佳，如BCR-ABL1融合基因由t(9；22)(q34;q11)染色體易位形成，多見于急性淋巴細胞白血病，少數(shù)可見于AML[8]；NUP98-HoxA9融合基因是由t(7;11)(p15; p15)染色體易位形成，Hox基因可促進髓系的增殖，目前認為與AML形成密切相關[9]；MLL-AF9融合基因是t( 9; 11) ( p22; q23)易位形成，是MLL融合基因最常見的一種易位形成，多見于AML-M4、AML-M5[10]。本文研究了AML常見的43種融合基因，總體檢出率為36.7%，比國內(nèi)王鈺等[11]報道的檢出率35.9% 略高；檢出的融合基因分別為AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11、BCR-ABL1、MLL-AF9、NUP98-HoxA9，2個年齡段患者6種融合基因的檢出率相近。

新一代測序技術為AML個體化診斷和治療開辟了新的視野[12]。在過去的5～10 a中，新一代測序技術已被廣泛引入專業(yè)的血液學實驗室。在AML患者中已檢測到越來越多的基因突變，這些突變可作為潛在的標志物，可發(fā)展為AML的預后參數(shù)、靶向治療的選擇依據(jù)，并幫助我們探索新的潛在治療途徑或耐藥機制。Yu等[13]報道了老年和年輕AML患者新一代測序技術分析，結果發(fā)現(xiàn)，老年患者的診斷時分子基因突變的頻率顯著高于年輕患者；老年患者RUNX1、TP53、IDH2、SF3B1和ASXL1基因突變的頻率明顯更高；對比分析老年患者和年輕患者AML基因突變類別發(fā)現(xiàn)，老年AML患者的DNA甲基化相關基因突變發(fā)生率更高，可達87.7%；但在年輕的AML患者中，轉錄失調(diào)與激活的信號相關基因突變之間似乎沒有差異。國內(nèi)外同樣有相關報道證實老年AML患者以DNMT3A基因突變高發(fā)，而中青年患者以FLT3-ITD基因突變多發(fā)[14]。DNMT3A屬于DNA甲基轉移酶家族，承擔了DNA的甲基化修飾工作，是造血干細胞分化的必需物，其通過影響造血干細胞的某些調(diào)節(jié)基因的轉錄來發(fā)揮作用。在AML中DNMT3A基因突變發(fā)生率為14%～34%[14]，且DNMT3A基因突變易伴發(fā)其他突變，如在AML中DNMT3A基因突變?nèi)菀渍T發(fā)FLT3-ITD基因突變發(fā)生，發(fā)生這種雙突變的AML患者誘導緩解率較低，復發(fā)率和死亡率高[15]。DNMT3A基因突變在AML患者中的意義未明，部分學者認為DNMT3A基因突變提示AML預后差。王麗娟[16]報道了AML患者中DNMT3A基因突變發(fā)生率為9.76%，且認為DNMT3A基因突變?yōu)閺桶l(fā)的獨立危險因素；DNMT3A基因突變可能會改變某些白血病亞型的獨特基因表達譜。本文根據(jù)豫北地區(qū)患者的經(jīng)濟能力，行5種常見AML基因突變測序分析，196例患者檢出率為37.2%，稍高于國內(nèi)學者的報道；老年患者DNMT3A基因突變發(fā)生率高于青年患者，與國內(nèi)學者報道相似；且老年患者更易發(fā)生2種及以上的基因突變，這也是老年AML患者預后差的主要原因之一。

總之，河南豫北地區(qū)老年和青年初診AML患者臨床病理特征存在一定差異；與青年組比較，老年組患者外周血紅細胞、血紅蛋白、血小板水平較低，DNMT3A突變率較高，且易出現(xiàn)多基因突變。本文通過對豫北地區(qū)AML患者的特征分析，為今后本地區(qū)AML患者的治療提供一定的參考。