血管內(nèi)皮生長因子基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜異位癥的相關(guān)性

谷杭芝，張徐，王光演，林蓉蓉，胡燕

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科，浙江溫州325015）

子宮內(nèi)膜異位癥（簡稱內(nèi)異癥）是一種婦科的常見疾病，是以宮腔以外部位（卵巢、大網(wǎng)膜、子宮直腸陷凹、腹壁、肺等）的活性子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖、浸潤為特點(diǎn)，在育齡期婦女的發(fā)病率為5%～10%，可引起頑固性、進(jìn)展性、慢性盆腔疼痛，可導(dǎo)致不孕、月經(jīng)異常，甚至有惡變的風(fēng)險，嚴(yán)重影響育齡婦女的身心健康[1]。血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子之一，在血管生成過程中有十分重要的作用，同時也是一種有效的血管通透性誘導(dǎo)因子[2]。有研究表明VEGF的高表達(dá)與內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[3]，證明在內(nèi)異癥的發(fā)病過程中VEGF是一個重要的因子。對于VEGF基因多態(tài)性與內(nèi)異癥易感的關(guān)系，國外已有較多關(guān)于VEGF+405G/C、-460C/T、-634G/C、+936C/T、-1154G/A、-2578C/A等位點(diǎn)與內(nèi)異癥的相關(guān)研究已見報道[4-8]。而VEGF的rs3025040C/T、rs10434G/A兩位點(diǎn)與內(nèi)異癥相關(guān)的研究卻尚未見報道。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片斷長度多態(tài)性（polymorphismchainreactionandrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysis，PCR-RFLP）分析技術(shù)對溫州地區(qū)內(nèi)異癥患者和非內(nèi)異癥婦女的VEGF-rs3025040C/T、rs10434G/A位點(diǎn)基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，以探討VEGF基因多態(tài)性與內(nèi)異癥遺傳易感性的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2014年3月至2015年3月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院婦科接受腹腔鏡手術(shù)的患者150例，術(shù)后標(biāo)本均經(jīng)過病理學(xué)證實(shí)為內(nèi)異癥，列為內(nèi)異癥組。嚴(yán)格按照美國生育學(xué)會1985年修訂的內(nèi)異癥分期標(biāo)準(zhǔn)（r-AFS）將所有內(nèi)異癥組患者進(jìn)行分期，其中I-II期內(nèi)異癥患者50 例，III-IV期患者100例。隨機(jī)選取同時期本院健康體檢者150例為對照組，通過詢問既往史結(jié)合相關(guān)化驗(yàn)檢查后排除內(nèi)異癥。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器 血液基因組DNA提取試劑盒、2×TaqPCRMasterMix、50bpDNAladder、100bpDNAladder、DNAloadingbuffer購自天根生化科技（北京）有限公司，限制性內(nèi)切酶AluI、HaeIII、HpaII購自NEB（北京）有限公司，紫外分光光度計購自美國Thermo公司，電泳儀購自北京百晶生物技術(shù)有限公司，PCR擴(kuò)增儀購自德國MastercyclergradientEppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA提?。簾o菌操作下采集外周靜脈血至少5mL，加入內(nèi)置有0.85mL枸櫞酸鈉的試管中，混勻，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)檢測）。按照血液基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取基因組NDA。

1.3.2 基因多態(tài)性檢測：基因檢測采用PCR-RFLP技術(shù)。PCR反應(yīng)體積為20μL體系，其中模板1μg，上游引物1μL，下游引物1μL，2×TaqPCRMasterMix10μL，雙蒸水補(bǔ)足至20μL。酶切體系為：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2.5μL、10×Buffer1μL、三蒸水6.3μL、限制性內(nèi)切酶0.2μL，恒溫水浴4h。將酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，電腦成像系統(tǒng)成像分析。各位點(diǎn)引物序列、限制性內(nèi)切酶及其酶切產(chǎn)物長度見表1-2。

表1 VEGF基因位點(diǎn)多態(tài)序列

表2 各位點(diǎn)特異引物及限制性內(nèi)切酶

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件，組間的基因型及等位基因比較采用χ2檢驗(yàn)。等位基因的相對危險度用OR值和95%CI表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn) 應(yīng)用Hardy- Weinberg公式計算出對照組中VEGF-rs3025040和VEGF-rs10434基因型頻率觀察數(shù)與期望數(shù)，兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），表明本研究對照組資料具有群體代表性（見表3）。

表3 Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.2 2組VEGF-rs3025040C/T位點(diǎn)多態(tài)性等位基因和基因型分布及比較 內(nèi)異癥組VEGF-rs3025040C/T位點(diǎn)等位基因C頻率顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=23.762，P ＜0.001，OR=1.800，95%CI=1.410～2.298），提示在VEGF-rs3025040C/T位點(diǎn)上攜帶有C等位基因的婦女患有內(nèi)異癥風(fēng)險是攜帶T等位基因婦女的1.800倍。內(nèi)異癥組VEGFrs3025040C/T位點(diǎn)多態(tài)性存在CC、CT、TT3種基因型，2組基因型分布比較結(jié)果顯示，在不同基因型分布上2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=43.509，P＜0.001）。見表4。

2.3 2組VEG-rs10434G/A位點(diǎn)多態(tài)性等位基因和基因型分布及比較 2組VEGF-rs10434G/A位點(diǎn)等位基因分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=34.084，P＜0.001，OR=1.340，95%CI=1.207～1.497），提示在VEGF-rs10434G/A位點(diǎn)上攜帶有A等位基因的婦女更易得內(nèi)異癥。VEGF-rs10434G/A位點(diǎn)多態(tài)性存在GG、GA、AA3種基因型，2組基因型比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=57.550，P＜0.001）。見表4。

表4 VEGF-rs3025040C/T位點(diǎn)和VEGF-rs10434G/A位點(diǎn)基因型和等位基因分布[每組n=150，頻數(shù)（%）]

3 討論

VEGF是FERRARA等[2]在牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)液中得到的一種寡二聚體糖蛋白，相對分子質(zhì)量為35～45kDa。VEGF是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子之一，同時也是一種有效的血管通透性誘導(dǎo)因子[9]。目前已有的研究表明在內(nèi)異癥的發(fā)病過程中VEGF是一個重要的因子[10]。子宮內(nèi)膜脫落的內(nèi)膜碎片可能具有先天血管生成潛能。人的子宮內(nèi)膜由功能層和基底層組成，是唯一一個在卵巢類固醇激素-雌激素和孕激素調(diào)節(jié)下隨著月經(jīng)周期而發(fā)生周期性的增殖、分化、退化的器官。在每個月經(jīng)周期隨著內(nèi)膜的生長，內(nèi)膜血管系統(tǒng)在卵巢類固醇激素，尤其是雌激素的作用下經(jīng)歷著增殖和退化的變化。SHIFREN等[11]檢測了增殖期和分泌期功能層的VEGFmRNA增加程度，表明在每個月經(jīng)周期都有血管新生的發(fā)生。他進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，雌激素能刺激VEGF的表達(dá)，與對照組相比，加了雌激素后VEGFmRNA的水平顯著升高。從理論上說內(nèi)異癥是由內(nèi)膜碎片在腹腔種植而成的。健康的內(nèi)膜在雌激素的調(diào)節(jié)下展現(xiàn)出了先天的血管生成潛能，并且在同一實(shí)驗(yàn)中證實(shí)了VEGF的異常表達(dá)和雌激素水平的異常會促進(jìn)內(nèi)異病灶的新生血管生成。事實(shí)上，VEGF在促進(jìn)內(nèi)異癥的血管新生過程中起到了重要的作用。它是一種血管活性物質(zhì)，在很多的生理過程包括創(chuàng)口愈合和內(nèi)膜的血管重建中調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。在腫瘤的發(fā)生過程中，VEGF濃度與血管密度增加顯著相關(guān)。在正常的內(nèi)膜中，VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平可被缺氧所驅(qū)動[3]。與早期內(nèi)異癥患者和健康人相比，晚期內(nèi)異癥患者的腹腔液中具有更高濃度的VEGF[12]。另外，內(nèi)異癥患者腹腔液和血漿中升高的VEGF濃度與內(nèi)異癥病灶細(xì)胞的增殖活性和微血管密度呈正相關(guān)[13]。內(nèi)異癥病灶和腹腔巨噬細(xì)胞在雌孕激素的作用下會增加VEGF的表達(dá)[14-15]，成為VEGF的來源。此外，不同類型的免疫細(xì)胞通過產(chǎn)生促炎性和血管生成細(xì)胞因子，同時又增加其在內(nèi)異癥病灶暴露的腹腔液中的濃度來參與血管形成[15]。LIN等[16]發(fā)現(xiàn)內(nèi)異癥病灶的血管形成發(fā)生在分泌VEGF的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞向病灶和腹腔浸潤之后，闡明了免疫細(xì)胞的重要性，人類的子宮內(nèi)膜功能層具有獨(dú)特的在周期性脫落后出現(xiàn)周期性的增殖和退化的變化，因此子宮內(nèi)膜碎片進(jìn)入腹腔后仍具有血管生成能力。

人的VEGF基因位于染色體的6p21.3，長14kb，由8 個外顯子和7 個內(nèi)含子交替組成。VEGF基因至少有30 個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，如+405G/C、-460C/T、-634G/C、+936C/T、-1154G/A、-2578C/A等。這些基因多態(tài)性可能通過影響VEGF的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。對于VEGF基因多態(tài)性與內(nèi)異癥易感的關(guān)系國外有較多報道。ALTINKAYA等[5]研究表明+405G/CG等位基因的存在與內(nèi)異癥的發(fā)病有關(guān)。有研究[17-18]指出，VEGF-460C/T和+405G/C多態(tài)存在連鎖不平衡，-460T/+405C單倍型與低啟動子活性有關(guān)，攜帶+405G等位基因可能增加內(nèi)異癥的發(fā)病風(fēng)險；KIM等[8]報道韓國婦女?dāng)y帶CC基因型的罹患風(fēng)險增加1.99倍；早期IKUHASHI等[7]研究發(fā)現(xiàn)VEGF+936C/T的T等位基因可能增加III-IV期內(nèi)異癥的患病風(fēng)險，HENIDI等[6]也得到了相似的結(jié)果。而林蓉蓉等[19]研究發(fā)現(xiàn)MIF基因多態(tài)性與腹壁內(nèi)異癥遺傳易感性相關(guān)，提示我們基因多態(tài)性與內(nèi)異癥的發(fā)生相關(guān)。劉青等[20]研究發(fā)現(xiàn)攜帶VEGF-1154GG和-2578CC基因型顯著增加內(nèi)異癥的發(fā)病風(fēng)險，而其中單倍型VEGF-460/-1154/-2578TGC、CAA、TAA和TAC與內(nèi)異癥的發(fā)病明顯相關(guān)。VEGF+936C/T基因多態(tài)性可能與內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，C等位基因可能是內(nèi)異癥的易感基因[21]。

而在本研究中新納入的2 個VEGF多態(tài)性位點(diǎn)rs3025040C/T和rs10434G/A在內(nèi)異癥發(fā)病中均具有顯著性意義，rs3025040C/T的C等位基因和rs10434G/A位點(diǎn)的A等位基因均增加內(nèi)異癥的罹患風(fēng)險，為預(yù)測婦女內(nèi)異癥的發(fā)病風(fēng)險，篩選出高風(fēng)險的婦女，盡可能降低發(fā)病風(fēng)險，或積極干預(yù)減輕病情進(jìn)展奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但VEGFrs3025040C/T的C等位基因和rs10434G/A位點(diǎn)的A等位基因，如何調(diào)控內(nèi)異癥的發(fā)生發(fā)展，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。