MAST3對胃癌細胞SGC-7901細胞增殖及遷移的作用

王 磊，陳 鶴，張 敏，王中新

胃癌作為目前常見的惡性腫瘤之一[1]，具有較復雜的發(fā)病、侵襲及轉移機制。其癌變過程是長期的細胞生物學行為由正常演變?yōu)楫惓５倪^程, 其發(fā)病與端粒酶激活、抑癌基因失活和癌基因激活等引發(fā)的多因素、多階段及多基因變異相關[2-3]。

目前有關MAST3基因的研究主要集中在炎癥性腸病中，研究[4-5]表明缺失MAST3的細胞能夠使Toll樣受體4依賴的NF-κB的活性下降，由此也進一步證明了NF-κB途徑在炎癥性腸病發(fā)病機制中起到重要作用。但對于MAST3基因在胃癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機制等尚未完全明確。本研究旨在觀察MAST3在胃癌中的表達情況以及探索干擾及過表達MAST3對胃癌細胞SGC-7901細胞增殖及遷移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑胎牛血清來源于美國PAN公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；Opti-MEM購自美國Gibco公司；轉染使用的Lipofectamine 2 000 Reagent試劑購自美國Invitrogen公司；人外源性生長因子TGF-β購自美國PeproTech公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix和SYBR Green PCR Master Mix均購自日本TOYOBO公司；RIPA裂解液和細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；小鼠抗β-actin抗體和兔抗MAST3抗體購自美國Bioworld公司；山羊抗兔和山羊抗小鼠的二抗購自北京中杉生物技術公司；細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、C-myc抗體、MMP-3和MMP-9購自美國Cell signaling technology公司；MAST3的過表達質粒與小干擾RNA均購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 樣本收集與細胞培養(yǎng)選取臨床中6例33～78(61±4.8)歲胃癌患者，在手術后分別選取胃癌和癌旁組織，生理鹽水清洗后，多聚甲醛固定和冰凍保存，同時患者已簽署知情同意書。

人胃癌細胞株SGC-7901細胞來自安徽醫(yī)科大學藥學院贈送，使用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉染轉染使用對數生長期的細胞, 按照說明書使用Lip2000將MAST3-RNAi和pEx-3-MAST3分別轉染到SGC-7901細胞中，6 h后使用TGF-β進行刺激。細胞轉染48 h后，收集細胞進行后續(xù)研究。

1.4 qRT-PCR檢測細胞中MAST3、CyclinD1、C-myc、MMP-3和MMP-9 mRNA的表達使用TRIzol法提取組織和細胞中總RNA，并使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix逆轉錄成cDNA。根據SYBR Green PCR Master Mix說明書步驟進行qRT-PCR檢測。

1.5 Western blot印跡法檢測細胞中MAST3、CyclinD1、C-myc、MMP-3和MMP-9蛋白表達的改變收集組織和處理后的細胞，并使用蛋白裂解液裂解；離心后提取組織和細胞中的總蛋白，并加入SDS-蛋白上樣緩沖液煮沸變性。使用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測蛋白相對表達量。按照組別依次加樣，依次電泳、轉膜、封閉后，一抗(稀釋濃度均為1 ∶500)孵育過夜，之后二抗(稀釋濃度均為1 ∶5 000)孵育1 h。使用凝膠成像分析系統掃描成像并分析。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期收集處理后的細胞，冷PBS清洗2次后，使用70%乙醇固定變性過夜。離心、清洗后收集細胞，根據說明書加入500 μl 緩沖液重懸細胞，分別加入RNaseA、PI，4 ℃避光孵育30 min后上機檢測分析。

2 結果

2.1 MAST3在胃癌組織中的表達為了探究MAST3在胃癌中的作用，本研究首先選取胃癌組織和癌旁組織，并通過Western blot和qRT-PCR檢測MAST3的表達情況。qRT-PCR和Western blot結果顯示，胃癌組織中MAST3 mRNA和蛋白表達均高于癌旁組織，且差異有統計意義(F=21.36，P<0.01；F=18.76，P<0.01)，見圖1A、1B。同時，本研究還檢測了TGF-β1對胃癌細胞株SGC-7901細胞中MAST3的表達的影響，TGF-β1能夠上調SGC-7901細胞中MAST3 mRNA和蛋白的表達，且差異有統計意義(F=33.81，P<0.01；F=28.71，P<0.01)，見圖1A、1C。提示，MAST3與胃癌的發(fā)生有著密切的關系。

2.2 沉默MAST3對SGC-7901細胞增殖及遷移的影響使用MAST3-RNAi沉默SGC-7901細胞中MAST3的表達，觀察對SGC-7901細胞增殖和遷移的影響。qRT-PCR和Western blot結果證實MAST3-RNAi能夠降低TGF-β1刺激SGC-7901細胞中MAST3 mRNA和蛋白的表達，且差異有統計意義(P<0.01)，見圖2A、2B。同時本研究還檢測了細胞增殖相關基因C-myc和 CyclinD1的表達變化，qRT-PCR和Western blot結果表明MAST3-RNAi能夠降低TGF-β1刺激SGC-7901細胞中C-myc和 Cy-clinD1 mRNA和蛋白的表達，且差異有統計意義(P<0.01)，見圖2C、2D。細胞周期研究結果也表明，MAST3-RNAi組S期和G2/M期細胞比例(45±5.2)%明顯低于NC-RNAi組S期和G2/M期細胞比例(65±8.7)%，且差異有統計意義(P<0.05)，見圖2E。本研究檢測了細胞遷移相關基因MMP-3和MMP-9的表達變化，qRT-PCR和Western blot結果都表明MAST3-RNAi能夠下調TGF-β1刺激SGC-7901細胞中MMP-3和MMP-9 mRNA和蛋白的表達，且差異有統計意義(P<0.01)，見圖2F、2G。提示抑制MAST3表達可以抑制胃癌細胞SGC-7901的增殖及遷移能力。

圖1 MAST3在胃癌中的表達變化

A：qRT-PCR檢測MAST3 mRNA表達，胃癌組織(左側)，TGF-β1刺激SGC-7901細胞(右側)；B：Western blot檢測MAST3 蛋白在胃癌中的表達；C：Western blot檢測TGF-β1刺激SGC-7901細胞中MAST3蛋白的表達；1：癌旁組織；2：胃癌組織；3：對照組；4：TGF-β1刺激組；與癌旁組織比較：**P<0.01；與對照組比較：##P<0.01

2.3 過表達MAST3對SGC-7901細胞增殖及遷移的影響為了進一步探究MAST3在胃癌中的作用，使用過表達質粒pEx-3-MAST3過表達SGC-7901細胞中MAST3的表達。qRT-PCR和Western blot結果證實pEx-3-MAST3能夠增加TGF-β1刺激SGC-7901細胞中MAST3 mRNA和蛋白的表達，且差異有統計意義(P<0.01)，見圖3A、3B。qRT-PCR和Western blot結果表明pEx-3-MAST3能夠升高TGF-β1刺激SGC-7901細胞中C-myc和CyclinD1 mRNA和蛋白的表達，且差異有統計意義(P<0.01)，見圖3C、3D。細胞周期結果也表明，pEx-3-MAST3組S期和G2/M期細胞比例(77±4.8)%高于pEx-3組S期和G2/M期細胞比例(66±5.1)%，且差異有統計意義(P<0.05)，見圖3E。qRT-PCR和Western blot結果也都表明pEx-3-MAST3能夠上調TGF-β1刺激SGC-7901細胞中MMP-3和 MMP-9 mRNA和蛋白的表達，且差異有統計意義(P<0.01)，見圖3F、3G。提示，增加MAST3表達能夠增加胃癌細胞SGC-7901的增殖及遷移能力。

圖2 MAST3-RNAi對SGC-7901細胞增殖及遷移的影響

A：qRT-PCR檢測MAST3 mRNA在SGC-7901中的表達；B：Western blot檢測MAST3蛋白在SGC-7901中的表達；C：qRT-PCR檢測SGC-7901細胞中C-myc和CyclinD1 mRNA的表達；D：Western blot檢測SGC-7901細胞中C-myc和CyclinD1蛋白的表達；E：流式細胞儀檢測SGC-7901細胞細胞周期；F：qRT-PCR檢測SGC-7901細胞中MMP-3和MMP-9 mRNA的表達；G：Western blot檢測SGC-7901細胞中MMP-3和MMP-9蛋白的表達；1：正常組；2：TGF-β1刺激組；3：TGF-β1刺激+NC-RNAi組；4：TGF-β1刺激+MAST3-RNAi組；與正常組比較：##P<0.01；與TGF-β1刺激+NC-RNAi組比較：**P<0.01

圖3 pEx-3-MAST3對SGC-7901細胞增殖及遷移的影響

A：qRT-PCR檢測MAST3 mRNA在SGC-7901中的表達；B：Western blot檢測MAST3蛋白在SGC-7901中的表達；C：qRT-PCR檢測SGC-7901細胞中C-myc和 CyclinD1 mRNA的表達；D：Western blot檢測SGC-7901細胞中C-myc和CyclinD1蛋白的表達；E：流式細胞儀檢測SGC-7901細胞細胞周期；F：qRT-PCR檢測SGC-7901細胞中MMP-3和MMP-9 mRNA的表達；G：Western blot檢測SGC-7901細胞中MMP-3和MMP-9蛋白的表達；1：正常組；2：TGF-β1刺激組；3：TGF-β1刺激+ pEx組；4：TGF-β1刺激+pEx-3-MAST3組；與正常組比較：##P<0.01；與TGF-β1刺激+pEx組比較：**P<0.01

3 討論

胃癌發(fā)病機制較為復雜，尚未能完全明確，目前仍未有徹底治愈胃癌的治療手段。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參與的復雜過程, 包括癌基因的異常激活和抑癌基因失活[6]。隨著細胞分子生物學研究的進展，腫瘤的基因靶向治療成為國內外研究熱點，為尋求新的治療方式應用于臨床，以達到更好的治療效果。

MAST家族是相對未知的激酶分支，而MAST3是MAST家族成員之一，序列同一性分析以及功能測定已顯示MAST3參與許多細胞免疫應答的調節(jié)過程[7-8]。有研究[5]顯示MAST3在鼠和人的免疫細胞中表達，同時闡明MAST3在調節(jié)腸道炎癥中蛋白質相互作用中的功能將有助于確定導致腸道炎癥的復雜分子機制[9-10]。本研究中, 通過qRT-PCR及Western blot檢測MAST3的表達，結果表明胃癌中MAST3 mRNA和蛋白表達明顯高于癌旁組織，說明MAST3與胃癌的發(fā)生有著密切的關系。

TGF-β1是一種轉化生長因子，它通常被用來誘導SGC-7901細胞發(fā)生上皮間質轉化，使細胞發(fā)生增殖、遷移等，從而加重胃癌的發(fā)生發(fā)展[11]。本研究顯示TGF-β1能夠增加胃癌細胞株SGC-7901細胞中MAST3 mRNA和蛋白的表達。同時，本研究還顯示MAST3表達可以影響細胞周期蛋白CyclinD1和癌基因C-myc表達。CyclinD1和C-myc已經被證明參與細胞的增殖，能夠反映細胞增殖情況[12]。Western blot和qRT-PCR結果表明，使用MAST3-RNAi后，CyclinD1、C-myc的蛋白及mRNA表達下調。相反，pEx-3-MAST3增加MAST3表達后，CyclinD1、C-myc的蛋白及mRNA表達明顯上調。說明MAST3可能參與胃癌細胞的增殖。為了進一步確認并觀察MAST3對細胞增殖的作用，本研究還分析細胞周期情況，結果顯示MAST3-RNAi能夠降低SGC-7901細胞中S期和G2/M期細胞比例，抑制了細胞的有絲分裂，從而阻滯了細胞增殖；同時，過表達MAST3后，能夠增加SGC-7901細胞中S期和G2/M期細胞比例。這進一步說明了MAST3的表達可以調控SGC-7901細胞的增殖，從而參與胃癌的發(fā)生。

本研究還表明MAST3表達可以影響SGC-7901細胞的遷移。Western blot和qRT-PCR結果顯示，使用MAST3-RNAi后，MMP-9和MMP-3的蛋白及mRNA表達下調。相反，pEx-3-MAST3增加MAST3表達后，MMP-9和MMP-3的蛋白及mRNA表達明顯上調。提示MAST3可能會影響SGC-7901細胞的遷移。