iTRAQ法分析原發(fā)性慢性閉角型青光眼患者血漿中蛋白組學(xué)變化

李 倩， 張立宇， 蔣正軒，沈 兵，許育新

青光眼是一類以高眼壓為危險(xiǎn)因素并具有特征性、不可逆性視野缺損的進(jìn)展性視神經(jīng)病變，是全球第二位致盲性疾病。原發(fā)性慢性閉角型青光眼(chronic primary angle-closure glaucoma,CPACG)是我國(guó)最常見(jiàn)的類型，在我國(guó)40歲以上自然人群中致盲率達(dá)38.3%[1]。迄今為止，CPACG的發(fā)病機(jī)制并未完全闡明?，F(xiàn)利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)分析聯(lián)合同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量技術(shù)(isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)鑒定CPACG患者血漿中的差異蛋白(different proteins，DEPs)，通過(guò)生物信息學(xué)分析，試圖發(fā)現(xiàn)該病血漿中存在的關(guān)鍵蛋白和參與疾病發(fā)生的主要信號(hào)通路，找出疾病可能存在的血漿標(biāo)志物，明確發(fā)病機(jī)制，對(duì)臨床的診斷和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 病例資料收集2019年2～9月安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院眼科收治的CPACG患者10例，其中男女各5例，年齡64～72(67.8±3.64)歲。同時(shí)收集年齡、性別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的白內(nèi)障患者10例作為對(duì)照組，其中男女各5例，年齡61～70(65.8±3.82)歲。本研究獲安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)CPACG患者納入標(biāo)準(zhǔn)：① 符合慢性青光眼診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；② 眼底視神經(jīng)損害和特征性視野缺損；③ 房角鏡及OCT顯示前房角關(guān)閉的患者；④ 患者眼壓高于2.79 kPa且沒(méi)有藥物干預(yù)。

CPACG患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)于其他疾病的閉角型青光眼患者；②以前做過(guò)青光眼手術(shù)或藥物干預(yù)的患者；③患有影響血液中相關(guān)蛋白變化的疾病，例如自身免疫性疾病、感染性疾病的患者；④有高血壓、糖尿病、高度近視、腦血管疾病等青光眼高危因素的患者。

對(duì)照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡、性別、民族、居住地區(qū)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的白內(nèi)障患者。

對(duì)照組的排除標(biāo)準(zhǔn)：有青光眼高危因素和家族聚集性青光眼疾病的患者，排除程度嚴(yán)重的，可導(dǎo)致繼發(fā)性青光眼的白內(nèi)障患者。

1.3 血漿樣品的采集與保存清晨采集患者空腹血液2 ml于抗凝管中，1 h內(nèi)前往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行離心，4 ℃、3 000 r/min，離心15 min，取上清液以200 μl/管分裝至離心管中，-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。

1.4 標(biāo)記前樣本準(zhǔn)備去除高豐度蛋白，按照BCA法進(jìn)行蛋白定量和SDS-PAGE電泳，然后樣品蛋白還原烷基化及酶解，參考FASP法酶解蛋白。

1.5 iTRAQ蛋白標(biāo)記取出iTRAQ試劑，室溫下離心至管底，異丙醇溶解；取50 μl樣品(100 μg酶解產(chǎn)物)轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入iTRAQ試劑后室溫反應(yīng)2 h；加水終止反應(yīng)；混合樣品振蕩，離心至管底；真空冷凍干燥樣品，留作iTRAQ分離鑒定。具體操作按照iTRAQ試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 2D-LC-MS/MS分析質(zhì)譜采用Triple TOF 5600系統(tǒng)(AB SCIEX，美國(guó))結(jié)合納升噴霧Ⅲ離子源(AB SCIEX, 美國(guó))，噴霧電壓為2.5 kV，氣簾氣壓和霧化氣壓分別設(shè)為206.84 kPa和34.47 kPa，加熱器溫度為150 ℃，質(zhì)譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下(information dependent analysis，IDA)，一級(jí)TOF-MS單張圖譜掃描時(shí)間為250 ms，每次IDA循環(huán)下最多可采集35個(gè)電荷為2+到5+且單秒計(jì)數(shù)大于150的二級(jí)圖譜，每次循環(huán)時(shí)間皆為2.5 s，碰撞室能量設(shè)定適用于所有前體離子碰撞誘導(dǎo)解離，動(dòng)態(tài)排除設(shè)置為18 s，約等于色譜半峰寬。

1.7 序列數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與數(shù)據(jù)分析收集到的數(shù)據(jù)用Protein Pilot Software v. 5.0(AB SCIEX, 美國(guó))軟件進(jìn)行分析，選用uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)鑒定肽段。根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度值得到蛋白質(zhì)量，設(shè)定在2個(gè)重復(fù)樣品中上調(diào)或下調(diào),且log10差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)>1.2，P<0.05的蛋白為DEPs。

1.8 GO分析與KEGG分析基因本體論(gene ontology, GO)分析總共有3個(gè)部分：分子功能(molecular function，MF)、生物過(guò)程(biological process, BP)和細(xì)胞組成(cellular component, CC)。通過(guò)(http://metascape.org)網(wǎng)站進(jìn)行GO分析，了解DEPs相關(guān)注釋及其主要功能。基于京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)分析是利用KOBAS聯(lián)機(jī)分析數(shù)據(jù)庫(kù)(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)DEPs進(jìn)行了路徑分析。通過(guò)對(duì)GO分析和KEGG分析結(jié)果的整理，根據(jù)文獻(xiàn)閱讀進(jìn)行比對(duì)篩查，發(fā)現(xiàn)可能的重要蛋白。

2 結(jié)果

2.1 DEPs的篩選定量分析顯示CPACG組與對(duì)照組比較有143個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DEPs，其中上調(diào)蛋白49個(gè)，下調(diào)蛋白94個(gè)(圖1)。

2.2 GO功能及富集分析結(jié)果通過(guò)對(duì)DEPs進(jìn)行GO功能注釋(圖2)，根據(jù)GO分析發(fā)現(xiàn)DEPs主要涉及免疫應(yīng)答、對(duì)刺激的應(yīng)答、細(xì)胞形態(tài)調(diào)節(jié)、蛋白激活傳遞、細(xì)胞基質(zhì)黏附等生物過(guò)程、蛋白結(jié)合，接觸反應(yīng)、分子功能調(diào)節(jié)等分子功能，細(xì)胞定位主要在細(xì)胞外區(qū)域。

圖1 DEPs表達(dá)火山圖

紅點(diǎn)：上調(diào)，綠點(diǎn)：下調(diào)，黑點(diǎn)：無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變化

2.3 KEGG信號(hào)通路分析為了分析這些DEPs的相關(guān)功能，使用KOBAS在線分析工具來(lái)搜索KEGG信號(hào)通路。發(fā)現(xiàn)主要富集在補(bǔ)體凝集級(jí)聯(lián)反應(yīng)和代謝途徑(圖3)，圖4顯示DEPs富集的不同途徑。

圖3 DEPs KEGG富集信號(hào)通路圖

圖4 DEPs KEGG信號(hào)通路氣泡圖

2.4 重要DEPs通過(guò)DEPs KEGG分析，在表達(dá)上調(diào)的DEPs中發(fā)現(xiàn)以下重要蛋白(表1)：對(duì)CPACG視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和GO分起保護(hù)作用的肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子激動(dòng)劑(hepatocyte growth factor activator，HGFA),通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用影響原發(fā)性閉角型青光眼進(jìn)展的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(glutathione peroxidase 3，GPx-3)、過(guò)氧化物酶(peroxiredoxin-2)；以及在致病機(jī)制中參與免疫反應(yīng)的補(bǔ)體4(complement 4，C4)、補(bǔ)體4結(jié)合蛋白(complement 4 binding protein，C4BP)。

表1 重要DEPs分析表

3 討論

本研究通過(guò)iTRAQ法對(duì)CPACG的血漿進(jìn)行檢測(cè)分析，顯示在CPACG發(fā)展中的關(guān)鍵蛋白和主要信號(hào)通路 。其主要結(jié)果如下：①鑒定出143種有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的DEPs，其中49種蛋白上調(diào)，94種蛋白表達(dá)下調(diào)；②GO分析DEPs在BP、CC、MF 3個(gè)方面的表達(dá)，結(jié)果顯示DEPs主要與免疫應(yīng)答、抗氧化應(yīng)激有關(guān)，與青光眼的發(fā)病機(jī)制相一致；③KEGG分析發(fā)現(xiàn)DEPs的主要作用通路，其中補(bǔ)體凝集級(jí)聯(lián)反應(yīng)是最主要的通路，很可能在青光眼疾病發(fā)展過(guò)程中起到重要作用，而補(bǔ)體系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)的重要部分，可能是CPACG發(fā)病的關(guān)鍵因素；④通過(guò)對(duì)質(zhì)譜結(jié)果的GO分析和KEGG分析并結(jié)合文獻(xiàn)，推測(cè)表1中的蛋白可能與青光眼存在重要聯(lián)系，闡述如下：

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)具有組織損傷再修復(fù)作用，在眼部組織中也有著豐富的表達(dá)，參與多種眼科疾病。HGF的基因多態(tài)性與閉角型青光眼疾病的易感性存在密切關(guān)系，具有CGC單體型的患者患閉角型青光眼的可能性更低[2]。Nie et al[3]發(fā)現(xiàn)HGF基因表達(dá)在青光眼中呈下降趨勢(shì)，治療后HGF基因表達(dá)增高但仍低于正常，并且通過(guò)生物信息學(xué)分析，認(rèn)為HGF可作為青光眼治療預(yù)后的生物標(biāo)志物之一。本研究檢測(cè)到青光眼患者血漿中HGFA顯著升高，但HGF濃度未見(jiàn)增多，認(rèn)為HGFA的增高可能是由于青光眼患者HGF的表達(dá)低于正常人，發(fā)病時(shí)機(jī)體產(chǎn)生自我調(diào)節(jié)，使HGFA代償性增高。

氧化應(yīng)激是青光眼視神經(jīng)損傷機(jī)制之一，在青光眼中，細(xì)胞線粒體功能發(fā)生缺陷，Ca2+超載和活性氧水平升高，小梁網(wǎng)(trabecular meshwork,TM)和視網(wǎng)膜缺乏有效的抗氧化劑，最終導(dǎo)致DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)破壞，細(xì)胞衰變，從而引起組織的形態(tài)和功能損傷[4-6]。SOD、GPx-3、Peroxiredoxin能通過(guò)對(duì)抗氧自由基減少缺血和氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞和組織的損害[7]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中SOD、GPx-3、Peroxiredoxin-2在青光眼患者血漿中上調(diào)，可見(jiàn)氧化應(yīng)激在青光眼發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。然而Tang et al[5]通過(guò)Meta分析發(fā)現(xiàn)不同亞型的青光眼患者外周血和房水中抗氧化物總量和單獨(dú)某種抗氧化物含量變化不同，開(kāi)角型青光眼房水或外周血中總抗氧化物水平(total antioxidant status, TAS)降低但房水SOD和GPx表達(dá)水平增高，剝脫性青光眼TAS與對(duì)照組比較卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究中，CPACG患者血漿SOD和GPx3的表達(dá)增多，與Goyal et al[8]實(shí)驗(yàn)中房水SOD和GPx水平增高一致。因此，平衡氧化物和抗氧化物是青光眼治療的新思路。

補(bǔ)體系統(tǒng)是天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在青光眼疾病中，補(bǔ)體系統(tǒng)通過(guò)免疫應(yīng)答對(duì)視神經(jīng)產(chǎn)生作用是近些年研究熱點(diǎn)。C4和C4BP是補(bǔ)體系統(tǒng)的一部分，Mohlin et al[9]通過(guò)豬視網(wǎng)膜和人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)模仿視神經(jīng)退行性疾病，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞可以使補(bǔ)體系統(tǒng)發(fā)揮作用，減少視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的死亡。補(bǔ)體紊亂常常是青光眼疾病發(fā)展的原因之一，青光眼的視神經(jīng)和視網(wǎng)膜在損傷前有局部補(bǔ)體上調(diào)和激活，C3抑制劑可起到一定的治療作用[10]。C3是補(bǔ)體系統(tǒng)的重要成分，C1Q是補(bǔ)體系統(tǒng)的激活成分，然而，本研究中僅檢測(cè)到C4和C4BP增多而C3和C1Q并未增多，認(rèn)為與補(bǔ)體系統(tǒng)的改變一般早于青光眼視神經(jīng)損傷有關(guān)，CPACG多無(wú)明顯的發(fā)作癥狀，前來(lái)就醫(yī)時(shí)大都已有嚴(yán)重視神經(jīng)損傷，此時(shí)機(jī)體已產(chǎn)生自我保護(hù)反應(yīng)，對(duì)紊亂的補(bǔ)體進(jìn)行調(diào)整和清除，因此可能檢測(cè)不到C3和C1Q。實(shí)驗(yàn)中C4顯著增多，具體功能和機(jī)制還需要將來(lái)進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。