性別對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型建立的影響

羅婷婷，韓陳陳，崔東倩，張 雨，劉 倩，馬 旸，魏 偉

銀屑病是一種自身免疫性疾病，影響全球約1.25億人口[1]，主要表現(xiàn)為紅色斑塊上有白色鱗屑。銀屑病發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，涉及遺傳、炎癥、免疫等多個(gè)方面，目前尚未完全明確[2-3]。建立理想的動(dòng)物模型可以為發(fā)病機(jī)制的探究提供基礎(chǔ)和保障，其中咪喹莫特(imiquimod,IMQ)誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型運(yùn)用廣泛且操作簡(jiǎn)便。性激素能夠通過(guò)多種方式對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，因此在一些與自身免疫疾病有關(guān)的動(dòng)物模型中性別差異會(huì)對(duì)模型的建立產(chǎn)生一定的影響，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型[4]。銀屑病作為一種自身免疫性疾病，其模型的建立是否也會(huì)受到性別差異的影響，為了探究這一問(wèn)題，現(xiàn)通過(guò)建立不同性別的IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型，對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)并探究性別差異對(duì)IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型建立的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡BALB/c小鼠，30只，體質(zhì)量20～22 g，雌雄各半，清潔級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與儀器IMQ乳膏(珠海聯(lián)邦制藥中山分公司)；凡士林乳膏(天津博迪公司)；脫毛膏(上海保健品九店公司)；乙二胺四乙酸(ethylenediami-netetraacetic acid,EDTA)抗原修復(fù)液、Triton X-100和DAPI(上海碧云天公司)；H2O2(北京中衫金橋)；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和內(nèi)披蛋白一抗(美國(guó) Santa Cruz Biotechnology公司)；594山羊抗鼠IgG(H+L) 美國(guó)(Jackson Immuno Research公司)；儀器Olympus顯微成像系統(tǒng)(日本Olympus)；RM 2135石蠟切片機(jī)、激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)萊卡公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1分組與模型建立 30只BALB/c小鼠隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、模型組1(雄性)、模型組2(雌性)。使用脫毛膏將小鼠背部(2 cm×3 cm)毛發(fā)完全脫去，稱(chēng)取IMQ乳膏62.5 mg均勻涂抹于模型組小鼠背部，對(duì)照組小鼠涂抹等量的凡士林乳膏，每天涂抹1次，一共持續(xù)5 d。

1.3.2小鼠背部皮損變化觀察 采用銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度( psoriasis area and severity index,PASI) 對(duì)皮損進(jìn)行評(píng)分[5]，用數(shù)碼相機(jī)每天拍照記錄皮損變化情況，給予小鼠皮損處紅斑、鱗屑、增厚程度0～4的評(píng)分，將3者評(píng)分相加得到總分。PASI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：無(wú)=0分；輕度=1分；中度=2分；重度=3分；極重度=4分；總分=鱗屑+增厚+紅斑(0～12分)。

1.3.3取材與處理 第6天上午造模結(jié)束采用頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠脾臟、胸腺、背部皮膚，取三分之一皮膚置于4%的多聚甲醛中常溫保存，其余組織均放置-80 ℃保存。

1.3.4小鼠脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)計(jì)算 脾臟指數(shù)=小鼠脾臟質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)，胸腺指數(shù)=小鼠胸腺質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

1.3.5小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察與表皮厚度的檢測(cè) 將放置于4%多聚甲醛中的皮膚組織經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察小鼠皮膚組織病理改變。選取HE染色切片顯微鏡下觀察拍照，在每張切片中隨機(jī)測(cè)量3處從表皮角質(zhì)層到基底層的表皮垂直距離，分析表皮層增厚情況。

1.3.6免疫組化法檢測(cè)小鼠皮膚PCNA的表達(dá) 將石蠟切片脫蠟水化，封閉，再加抗原修復(fù)液進(jìn)行冷修復(fù)，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，蘇木精進(jìn)行復(fù)染，最后在顯微鏡下觀察每組PCNA的表達(dá)情況。

1.3.7免疫熒光法檢測(cè)小鼠皮膚內(nèi)披蛋白的表達(dá) 將石蠟切片脫蠟水化，抗原修復(fù)液進(jìn)行冷修復(fù)，BSA封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，DAPI染核10 min，加抗熒光淬滅劑，指甲油封片，最后在熒光顯微鏡下觀察每組內(nèi)披蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 小鼠皮膚形態(tài)觀察由圖1 A可知對(duì)照組小鼠在第1～5天皮膚均細(xì)膩光滑。由圖1 B、C可知與對(duì)照組小鼠比較，IMQ誘導(dǎo)的小鼠在第1天就表現(xiàn)出輕微鱗屑，皮膚微微泛紅，第2天鱗屑增多涉及整個(gè)皮膚表面，并且出現(xiàn)增厚現(xiàn)象，可見(jiàn)較淺的紅斑，第3天鱗屑分布更加密集，增厚現(xiàn)象進(jìn)一步加重，紅斑顏色也進(jìn)一步加深，第4、5天皮損現(xiàn)象進(jìn)一步加重，雄性小鼠和雌性小鼠皮損變化相似。

圖1 IMQ誘導(dǎo)的小鼠第1～5天皮膚形態(tài)變化

圖2 IMQ誘導(dǎo)的小鼠第1～5天PASI評(píng)分變化

A：增厚；B：鱗屑；C：紅斑；D：總分；與對(duì)照組小鼠比較：**P<0.001

圖3 IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察及HE染色中表皮厚度的變化

A：小鼠皮膚組織病理學(xué)改變 HE×400；B：HE染色下小鼠表皮厚度；a：對(duì)照組；b：模型組1；c：模型組2；與對(duì)照組比較：***P<0.001

2.2 小鼠皮膚PASI評(píng)分依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，每天對(duì)小鼠進(jìn)行拍照，評(píng)分，根據(jù)其均值和方差繪制曲線圖。由圖2 A、B可知IMQ誘導(dǎo)的雄性和雌性小鼠皮膚增厚和鱗屑評(píng)分在第1～5天均持續(xù)升高，由圖2 C可知IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠皮膚紅斑評(píng)分在第2～5天持續(xù)升高，雌性小鼠皮膚紅斑評(píng)分在第1～5天持續(xù)升高。將3者評(píng)分相加得到總分，由圖2 D可知，IMQ誘導(dǎo)的雄性和雌性小鼠皮膚總分在第1～5天均持續(xù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，雄性和雌性小鼠PASI評(píng)分變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 小鼠皮膚組織病理學(xué)觀察及HE染色中表皮厚度的變化從圖3 A(a) HE染色中可以看出對(duì)照組小鼠皮膚結(jié)構(gòu)正常，表皮層細(xì)胞只有兩三層。從圖3 A(b、c)HE染色中可以看出與對(duì)照組小鼠比較，IMQ誘導(dǎo)的小鼠表皮增厚、表皮淺層可見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、角質(zhì)層可見(jiàn)角化不全、顆粒層變薄甚至消失、棘層肥厚并有表皮突下延，雄性和雌性小鼠皮膚組織病理學(xué)變化相似。選取HE切片400 ×的視野，使用photoshop圖片處理軟件在每個(gè)視野中隨機(jī)量取3處表皮的垂直距離，取其平均值，分析IMQ誘導(dǎo)的雄性和雌性小鼠表皮增厚情況。由圖3 B可知，與對(duì)照組小鼠表皮厚度(12.5±2.3)μm比較，IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠表皮厚度(55.4±1.1)μm(F=4.757，P<0.001)和雌性小鼠表皮厚度(52.3±2.8) μm(F=1.488,P<0.001)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠表皮厚度比較，IMQ誘導(dǎo)的雌性小鼠表皮厚度增加差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=6.805,P>0.05)。

2.4 小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)測(cè)定由圖4 A可知，與對(duì)照組小鼠脾臟指數(shù)比較(3.6±0.8)，IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠脾臟指數(shù)(10.1±0.9)(F=1.350，P<0.001)和雌性小鼠脾臟指數(shù)(9.6±1.0)(F=1.742，P<0.001)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠脾臟指數(shù)比較，IMQ誘導(dǎo)的雌性小鼠脾臟指數(shù)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.2，P>0.05)。由圖4 B可知，與對(duì)照組小鼠胸腺指數(shù)比較(2.5±0.5)，IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠胸腺指數(shù)(2.7±0.3)(F=2.564，P>0.05)和雌性小鼠胸腺指數(shù)(2.7±0.4)(F=1.7，P>0.05)變化差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠胸腺指數(shù)比較，IMQ誘導(dǎo)的雌性小鼠胸腺指數(shù)變化差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=10.2，P>0.05)。

圖4 IMQ誘導(dǎo)的小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)

A：脾臟指數(shù)；B：胸腺指數(shù)：a：對(duì)照組；b：模型組1；c：模型組2；與對(duì)照組比較：***P<0.001

2.5 免疫組化法檢測(cè)小鼠皮膚PCNA的表達(dá)PCNA為增殖細(xì)胞核抗原，可以反映角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖程度，由圖5 A (a)可知，對(duì)照組小鼠PCNA在表皮基底層呈一層線性排列,由5 A (b、c)可知IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠和雌性小鼠PCNA表達(dá)均增多，呈多層排列。由圖5 B可知，與對(duì)照組小鼠PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量(44.3±4.2)個(gè)比較，IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量(102.3±5.8)個(gè)(F=1.9，P<0.001)和IMQ誘導(dǎo)的雌性小鼠PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量(96±10.0)個(gè)(F=5.7，P<0.05)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而與IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量比較，IMQ誘導(dǎo)的雌性小鼠PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.0，P>0.05)。

2.6 免疫熒光法檢測(cè)小鼠皮膚內(nèi)披蛋白的表達(dá)內(nèi)披蛋白是角質(zhì)形成細(xì)胞分化的標(biāo)志性蛋白，陽(yáng)性表達(dá)呈綠色熒光。由圖6 A可知，對(duì)照組小鼠內(nèi)披蛋白表達(dá)分布在角質(zhì)層和棘層上方，由圖6 B、C可知，IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠和雌性小鼠內(nèi)披蛋白表達(dá)增強(qiáng)且在表皮各層均有分布。

3 討論

目前銀屑病病理機(jī)制的探究和新的抗銀屑病治療藥物的開(kāi)發(fā)已經(jīng)取得了較大的進(jìn)展，但仍有待進(jìn)一步研究。開(kāi)發(fā)與人類(lèi)銀屑病相似的動(dòng)物模型有利于加速這一進(jìn)程，目前銀屑病動(dòng)物模型主要有：自發(fā)型動(dòng)物模型、誘導(dǎo)型動(dòng)物模型、轉(zhuǎn)基因型動(dòng)物模型、以及異體種植模型[6-7]。IMQ是toll樣受體激動(dòng)劑，主要用于人乳頭瘤病毒引起的生殖器和肛周疣的局部治療。臨床發(fā)現(xiàn)IMQ會(huì)加重控制良好的銀屑病患者的病情，這不僅發(fā)生在治療區(qū)域，也發(fā)生在之前未受影響的遠(yuǎn)處皮膚部位。研究[8-9]發(fā)現(xiàn)使用IMQ涂抹小鼠皮膚，可使小鼠產(chǎn)生類(lèi)似人類(lèi)銀屑病的皮膚表型和組織病理學(xué)變化。且IMQ 誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型具有運(yùn)用廣泛、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，故課題組建立IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。

圖5 IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮膚PCNA的表達(dá)

A：小鼠皮膚PCNA的表達(dá) 免疫組化×400；B：PCNA陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)數(shù)量；a：對(duì)照組；b：模型組1；c：模型組2；與對(duì)照組比較：**P<0.01，*P<0.05

圖6 IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮膚內(nèi)披蛋白的表達(dá) 免疫熒光×800

性別差異在免疫反應(yīng)中的機(jī)制復(fù)雜，可能涉及性激素對(duì)免疫、遺傳以及性別特異性行為和暴露等影響。雌激素通過(guò)影響T細(xì)胞和B細(xì)胞的發(fā)育以及自身反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞的存活等增加自身免疫的風(fēng)險(xiǎn)[10]。在多種自身免疫疾病如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)系紅斑狼瘡中女性的發(fā)病率均明顯高于男性。而在許多與自身免疫疾病有關(guān)的動(dòng)物模型的研究中，性別差異也會(huì)對(duì)模型的建立造成一定的影響，如在自發(fā)性糖尿病Torii-Leprfa大鼠中，葡萄糖和脂質(zhì)異常、性功能障礙、微血管病以及骨質(zhì)疏松癥等均存在性別差異的影響[11-12]。但是在IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型中性別差異對(duì)模型建立的影響尚未報(bào)道。為了探究這一問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)分別選用雄性小鼠和雌性小鼠建立銀屑病模型，從小鼠皮損改變、皮損PASI評(píng)分、小鼠皮膚組織病理學(xué)改變、脾臟和胸腺指數(shù)變化以及角質(zhì)形成細(xì)胞增殖和異常分化等來(lái)評(píng)價(jià)IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型，并探究性別差異是否對(duì)該模型的建立產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與對(duì)照組小鼠相比，IMQ誘導(dǎo)的雄性小鼠和雌性小鼠皮膚均表現(xiàn)出紅斑、鱗屑、增厚、并在1～5 d持續(xù)加重，PASI評(píng)分也呈相同結(jié)果。從小鼠皮膚組織病理學(xué)上觀察可知，IMQ誘導(dǎo)的小鼠表皮增厚、表皮淺層可見(jiàn)毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、角質(zhì)層可見(jiàn)角化不全、顆粒層變薄甚至消失、棘層肥厚并有表皮突下延，雄性小鼠和雌性小鼠皮膚組織病理學(xué)變化相似。同時(shí)IMQ誘導(dǎo)的小鼠脾臟指數(shù)增大，雄性和雌性小鼠脾臟指數(shù)變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從PCNA和內(nèi)披蛋白的表達(dá)情況可知，IMQ誘導(dǎo)的小鼠角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)數(shù)量增多，且存在異常分化現(xiàn)象，雄性小鼠和雌性小鼠PCNA和內(nèi)披蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果均顯示 IMQ誘導(dǎo)的小鼠皮膚紅斑、增厚、鱗屑、表皮改變(棘皮癥，角化不全)方面非常類(lèi)似于人類(lèi)型銀屑病，且性別差異對(duì)IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型幾乎沒(méi)有影響。因此IMQ誘導(dǎo)的小鼠銀屑病模型可以為銀屑病機(jī)制研究和抗銀屑病藥物開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并且在使用IMQ誘導(dǎo)小鼠銀屑病模型時(shí)，可以不用考慮小鼠性別差異對(duì)模型建立的影響。