CYFIP1表達與肝細胞性肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究

顧 炯, 崔 笑, 侯 輝, 喻宗繁, 張 彬, 熊奇如

與其他常見腫瘤相比，肝細胞性肝癌(hepatocarcinoma，HCC)惡性程度較高、易復(fù)發(fā)，而且治療方式有限，患者預(yù)后較差，生存期較短[1]。細胞信號通路如PI3K-AKT-mTOR、JAK-STAT、Wnt/β-catenin等[2]已被證實在HCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，腫瘤分子靶向治療也成為近年來的研究熱點。針對HCC的分子靶向藥物如索拉非尼、樂伐替尼等在臨床治療中得到了越來越多的應(yīng)用，但是分子靶向治療的效果不盡如人意，部分藥物治療后期耐藥率較高[3]。因此，需要對HCC發(fā)病的分子機制進行進一步研究，幫助發(fā)現(xiàn)更有效的靶向藥物或治療方法。

細胞內(nèi)mRNA翻譯通常有2種途徑：Cap-依賴型和非Cap-依賴型。Cap-依賴型mRNA翻譯異常與很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[4]。在Cap-依賴型mRNA翻譯進程中，起始階段的調(diào)控作用尤其重要，主要參與的調(diào)控因子有：真核起始因子復(fù)合物4F (eukaryotic initiation factor 4F，EIF4F) 以及CYFIP1-EIF4E-FMR1復(fù)合物[5-6]。其中細胞質(zhì)FMR1相關(guān)蛋白1(cytoplasmic FMR1-interacting protein 1，CYFIP1)被證實是一些腫瘤如鼻咽癌、乳腺癌等的潛在抑制因子[4,7]，但是CYFIP1在HCC發(fā)病中的作用目前尚不清楚。故該研究主要探討CYFIP1的表達與HCC臨床特征之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織標本與病例資料 組織標本取自安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院的標本庫，并制作成組織芯片。共納入4張組織芯片，包括80例HCC患者的腫瘤組織以及對應(yīng)的癌旁正常組織。80例患者均經(jīng)病理檢查證實為HCC，且在采集組織時，均未進行除手術(shù)以外的任何抗腫瘤治療，如肝靜脈插管化療栓塞和灌注(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)等；同時收集納入患者的臨床資料以及隨訪數(shù)據(jù)。隨訪截止日期為2019年4月1日。本研究符合安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理審查委員會批準。

1.1.2試劑與儀器 超靈敏兩步免疫組織化學(xué)套盒PV-9001(北京中杉金橋)；Rabbit anti-CYFIP1多克隆抗體(ab156016，美國Abcam)；凋亡試劑盒Annexin V:FITC Apoptosis Detection Kit I (556547, 美國BD)等。Western blot顯影儀(Tanon Fine-doX6, 上海)；精密恒溫二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo Fisher, 美國)；酶標儀(KHB ST-360, 美國)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 組織芯片厚度4 μm，封蠟室溫保存。按以下步驟行免疫組化染色：切片置于70 ℃溫箱中烤片1 h，于二甲苯中脫蠟2×3 min，接著分別用無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇、50%乙醇進行梯度脫水處理；抗原修復(fù)采用高壓煮沸方式(枸櫞酸鈉緩沖液，3 min)；用3% H2O2進行內(nèi)源性過氧化物酶阻斷后，1% BSA封閉1 h；4 ℃冰箱中孵育一抗(1 ∶100)過夜；第2天常溫孵育二抗(1 ∶1 000)1 h后，進行DAB染色，顯微鏡下觀察結(jié)果。免疫組化的結(jié)果由2位醫(yī)師分別進行分級(1：最弱；4：最強)。

1.2.2細胞培養(yǎng) 含10%血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基用于HepG2細胞。培養(yǎng)條件為37 ℃、5% CO2。每3 d更換培養(yǎng)基1次。

1.2.3Western blot檢測蛋白表達水平 6孔板中的細胞經(jīng)處理，并提取蛋白。蛋白濃度采用BCA試劑盒測定。電泳凝膠為10%～12% SDS聚丙烯酰胺凝膠。濃縮膠電泳條件為：80 V、30 min ；分離膠電泳條件為：120 V、60 min；轉(zhuǎn)膜條件為：200 mA恒定電流下1 h。5% BSA室溫封閉1 h；4 ℃過夜孵育一抗(1 ∶1 000)；室溫孵育二抗(1 ∶10 000)1 h。

1.2.4流式檢測細胞凋亡 6孔板中的細胞，離心后用1×緩沖液重懸并計數(shù)，將濃度稀釋為1×106個/ml。充分震蕩后，取100 μl細胞懸液加入流式管中，再用5 μl ANNEXIN V和5 μl PI進行細胞標記，室溫下避光孵育15 min，1 h內(nèi)用流式細胞儀進行凋亡檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件。分類變量的數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗；臨床指標與蛋白表達程度的相關(guān)性研究采用多因素方差分析；Log-rank test及Gehan-Breslow-Wilcoxon test用于生存曲線的差異性檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CYFIP1在腫瘤組織中的表達納入的80例HCC患者人口學(xué)特征和臨床基本情況見表1。組織芯片免疫組織化學(xué)染色情況見圖1。與癌旁組織比較，42例患者的腫瘤組織中存在CYFIP1低表達，20例患者組織中存在CYFIP1的高表達，另18例患者腫瘤組織中CYFIP1的表達未見差異。其中在42例低表達的患者中，腫瘤組織CYFIP1的表達量較癌旁正常組織中表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.031)。

圖1 CYFIP1組織芯片免疫組化表達情況 ×100

2.2 CYFIP1在腫瘤組織中的表達與腫瘤組織分化、腫瘤直徑及患者生存期的關(guān)系多因素分析的結(jié)果提示，CYFIP1的表達與患者的腫瘤分級、腫瘤直徑2項臨床指標呈負相關(guān)且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.012、P=0.014)；但是與性別、年齡、血清AFP、HBV-DNA、Child分級等指標的關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) 。見表1。生存分析顯示CYFIP1低表達的患者生存期較差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.018)。見圖2A。

2.3 沉默CYFIP1對HepG2細胞增殖的影響在人肝癌細胞系HepG2中采用siRNA沉默CYFIP1后，Western blot驗證siRNA沉默有效。與陰性對照組(negative control，NC)比較, siRNA沉默CYFIP1后，MTT結(jié)果提示其細胞增殖速度提高(P=0.019)。見圖2B。流式細胞凋亡檢測結(jié)果提示，沉默CYFIP1后細胞中晚期凋亡比例降低(P=0.021)。見圖2C。

表1 CYFIP1表達情況與HCC患者臨床特征的相關(guān)性分析

3 討論

HCC是中國常見的惡性腫瘤之一, 由于HCC的治療難度較大，術(shù)后復(fù)發(fā)率較高，因此針對HCC的分子生物學(xué)機制研究一直是該領(lǐng)域的熱點。CYFIP1作為新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等腫瘤中具有一定的腫瘤抑制作用[6-7,8]，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[9]，但是CYFIP1在肝癌中的作用目前相關(guān)報道有限，因此本研究首次探討了CYFIP1的表達與HCC臨床特征的相關(guān)性。

本研究結(jié)果表明，CYFIP1是HCC的一個抑癌基因，其在HCC患者組織中的表達低于癌旁正常組織。更重要的是，CYFIP1的表達與HCC患者的腫瘤生存期、腫瘤大小以及腫瘤分化程度具有相關(guān)性。這些結(jié)果提示，CYFIP1的表達可能與HCC的發(fā)生發(fā)展具有重要關(guān)聯(lián)，是潛在的治療靶點或臨床監(jiān)測指標。同時，進一步的細胞實驗結(jié)果證實，HCC細胞敲低CYFIP1后，其細胞凋亡水平下降，增殖能力提升，這些結(jié)果進一步證實了CYFIP1是HCC的潛在抑癌基因。

圖2 CYFIP1表達對HCC的發(fā)生發(fā)展的影響

A：CYFIP1表達與HCC患者的生存分析；B：沉默CYFIP1對HepG2細胞增殖的影響；C：沉默CYFIP1的表達對HepG2細胞凋亡的影響

CYFIP1作為Scar/WAVE復(fù)合物的重要組成部分，調(diào)節(jié)細胞骨架蛋白的形成。Scar/WAVE復(fù)合物通過其VCA結(jié)構(gòu)域來接受上游信號蛋白的調(diào)控[10]。也有研究[7,10]表明，下調(diào)腫瘤細胞中的CYFIP1可以引起WASF3的穩(wěn)定失調(diào)，從而誘導(dǎo)細胞侵襲能力的增加。CYFIP1還可能與脆性X智力低下相關(guān)蛋白結(jié)合，進一步調(diào)節(jié)mTOR功能相關(guān)的生物學(xué)功能，如細胞增殖和凋亡等[11]。除此之外，CYFIP1也可與EIF4E結(jié)合，進一步抑制EFI4E:EIF4G復(fù)合物的形成，從而抑制CAP依賴型的mRNA翻譯，并且MNK也調(diào)節(jié)著CYFIP1/FMRP復(fù)合物[12]。本研究首次發(fā)現(xiàn)CYFIP1在HCC中的表達程度及其與HCC患者預(yù)后的相關(guān)性，提示CYFIP1可能是HCC的潛在預(yù)后指標，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。