PLA2R1基因單核苷酸多態(tài)性與IMN的相關(guān)性研究

謝大星，郭廣鳳，張雪琴，姜 鴻，陸 晨

膜性腎病(membranous nephropathy,MN)是成人腎病綜合征最常見的病理類型之一，根據(jù)有無繼發(fā)因素分為特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy，IMN)和繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy，SMN)。約1/3的MN患者在5～10年內(nèi)進(jìn)展至終末期腎臟病，需要腎臟替代治療，給患者及家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，IMN的發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，近年來全基因組關(guān)聯(lián)分析研究[1]檢測(cè)到M型磷脂酶A2受體1(phospholipase A2 receptor 1， PLA2R1)和人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-DQA1區(qū)是MN的主要風(fēng)險(xiǎn)位點(diǎn)，國內(nèi)不同[2-3]地區(qū)陸續(xù)發(fā)表了檢測(cè)MN易感基因位點(diǎn)的文獻(xiàn)，地域差異相同的基因位點(diǎn)對(duì)IMN的易感性也存在差異，新疆處于中國的西北部，關(guān)于MN基因多態(tài)性研究的文獻(xiàn)較少。該研究主要分析新疆地區(qū)人群PLA2R1基因2位點(diǎn)與IMN易感性的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料以2010年1月～2018年12月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院確診的88例IMN和122例種族匹配的在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院體檢中心健康體檢者為研究對(duì)象。IMN組中男66例，女22例，年齡19～76(48.00±13.97)歲；健康對(duì)照組中男88例，女34例，平均年齡21～78(42.83±12.62)歲。病例組納入標(biāo)準(zhǔn)：① 所有患者均行腎活檢，病理檢查包括光鏡、免疫熒光/免疫組化和電鏡；② 診斷標(biāo)準(zhǔn)符合Ehrenreich-Churg膜性腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。排除SMN。所有患者均簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)新疆自治區(qū)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過。收集納入研究對(duì)象腎穿或體檢完善的臨床資料，包括：性別、確診年齡、民族、收縮壓、舒張壓 、白蛋白、24 h尿蛋白、肌酐、尿素氮、尿酸、三酰甘油、總膽固醇、PLA2R抗體等指標(biāo)。

1.2 方法

1.2.1DNA提取 收集研究對(duì)象清晨空腹靜脈血5 ml,EDTA抗凝，-80 ℃冰箱保存，標(biāo)本收集完成后按照DNA試劑盒(北京鼎國公司)實(shí)驗(yàn)步驟提取DNA，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm/280 nm波長的吸光度，使純度在1.80以上，將分裝好的DNA放-80 ℃冰箱保存，最后送新疆歐易公司進(jìn)行競爭性等位基因特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(kompetitive allele specific polymerase chain reaction,KASP)法單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點(diǎn)基因分型。

1.2.2PCR擴(kuò)增及基因分型 將DNA濃度稀釋成為10～20 ng/μl，并將DNA樣品加到384孔PCR板上，然后配制KASP反應(yīng)體系，將KASP反應(yīng)體系加到已含DNA模板的PCR板上，將反應(yīng)板密封后離心，進(jìn)行PCR循環(huán)反應(yīng)，最后在Pherastar SNP分型儀進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取和分析。KASP反應(yīng)體系：反應(yīng)體系5 μl:包含 2×Master mix 2.5 μl、引物預(yù)混液 0.05 μl、 DNA模板 1.0 μl 和ddH2O 1.45 μl,KASP反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 15 min，1個(gè)循環(huán)，變性94 ℃ 20 min，10個(gè)循環(huán)，復(fù)性/延伸61～55 ℃，60 min(每一個(gè)循環(huán)降低0.6 ℃)，10個(gè)循環(huán)，變性94 ℃ 20 min，26個(gè)循環(huán)，復(fù)性/延伸55 ℃ 60 min，26個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 病例資料兩組間性別和民族差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。IMN組中年齡、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇水平高于健康對(duì)照組，白蛋白水平低于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 哈迪-溫伯格平衡定律檢驗(yàn)及KASP分型圖對(duì)2個(gè)位點(diǎn)病例組及健康對(duì)照組進(jìn)行檢驗(yàn)，其中rs4664308位點(diǎn)在病例組和健康對(duì)照組中均不符合哈迪-溫伯格平衡定律，rs3749117位點(diǎn)病例組和健康對(duì)照組基因型數(shù)目的觀察值處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)(P>0.05)，具有群體代表性。rs3749117位點(diǎn)KASP分型圖。見圖1。

2.3 不同基因型在IMN組和健康對(duì)照組間的分布通過χ2檢驗(yàn)比較IMN組和健康對(duì)照組間基因型及等位基因的分布，結(jié)果顯示rs3749117位點(diǎn)基因型及等位基因在病例組和健康對(duì)照組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 IMN和健康對(duì)照組臨床資料比較

圖1 rs3749117位點(diǎn)KASP分型圖

表2 IMN組和健康對(duì)照組PLA2R1基因rs3749117位點(diǎn)基因型分布表[n(%)]

2.4 PLA2R1基因rs3749117位點(diǎn)基因多態(tài)性與IMN臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性rs3749117位點(diǎn)TT基因型組和CT+CC基因型組組間年齡、性別、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇、低密度脂蛋白、白蛋白、尿蛋白差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 rs3749117位點(diǎn)TT基因型組與CT+CC基因型組臨床資料比較

2.5 血清抗PLA2R抗體在PLA2R1基因rs3749117位點(diǎn)基因型的表達(dá)共有70例在腎活檢時(shí)檢測(cè)血PLA2R抗體，男52例，女18例，年齡19～76(47.57±13.79)歲。結(jié)果顯示rs3749117位點(diǎn)TT基因型組與CT+CC基因型組組間PLA2R抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 rs3749117位點(diǎn)不同基因型PLA2R抗體分布情況[n(%)]

2.6 IMN的影響因素分析以是否診斷IMN為因變量，性別、年齡、rs3749117位點(diǎn)TT基因型、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇為自變量進(jìn)行單因素Logistic二元回歸分析， 結(jié)果顯示性別、年齡、rs3749117位點(diǎn)TT基因型、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇均與IMN的發(fā)病相關(guān)，通過校正性別、年齡、收縮壓、舒張壓、尿素氮、肌酐、尿酸、三酰甘油、總膽固醇等指標(biāo)進(jìn)行多因素Logistic回歸分析顯示rs3749117位點(diǎn)TT基因型和年齡可影響IMN的發(fā)生(P<0.05)。見表5。

表5 多因素Logistic回歸分析

2.7 rs3749117位點(diǎn)在不同年齡段與IMN的關(guān)聯(lián)性分析按年齡進(jìn)行分組，18～<40歲77例，40～<60歲98例，≥60歲35例，通過χ2檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)顯示病例組和對(duì)照組中性別、尿酸、三酰甘油和總膽固醇在不同年齡段間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表6。通過分層χ2檢驗(yàn)顯示在18～<40歲年齡段和40～<60歲年齡段中IMN和健康對(duì)照組間基因型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在40～<60歲年齡段攜帶TT基因型的人患IMN的風(fēng)險(xiǎn)高于18～<60歲年齡段(OR1=2.662，95%CI=1.024～6.918;OR2=10.524，95%CI=3.293～28.230)，在≥60歲年齡段中rs3749117位點(diǎn)基因型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7。

表6 不同年齡段中尿酸、三酰甘油和總膽固醇水平比較

表7 rs3749117位點(diǎn)在不同年齡段與IMN的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

2009年Beck et al[5]在IMN患者血清中發(fā)現(xiàn)了PLA2R抗體，PLA2R主要表達(dá)于腎小球足細(xì)胞，是IMN主要的靶抗原，國內(nèi)血清中抗PLA2R抗體陽性率約為70%～80%，近年來國內(nèi)外多地區(qū)發(fā)現(xiàn)PLA2R1基因SNP位點(diǎn)與IMN的易感性相關(guān)[2-3，6-7]，種族及地域差異會(huì)影響基因位點(diǎn)對(duì)IMN的易感性。本研究采用KASP的方法進(jìn)行測(cè)序結(jié)果顯示PLA2R1 SNP rs3749117位點(diǎn)基因型及等位基因頻率在IMN組和健康對(duì)照組間分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs3749117位點(diǎn)多態(tài)性可能與IMN的易感性相關(guān)。rs3749117位點(diǎn)位于5號(hào)外顯子區(qū)域，2號(hào)染色體上，在IMN組中rs3749117位點(diǎn)TT基因型和T等位基因頻率較高，提示TT基因型為IMN的易感基因型，T等位基因?yàn)橐赘械任换?，這與日本學(xué)者Kaga et al[7]及北京地區(qū)Lv et al[3]的研究結(jié)果一致，與印度地區(qū)研究[6]結(jié)果存在差異。

在健康人群中也有一部分人攜帶IMN的易感基因型，但并未發(fā)病，提示IMN的發(fā)病并非單因素，可能是多因素共同作用。Xu et al研究[8]顯示在IMN中PM高于70 μg/m3的區(qū)域中，PM濃度每增加10 μg/m3，pMN的概率就會(huì)增加14%，提示環(huán)境和基因多態(tài)性可影響IMN的發(fā)生。通過分析rs3749117位點(diǎn)基因型與IMN臨床表現(xiàn)顯示基因多態(tài)性并不能影響IMN的臨床表現(xiàn)。血清抗PLA2R抗體滴度是臨床上重要的生物指標(biāo)，抗體滴度與臨床表現(xiàn)相關(guān)，還可評(píng)估免疫緩解，本研究分析顯示rs3749117位點(diǎn)易感基因型組與非易感基因型組中PLA2R抗體陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PLA2R1基因多態(tài)性并不能影響血清PLA2R抗體的表達(dá)，印度學(xué)者Ramachandran et al研究[6]發(fā)現(xiàn)HLA-DQA1 rs2187668位點(diǎn)高風(fēng)險(xiǎn)GG基因型患者血清PLA2R抗體水平較高,Wang et al[9]研究也顯示HLA-DRB1*0301與更高水平的PLA2R抗體相關(guān),提示HLA基因多態(tài)性位點(diǎn)可影響血清抗PLA2R抗體的水平，機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。通過多因素Logistic回歸分析顯示年齡可影響IMN的發(fā)生，當(dāng)年齡每增加一個(gè)單位，患IMN的風(fēng)險(xiǎn)增加1.037倍。本研究進(jìn)行分層χ2檢驗(yàn)顯示在18～<40年齡段和40～<60年齡段中基因型分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在18～<40和40～<60歲年齡段中TT基因型為易感基因型，且攜帶TT基因型較攜帶CT+CC基因的患病風(fēng)險(xiǎn)高(OR1=2.662，95%CI=1.024～6.918;OR2=10.524，95%CI=3.293～28.230)，MN病初次發(fā)病年齡以40歲以上多見，本研究結(jié)果也提示在40～<60歲年齡段中攜帶TT基因型的患病風(fēng)險(xiǎn)高于18～<40歲年齡段，而在≥60歲年齡段中rs3749117位點(diǎn)基因型在IMN和健康對(duì)照間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示rs3749117位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能與老年IMN的發(fā)生無關(guān)。隨著年齡的增長，人體的各個(gè)系統(tǒng)和器官逐漸老化，腎臟的各種功能進(jìn)行性下降，老年人容易合并高血壓、糖尿病和腫瘤等基礎(chǔ)疾病，可能存在其他基因位點(diǎn)或因素影響老年人患MN的風(fēng)險(xiǎn)，目前尚無研究報(bào)道老年MN病的易感基因位點(diǎn)，彭佳楠等的研究[2]同樣也表明年齡可影響IMN的發(fā)生，但并未進(jìn)一步探討，本次研究中rs3749117位點(diǎn)的基因多態(tài)性并不能影響老年人對(duì)IMN的易感性，機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果顯示新疆地區(qū)rs3749117位點(diǎn)可能與IMN的易感性相關(guān)，在18～<40歲和40～<60歲年齡段中基因型TT為IMN的易感基因型,但老年人(≥60歲)中rs3749117位點(diǎn)的基因多態(tài)性可能與老年IMN的發(fā)生無關(guān)，其次rs3749117位點(diǎn)多態(tài)性不能影響臨床表現(xiàn),本次研究為尋找防治IMN 的基因靶點(diǎn)和探討MN病的發(fā)病機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。