類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中IgD通過T細胞刺激B細胞活化

胡曉曦，張愛君，張 靜，吳育晶，魏 偉

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一類常見的慢性自身免疫病，以疼痛、腫脹和小關(guān)節(jié)進行性破壞等為臨床特征[1]。免疫球蛋白D(immunoglobulin D, IgD)于1965年被發(fā)現(xiàn)，包括分泌型 IgD (secreted IgD, sIgD) 和膜結(jié)合型IgD(membrane IgD, mIgD)[2]。在人類和小鼠外周血T細胞上均發(fā)現(xiàn)有IgD受體(immunoglobulin D receptor, IgDR)的存在[3]。課題組通過收集健康對照者和RA患者外周血的研究發(fā)現(xiàn)，IgD通過促進淋巴細胞特異性酪氨酸激酶(lymphocyte-specific protein tyrosine kinase, Lck)的磷酸化引起T細胞的異?；罨痆4]和T細胞亞群Th1/Th2/Th17/Treg比例的失衡[5]。提示IgD在RA病程中起到關(guān)鍵作用，但IgD是否通過活化T細胞，參與B細胞的活化，目前尚無文獻報道。現(xiàn)通過分選和共培養(yǎng)健康對照者和RA患者的T細胞、 B細胞，觀察IgD是否通過T細胞IgDR-Lck信號促進B細胞的活化，為研究IgD在RA中的病理機制提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人外周血標本從安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集30例RA患者及30例健康對照者的外周血標本。RA組入選標準：① 男、女患者均入選；② 年齡30～75歲(52.5±31.82)；③ 符合美國風(fēng)濕病學(xué)會和歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟(ACR/EULAR)2010年推出的RA診斷標準。健康對照組入選標準：① 男、女均入選；② 年齡30～75歲(45.5±20.5)；③ 經(jīng)健康體檢合格。實驗方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準，受試者知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器人IgD蛋白(美國Abcam公司)；CCK-8細胞活性檢測試劑盒；Kit-NH2生物素標記盒(日本同仁化工公司)；人淋巴細胞分離液(北京達科為生物技術(shù)有限公司)；流式抗體：FITC抗人CD4抗體、PE-cy5抗人CD19抗體 (美國BD公司)；PE-cy7 鏈霉親和素?zé)晒舛?美國Biolegend公司)；Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG熒光二抗(南京福麥斯生物公司)；Western 一抗：Lck、p-Lck(tyr394)、β-actin；山羊抗兔IgG 二抗(美國Affinity Biosciences公司)；Infinite M1000 PRO多功能酶標儀(瑞士TECAN公司)；BD FACSAAriaTMⅡ分選型流式細胞儀(美國BD公司)；Image Quant熒光及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國GE公司)；3-30K 高速低溫離心機(美國Sigma公司)； Leica TCS SP8激光共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1IgD蛋白的生物素標記 制備檢測IgDR的一抗，按照Kit-NH2生物素標記盒說明書步驟將人IgD蛋白標記生物素后，分裝-20 ℃保存。

1.3.2人外周單個核細胞的制備 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)與外周血等體積混合，混合液輕輕平鋪到等體積分離液的液面上方，水平轉(zhuǎn)子離心機2 500 r/min離心20 min后，小心吸取血漿層與分離層之間的單個核細胞層，加入5～10 ml PBS洗滌細胞1～2次，并計數(shù)。

1.3.3流式細胞儀的分選 100～200 μl的PBS重懸外周血單個核細胞，加入FITC抗人CD4、PE-cy5抗人CD19流式抗體(107細胞/5 μl)，4 ℃，避光孵育30 min，PBS洗滌1次后并按照1×107/ml濃度重懸細胞，并經(jīng)無菌的紗網(wǎng)(300～400目)過濾到5 ml的無菌流式管中，利用分選型流式細胞儀分選并收集CD4+T細胞和CD19+B細胞。

1.3.4CD4+T細胞和CD19+B細胞的共培養(yǎng) ① B細胞對照組：上室加入CD19+B細胞，下室為10% FBS的細胞培養(yǎng)基；② T-B細胞共培養(yǎng)組：上室加入CD19+B細胞，下室加入CD4+T細胞；③ 不同濃度的IgD刺激T細胞組：上室加入CD19+B細胞，下室加入CD4+T細胞和不同濃度IgD (1、3、10 μg/ml)；置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱共培養(yǎng)24 、48 h，觀察IgD刺激的T細胞對B細胞的影響。

1.3.5CCK-8法檢測CD19+B細胞活性 T、B細胞共培養(yǎng)結(jié)束后，收集上室中的CD19+B細胞以每孔100 μl的體積接種于96 孔培養(yǎng)板中。每孔加入10 μl CCK-8試劑，繼續(xù)反應(yīng)1～2 h，培養(yǎng)終止后于酶標儀讀取A450值。

1.3.6激光共聚焦顯微鏡檢測CD4+T細胞IgDR和Lck的共表達 T、B細胞共培養(yǎng)48 h后，收集下室中的CD4+T細胞，水平轉(zhuǎn)子離心機 2 000 r/min 離心10 min后吸棄上清液，加入4%甲醛蔗糖固定液重懸細胞后，室溫固定15 min；水平轉(zhuǎn)子2 000 r/min 離心5 min后吸棄，PBS洗滌后，加入破膜封閉液重懸細胞，室溫放置20 min；水平轉(zhuǎn)子2 000 r/min 離心5 min后吸棄，加入混合稀釋后的一抗(Lck，1 ∶100，IgDR，1 ∶25)，4 ℃孵育過夜；PBS洗滌后，加入混合稀釋后的熒光二抗(Alexa Fluor 488-親和山羊抗小鼠IgG，1 ∶300，PE-cy7鏈霉親和素，1 ∶100)，避光孵育1 h；DAPI染色30 min后用TBST洗滌，水平轉(zhuǎn)子2 000 r/min離心5 min后吸棄上清液(每管留20～30 μl的上清)，重懸細胞后，滴于載玻片上，涂抹均勻后，自然風(fēng)干；加入防淬滅封片劑，蓋上蓋玻片。在Leica TCS SP8共焦60倍油鏡下觀察IgDR與Lck共表達情況，用激光共聚焦Colocalization模塊分析CD4+T細胞IgDR和Lck的共表達百分比。

1.3.7Western blot檢測Lck、P-Lck(tyr394)、CD40L和CD40蛋白的表達 T、B細胞共培養(yǎng)48 h后，收集CD4+T細胞和CD19+B細胞裂解提取蛋白，SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗小鼠(Lck，1 ∶1 000，P-Lck，1 ∶1 000，CD40L，1 ∶500，CD40，1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP標記的羊抗兔二抗(1 ∶1 000)，37 ℃孵育2 h后ECL發(fā)光，暗室中顯影和定影，以 β-actin作為內(nèi)參對照。

2 結(jié)果

2.1 健康對照者中IgD刺激的CD4+T細胞對CD19+B細胞活化的影響IgD(1、3、10 μg/ml)刺激的CD4+T細胞與CD19+B細胞共培養(yǎng)(24、48 h)后，通過收集上室中的B細胞觀察IgD刺激的CD4+T細胞對CD19+B細胞增殖功能的影響。見圖1，在健康對照者中，IgD(1 μg/ml)組(1.049±0.061)、IgD(3 μg/ml)組(1.330±0.029)、IgD(10 μg/ml)組(1.625±0.036)刺激的T細胞與B細胞共培養(yǎng)24 h可刺激B細胞的增殖(FIgD(1 μg/ml)=38.945、FIgD(3 μg/ml)=121.986、FIgD(10 μg/ml)=11.294，P<0.05)；同理IgD(1 μg/ml)組(1.003±0.043)、IgD(3 μg/ml)組(1.234±0.018)、IgD(10 μg/ml)組(1.588±0.030)刺激的T細胞與B細胞共培養(yǎng)48 h可刺激B細胞的增殖(FIgD(1 μg/ml)=114.378、FIgD(3 μg/ml)=438.276、FIgD(10 μg/ml)=6.413，P<0.05)。

2.2 RA患者中IgD刺激的CD4+T細胞對CD19+B細胞增殖的影響進一步我們利用IgD(1、3、10 μg/ml)刺激RA患者的CD4+T細胞與CD19+B細胞共培養(yǎng)(24、48 h)后，收集上室中的B細胞，觀察對其增殖的影響。見圖2，在RA患者中，IgD(1 μg/ml)組(0.710±0.040)、IgD(3 μg/ml)組(0.783±0.037)、IgD(10 μg/ml)組(1.061±0.090)刺激的T細胞與B細胞共培養(yǎng)24 h可刺激B細胞的增殖(FIgD(1 μg/ml)=40.125、FIgD(3 μg/ml)=164.936、FIgD(10 μg/ml)=35.284，P<0.05)；同理IgD(1 μg/ml)組(0.710±0.023)、IgD(3 μg/ml)組(0.966±0.083)、IgD(10 μg/ml)組(1.286±0.122)刺激的T細胞與B細胞共培養(yǎng)48 h可刺激B細胞的增殖(FIgD(1 μg/ml)=60.127、FIgD(3 μg/ml)=235.121、FIgD(10 μg/ml)=8.553，P<0.05)。

圖1 健康對照者中IgD刺激的CD4+T細胞對CD19+B細胞增殖的影響

A：IgD刺激24 h；B：IgD刺激48 h；與Control組比較：*P<0.05,**P<0.01；與T-B cells組比較：#P<0.05,##P<0.01

2.3 IgD對健康對照者中CD4+T細胞Lck、P-Lck(tyr394)蛋白表達的影響T、B細胞共培養(yǎng)48 h后，收集下室中的CD4+T細胞，Western blot法檢測Lck、P-Lck(tyr394)的蛋白表達水平，以 β-actin 作為內(nèi)參對照。見圖3，與健康對照組比較，IgD對CD4+T細胞中Lck總蛋白的表達無影響，IgD(3 μg/ml)組(1.795±0.067)和IgD(10 μg/ml)組(2.314±0.043)可上調(diào)CD4+T細胞中P-Lck(tyr394)蛋白的表達(FIgD(3 μg/ml)=1 589、FIgD(10 μg/ml)=60.941，P<0.01)。

圖2 RA患者中IgD刺激的CD4+T細胞對CD19+B細胞增殖的影響

A：IgD刺激24 h；B：IgD刺激48 h；與Control組比較：*P<0.05,**P<0.01；與T-B cells組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖3 IgD對健康對照者中CD4+T細胞Lck、P-Lck蛋白表達的影響

A：Lck/P-Lck信號通路蛋白的表達；B：Lck/P-Lck蛋白的相對表達量；與Control組比較：**P<0.01

圖4 IgD對健康對照者CD4+T細胞IgDR-Lck共定位的影響 ×400 A：IgDR和Lck的共表達情況；B：IgD刺激組與Control組的共表達率；與Control組比較：**P<0.01

2.4 IgD對健康對照者CD4+T細胞IgDR-Lck共定位的影響T、B細胞共培養(yǎng)48 h后，收集下室中的CD4+T細胞，用紅色熒光(678 nm)標記IgDR，綠色熒光(488 nm)標記Lck，激光共聚焦顯微鏡觀察兩者的共定位情況。見圖4，IgDR和Lck兩種蛋白在CD4+T細胞中共表達，IgD(3 μg/ml)組(52.363±3.907)上調(diào)了兩種蛋白之間的共表達(F=46.063，P<0.01)。

2.5 IgD對健康對照者中共刺激分子CD40L、CD40蛋白表達的影響T、B細胞共培養(yǎng)48 h后，分別收集上室CD19+B細胞、下室CD4+T細胞進行裂解，Western blot法檢測CD4+T細胞中CD40L蛋白以及CD19+B細胞中CD40蛋白的表達水平。見圖5、6，IgD(3 μg/ml)組(1.152±0.035)和IgD(10 μg/ml)組(1.423±0.043)均可上調(diào)健康對照者CD4+T細胞中CD40L蛋白的表達(FIgD(3 μg/ml)=1.884、FIgD(10 μg/ml)=3.748，P<0.01)；IgD(3 μg/ml)組(1.303±0.033)和IgD(10 μg/ml)組(1.335±0.045)均可上調(diào)健康對照者CD19+B細胞中CD40蛋白的表達(FIgD(3 μg/ml)=145.535、FIgD(10 μg/ml)=333.104，P<0.05)。

2.6 IgD對RA患者中共刺激分子CD40L、CD40蛋白表達的影響T、B細胞共培養(yǎng)48 h后，分別收集上室CD19+B細胞、下室CD4+T細胞進行裂解，Western blot法檢測CD4+T細胞中CD40L蛋白以及CD19+B細胞中CD40蛋白的表達水平。 見圖7、8，與健康對照者觀察結(jié)果一致，IgD(3 μg/ml)組(1.733±0.199)和IgD(10 μg/ml)組(2.043±0.186)均可上調(diào)RA患者CD4+T細胞中CD40L蛋白的表達(FIgD(3 μg/ml)=295.386、FIgD(10 μg/ml)=157.900，P<0.01)；IgD(3 μg/ml)組(1.715±0.048)和IgD(10 μg/ml)組(2.050±0.129)均可上調(diào)RA患者CD19+B細胞中CD40蛋白的表達(FIgD(3 μg/ml)=15.741、FIgD(10 μg/ml)=29.795，P<0.01)。

圖5 IgD對健康對照者中CD4+T細胞CD40L蛋白表達的影響

A：CD40L蛋白的表達；B：CD40L蛋白的相對表達量；與Control組比較：**P<0.01

圖6 IgD對健康對照者中CD19+B細胞CD40蛋白表達的影響

A：CD40蛋白的表達；B：CD40蛋白的相對表達量；與Control組比較：**P<0.01；與 T+B cells組比較:#P<0.05

3 討論

課題組已發(fā)現(xiàn)IgD可濃度依賴性與CD4+T細胞上的IgDR結(jié)合，利用流式細胞術(shù)檢測IgD與CD4+T細胞上IgDR結(jié)合的KD值是7.25×10-10(mol/L)[6]。Lck主要存在T細胞中，參與T細胞的發(fā)育、分化、活化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，是T細胞活化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中最早被激活的上游信號分子之一，在介導(dǎo)T細胞免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵性的作用[7]。文獻報道T細胞上的Lck被活化后，活化的Lck引起免疫受體酪氨酸活化基序 (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs, ITAMs)的磷酸化，磷酸化的ITAMs可作為ZAP70(zeta-associated protein 70)SH2結(jié)構(gòu)域的對接位點，引起ZAP70的活化以及磷酸化[8-9]，進而激活下游信號PI3K(phosphatidylinositol 3-kinase)的活化以及磷酸化[10]。本文進一步研究發(fā)現(xiàn)，IgDR與Lck在健康對照者的CD4+T細胞上存在共表達，IgD上調(diào)兩種蛋白之間的共表達。提示IgD結(jié)合受體后，IgDR通過結(jié)合Lck并磷酸化Lck位點(tyr394)上調(diào)Lck的活性，活化的Lck通過與IgDR的直接作用引起T細胞的異常活化。

圖7 IgD對RA患者中CD4+T細胞CD40L蛋白表達的影響

A：CD40L蛋白的表達；B：CD40L蛋白的相對表達量；與Control組比較：**P<0.01

圖8 IgD對RA患者中CD19+B細胞CD40蛋白表達的影響

A：CD40蛋白的表達；B：CD40蛋白的相對表達量；與Control組比較：**P<0.01；與T+B cells組比較：##P<0.01

T細胞在RA的免疫應(yīng)答中起到核心樞紐的作用，B細胞、樹突狀細胞以及成纖維樣滑膜細胞都通過與其相互作用參與RA的病理過程[11]。RA患者外周血中的B細胞可以識別抗原并將其呈遞給T細胞。B細胞提供共刺激信號，幫助T細胞活化且分泌細胞因子[12]。T細胞上的CD40L蛋白與B細胞上的CD40蛋白是一對共刺激分子，可以促進T細胞、B細胞之間的相互作用[13]。本文通過T細胞、B細胞共培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，在健康對照者與RA患者中，IgD刺激的T細胞可通過上調(diào)T-B共刺激分子CD40L和CD40的蛋白表達刺激B細胞活化。基于以上結(jié)果，提示IgD可能通過T細胞上IgDR與Lck這兩種蛋白間的直接作用引起T細胞的異?；罨?，活化的T細胞通過共刺激分子CD40L-CD40，誘導(dǎo)B細胞的異?；罨瑓⑴cRA的發(fā)生發(fā)展。本文的研究主要觀察了IgD是通過T細胞IgDR-Lck共表達促進B細胞的活化，其下游信號通路的檢測還有待進一步研究。