miR-21在抗結(jié)核藥物性肝損傷細(xì)胞中的機(jī)制研究

徐 杰，杜 瑩，馬 玉，賈云鵬，吳冬雪，張 咪，王 雪，朱晗瑀，馮福民,2

抗結(jié)核藥物性肝損傷(anti-tuberculosis drug-induced liver injury , ADLI)是異煙肼、利福平、吡嗪酰胺等常用的一線抗結(jié)核藥物在抗結(jié)核治療過(guò)程中產(chǎn)生的最嚴(yán)重也是最受臨床關(guān)注的副作用[1]。目前，在全球范圍內(nèi)抗結(jié)核藥物引起的ADLI占結(jié)核病患者的0.8%～40.0%，并且這種不良用藥反應(yīng)已經(jīng)成為臨床停止抗結(jié)核用藥的重要原因之一[2]，已有研究[3]表明肝損傷發(fā)生時(shí)，藥物在體內(nèi)多種藥物代謝酶(尤其肝藥酶)的作用下引起的炎癥反應(yīng)起著重要作用。核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear factor κB, NF-κB)信號(hào)通路是參與炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路之一，受到某些條件刺激后，NF-κB信號(hào)通路被激活，可以調(diào)控下游炎癥因子的轉(zhuǎn)錄水平，主要炎癥因子為白細(xì)胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor α,TNF-α)等[4-5]。

miR-21是一個(gè)具有炎性作用且在多種疾病中呈高表達(dá)的多功能miRNA分子[6]?，F(xiàn)使用抗結(jié)核藥物刺激人正常肝細(xì)胞(human normal liver cells, HL-7702)，觀察抗結(jié)核藥物致肝細(xì)胞損傷過(guò)程中miR-21與NF-κB的表達(dá)變化，并且通過(guò)敲減和過(guò)表達(dá)miR-21進(jìn)一步檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路調(diào)控的下游炎癥因子的表達(dá)水平與變化情況，深入驗(yàn)證在ADLI發(fā)生發(fā)展中miR-21的作用機(jī)制，從而進(jìn)一步為miR-21在抗結(jié)核藥物性肝損傷中的作用提供新的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料人正常肝細(xì)胞株HL-7702 購(gòu)自上海中科院細(xì)胞所；RPMI 1640 購(gòu)自美國(guó)Corning cellgro公司; 胎牛血清購(gòu)自美國(guó)CLARK公司；異煙肼、利福平、吡嗪酰胺、二甲基亞砜均購(gòu)自日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；青霉素與鏈霉素均購(gòu)自德國(guó)BI公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；miR-21 mimics、inhibitor均由蘇州吉瑪基因公司合成；NF-κB抗體購(gòu)自臺(tái)灣arigo公司；高效RIPA細(xì)胞快速裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司； SDS-PAGE新快速凝膠制備試劑盒、20×TBST洗滌緩沖液均購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物科技有限公司；PVDF膜(0.45 μm)購(gòu)自美國(guó)MilliPore公司；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)abcam公司；PrimeScriPtTM RT Master Mix試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM II PCR試劑盒均購(gòu)自大連TaKaRa公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所； Human IL-6 、TNF-α ELISA試劑盒均購(gòu)自北京冬歌偉業(yè)生物公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組HL-7702為梭形且貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，適合生長(zhǎng)于5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中。將其復(fù)蘇后快速接種于50 ml的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入提前配置好的細(xì)胞培養(yǎng)液6 ml。每天定時(shí)用光學(xué)顯微鏡對(duì)HL-7702細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)以及污染情況進(jìn)行觀察，如HL-7702細(xì)胞生長(zhǎng)正常且無(wú)污染，則每天進(jìn)行細(xì)胞換液1次；當(dāng)細(xì)胞密度為80%左右進(jìn)行細(xì)胞傳代。

細(xì)胞分組情況：空白對(duì)照組(control組)、異煙肼+利福平+吡嗪酰胺三藥聯(lián)合組(藥物組)、藥物+miR-21敲減組(藥物+miR-21 inhibitor組)、藥物+miR-21 過(guò)表達(dá)組(藥物+miR-21 mimics組)、敲減陰性對(duì)照組(inhibitor 陰性對(duì)照組)、過(guò)表達(dá)陰性對(duì)照組(mimics 陰性對(duì)照組)。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染貼壁細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)密度太高或者細(xì)胞傳代次數(shù)太多都會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)染效果產(chǎn)生一定的影響，當(dāng)生長(zhǎng)密度在60%～80%之間且細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果是最佳的。所以，在HL-7702細(xì)胞接種于6孔板時(shí)，每孔需要加入2 ml提前配置好的細(xì)胞培養(yǎng)液使其密度在1×105～2×105個(gè)/ml之間。制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物，在靜置轉(zhuǎn)染復(fù)合物間隙，進(jìn)行細(xì)胞換液，細(xì)胞培養(yǎng)液需提前30 min從4 ℃拿出預(yù)熱，6孔板中每孔加入2 ml。將靜置好的細(xì)胞轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入各孔，輕輕晃動(dòng)混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)12 h。12 h后進(jìn)行細(xì)胞換液，將2 ml提前預(yù)熱的1640細(xì)胞培養(yǎng)液加入control組，其他各實(shí)驗(yàn)組加入2 ml含800 μg/ml藥物的1640培養(yǎng)液，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，24 h后收集每孔細(xì)胞及上清液，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及肝功指標(biāo)檢測(cè)采用HE染色法觀測(cè)細(xì)胞形態(tài)。根據(jù)ALT、AST肝功檢測(cè)試劑盒中的說(shuō)明測(cè)定各組細(xì)胞上清液中的肝功指標(biāo)。

1.5 肝細(xì)胞miR-21、NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表達(dá)檢測(cè)收集細(xì)胞，總RNA提取采用TRIzol法，使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，qRT-PCR使用SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑盒，反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s共40個(gè)循環(huán)。引物的設(shè)計(jì)及合成均來(lái)自生工生物工程(上海)股份有限公司。miR-21表達(dá)水平的檢測(cè)以U6作為內(nèi)參，NF-κB、TNF-α、IL-6表達(dá)水平的檢測(cè)用GAPDH作為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt計(jì)算mRNA表達(dá)水平。見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.6 肝細(xì)胞NF-κB、TNF-α、IL-6的蛋白含量檢測(cè)NF-κB蛋白檢測(cè)采用Western blot法；ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的蛋白含量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化對(duì)照組HL-7702細(xì)胞形態(tài)為梭形或多邊形的正常貼壁細(xì)胞，胞質(zhì)呈飽滿狀態(tài)；藥物組肝細(xì)胞形態(tài)為扁圓且細(xì)胞數(shù)量較少，胞質(zhì)呈皺縮狀態(tài)。而miR-21過(guò)表達(dá)組細(xì)胞進(jìn)一步減少，miR-21敲減組細(xì)胞損傷情況較藥物組略輕。見(jiàn)圖1。

2.2 各組細(xì)胞上清液中ALT和AST的含量比較與control組相比，各組細(xì)胞上清液中ALT、AST含量增加(t=-156.227、-129.715，均P<0.001)，表明藥物組肝細(xì)胞發(fā)生損傷；和藥物組比較，藥物+miR-21 inhibitor組的ALT、AST含量降低(t=-42.325、-50.524，均P<0.001)，藥物+miR-21 mimics組則進(jìn)一步升高(t=-219.504、-180.454，均P<0.001)，表明敲減和過(guò)表達(dá)miR-21可以分別引起抗結(jié)核藥物性肝損傷的減輕與加重。miR-21 mimics陰性對(duì)照組和inhibitor 陰性對(duì)照組則與control組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(mimics 陰性對(duì)照組t=0.391、-0.742，P=0.716、0.521；inhibitor 陰性對(duì)照組t=-0.386、0.631，P=0.719、0.562)，尚不能認(rèn)為mimics和inhibitor對(duì)所培養(yǎng)的人肝細(xì)胞有毒副作用。見(jiàn)表2。

2.3 各組細(xì)胞miR-21和NF-κB、 TNF-α、IL-6的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較與control組比較，藥物組miR-21 mRNA相對(duì)表達(dá)量增高(t=-23.349，P<0.001)，提示miR-21參與到了抗結(jié)核藥物致肝細(xì)胞損傷過(guò)程中；與control組比較，藥物組NF-κB、TNF-α、IL-6 的mRNA表達(dá)均增高(t=-67.352、-78.207、-63.725，均P<0.001)，表明藥物組細(xì)胞出現(xiàn)了炎癥性損傷；與control組比較，mimics 陰性對(duì)照組和inhibitor陰性對(duì)照組miR-21及NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(mimics陰性對(duì)照組t=61.446、80.230、63.218、26.437，均P>0.05；inhibitor陰性對(duì)照組t=71.068、66.989、59.697、37.631，均P>0.05)，尚不能認(rèn)為siRNA對(duì)各指標(biāo)mRNA表達(dá)有影響；藥物+miR-21 mimics組NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA及miR-21相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步增高(t=27.364、-18.693、-44.970、-12.176，均P<0.001)，而藥物+miR-21 inhibitor組NF-κB、TNF-α、IL-6的mRNA及miR-21表達(dá)下降(t=53.442、46.629、46.342、7.201，P<0.001、<0.001、<0.001、0.002)，提示過(guò)表達(dá)miR-21會(huì)通過(guò)增加NF-κB的表達(dá)，進(jìn)而使炎癥因子表達(dá)增加從而加重細(xì)胞炎癥損傷的發(fā)生，敲減miR-21可以通過(guò)降低NF- κB的表達(dá)，進(jìn)而減少炎癥因子表達(dá)從而減輕抗結(jié)核藥物引起的炎癥反應(yīng)。見(jiàn)表3。

圖1 各組細(xì)胞HE染色光鏡圖 ×100

A：control組；B：藥物組；C：藥物+miR-21 mimics組；D：mimics陰性對(duì)照組：E：藥物+miR-21 inhibitor組；F：inhibitor 陰性對(duì)照組

表2 各組細(xì)胞上清液中ALT、AST含量

與control組比較：***P<0.001；與藥物組比較：△△△P<0.001

2.4 各組NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)比較相同的，抗結(jié)核藥物刺激造成HL-7702細(xì)胞NF-κB 、TNF- α、IL-6的蛋白表達(dá)也升高(t=-46.317、-25.200、-14.105，均P<0.001)，表明藥物組細(xì)胞發(fā)生了炎癥反應(yīng)。轉(zhuǎn)染miR-21后，各指標(biāo)蛋白與對(duì)應(yīng)mRNA的變化趨勢(shì)相符，提示過(guò)表達(dá)和敲減miR-21可能影響抗結(jié)核藥物致肝細(xì)胞損傷中炎癥反應(yīng)的發(fā)生(與藥物組比較，藥物+miR-21 inhibitor組t=15.057、-8.755、-4.394，P<0.001、0.001、0.012；藥物+miR-21mimics組t=-5.890、7.313、4.385，P=0.004、0.002、0.012)。見(jiàn)表4。

表3 各組細(xì)胞miR-21及NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

與control組比較：***P<0.001；與藥物組比較：△P<0.05

表4 各組細(xì)胞NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)量比較

與control組比較：***P<0.001；與藥物組比較：△P<0.05

3 討論

miRNA能夠轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，影響幾乎所有的信號(hào)通路，參與多種生理病理進(jìn)程，包括炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖，侵襲和凋亡。許多研究[7]表明，miRNA的異常表達(dá)可能反映細(xì)胞的病理狀態(tài)。其中miR-21是一個(gè)可以在多種疾病中調(diào)控炎癥因子的發(fā)生發(fā)展且具有炎癥作用的多功能miRNA分子，并且在各種人類腫瘤中，miR-21是最常上調(diào)的miRNA之一，包括非小細(xì)胞肺癌、胃癌等[8-9]。同時(shí)，研究[10]證明miR-21的過(guò)表達(dá)是非小細(xì)胞肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素，miR-21也會(huì)在骨質(zhì)疏松個(gè)體中顯著過(guò)表達(dá)。

miR-21基因啟動(dòng)子區(qū)中包含4種NF-κB的反應(yīng)結(jié)合元件，在前列腺癌細(xì)胞中，干擾素誘導(dǎo)的miR-21表達(dá)時(shí)需要NF-κB識(shí)別miR-21的啟動(dòng)子序列然后與其結(jié)合[11]；在非小細(xì)胞肺癌、人乳腺癌和直腸HCT116腫瘤細(xì)胞系中的研究也表明NF-κB可以識(shí)別miR-21的啟動(dòng)子序列，從而激活miR-21調(diào)控下游反應(yīng)[8，12]。

NF-κB是細(xì)胞對(duì)多種生理刺激反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，NF-κB信號(hào)通路參與了炎癥的發(fā)生和發(fā)展，在炎癥損傷的誘導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用[13]，并且NF-κB的高表達(dá)與肝臟疾病的發(fā)病密切相關(guān)[12]。研究[14]表明，通過(guò)靶向NF-κB信號(hào)通路，miR-21可負(fù)性調(diào)節(jié)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷的炎癥反應(yīng)。研究[1]顯示，在抗結(jié)核藥物的作用下，NF-κB對(duì)促炎性因子TNF-α的表達(dá)具有正向調(diào)控作用，使TNF-α過(guò)量產(chǎn)生。此次結(jié)果也顯示，ADLI中炎癥因子TNF-α、IL-6隨NF-κB表達(dá)升高而升高，進(jìn)一步提示肝損傷發(fā)生過(guò)程中藥物在體內(nèi)多種藥物代謝酶(尤其肝藥酶)的作用下可引起的炎癥反應(yīng)且起著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，抗結(jié)核藥物刺激肝細(xì)胞時(shí)，miR-21和NF-κB表達(dá)均呈升高趨勢(shì)，并且在過(guò)表達(dá)miR-21與敲減miR-21兩種作用下，NF-κB表達(dá)水平分別呈升高與降低趨勢(shì)，進(jìn)而影響下游炎癥因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，TNF-α、IL-6的表達(dá)變化與miR-21和NF-κB趨勢(shì)一致，這表明miR-21通過(guò)作用于NF-κB信號(hào)通路來(lái)調(diào)控ADLI中的炎癥反應(yīng)的發(fā)生，其機(jī)制可能是NF-κB通過(guò)識(shí)別miR-21啟動(dòng)子區(qū)并與其結(jié)合從而使miR-21被激活，同時(shí)miR-21的促炎效應(yīng)可通過(guò)正反饋形式來(lái)激活NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而影響下游炎癥因子來(lái)發(fā)揮。

miR-21可降低NF-κB的活性而減輕抗結(jié)核藥物引起的肝細(xì)胞損傷。但實(shí)驗(yàn)只在一種細(xì)胞系HL-7702中進(jìn)行了驗(yàn)證，未考慮細(xì)胞系的多樣性，仍需進(jìn)行其他人正常細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，同時(shí)也需要進(jìn)行更深層次機(jī)制研究來(lái)明確兩者的作用機(jī)制，為抗結(jié)核藥物性肝損傷的防治提供更完善的依據(jù)。