低溫等離子體對骨肉瘤細胞MG63的作用及機制研究

王 園，胡 勇，徐生林，闕玉康

骨肉瘤是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤之一，最常發(fā)生在兒童和青少年長骨的干骺端，大約10%～20%的患者在初次就診時就已經發(fā)生轉移[1-2]。骨肉瘤具有高度侵襲性并可以導致進行性骨質破壞，目前，骨肉瘤患者的主要臨床治療方法仍以手術為主，輔以化療或放療[2]。盡管骨肉瘤患者的治療措施在過去幾十年中有所改善，但5年總體生存率仍然很低(約60%)[3]，因此，迫切需要新的治療方法來減少復發(fā)率，提高患者生存率。低溫等離子體是固體、液體和氣體之后的第四種基本物質狀態(tài)。等離子體是通過聚焦放電產生的部分電離氣體[4]。人們嘗試著使用等離子體來取代或者聯(lián)合傳統(tǒng)的醫(yī)療手段來達到更好的治療效果，這樣不僅可以避免手術或藥物對人體造成的副作用，而且更加快速高效，不會對人體產生明顯傷害。該研究在形態(tài)、增殖和凋亡等方面探討低溫等離子體對骨肉瘤細胞的作用及可能作用機制，為等離子體醫(yī)學在骨肉瘤治療上的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料MG63細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司；實驗所用抗體均購自沈陽萬類生物公司；本研究中使用的等離子體裝置是一種依賴于空氣的裝置，由中國科學院等離子體物理研究所設計和開發(fā)。

1.2 細胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清、10 000 U/ml 青霉素、10 g/ml鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人骨肉瘤細胞系MG63；細胞培養(yǎng)環(huán)境為 37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱，每2～3 d傳代1次，取對數期生長細胞用于實驗。

1.3 低溫等離子體處理取指數生長的貼壁的骨肉瘤細胞MG63，用低溫等離子體處理，其工作電壓為10 kV，因為其裝置中存在兩個10 MΩ電阻，所以其工作電流為5 mA，其中裝置與培養(yǎng)基液面之間等距離為2 cm。低溫等離子體處理細胞的時間分別為0、2、4、8 min，處理后將細胞置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h,然后更換培養(yǎng)基并進行下一步實驗。

1.4 方法

1.4.1顯微鏡觀察低溫等離子體對MG63細胞結構的作用 低溫等離子體處理骨肉瘤MG63細胞后，胰酶消化，使其呈細胞懸液。 細胞計數調準濃度為5×104個/ml，每孔500 μl接種MG63細胞株于35 mm板內。用低溫等離子體處理相應時間后孵育2 h更換培養(yǎng)基置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的環(huán)境培養(yǎng)24 h后，用Zeiss Axiovert 200M倒置顯微鏡觀察并攝像。

1.4.2噻唑藍(MTT)法 低溫等離子體處理骨肉瘤MG63細胞后，胰酶消化，使其呈細胞懸液。 細胞計數調準濃度為5×104個/ml，每孔500 μl接種MG63細胞株于35 mm板內，每組設3個復孔。用低溫等離子體處理相應時間后孵育2 h更換培養(yǎng)基置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的環(huán)境培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl 5% MTT溶液，再次置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入200 μl DMSO，在水平搖床上避光振蕩10 min，使MTT還原物完全溶解，用酶標儀在560 nm處測定各孔吸光度(OD)值。腫瘤細胞存活率=等離子處理組OD值/未處理組OD值×100%。

1.4.3克隆形成實驗 在低溫等離子處理MG63細胞2 h后，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞懸液。然后將細胞懸液接種到含10 ml，37 ℃預溫培養(yǎng)液的10 cm皿中。并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置于37 ℃，5% CO2飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2～3周。當培養(yǎng)皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。加1 ∶3醋酸/甲醇5 ml，固定15 min。然后去固定液，加適量Giemsa應用染色液染色10～30 min，用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，計數克隆形成數(A值)，腫瘤克隆形成率=等離子處理組A值/未處理組A值×100%。

1.4.4流式細胞儀檢測 流式細胞儀檢測轉染低溫等離子體對骨肉瘤MG63細胞凋亡的影響。各組膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸酯(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide , PI)雙染，同時設置未染色空白對照管、單染Annexin V-FITC管及單染PI管。并置于冰上，避光條件下室溫靜置10 min，加入400 μl×Binding Buffer，輕輕混勻，并在30 min內進行檢測。以未染色空白細胞為基準調零機器，以Annexin V-FITC單染管和PI單染管做為基準參照，測定每個上樣EP管的數據。采用Flowjo-v 10軟件進行參數獲取和資料分析，計算凋亡細胞百分比。

1.4.5Westen blot 將細胞密度調整為1×105/ml接種于6孔板中，待細胞貼壁后進行低溫等離子體處理相應時間后孵育2 h。更換培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞。使用細胞裂解劑提取蛋白，并用BCA進行蛋白定量，將40 μg蛋白質在10% SDS-PAGE上電泳并轉移至PVDF膜。用TBST緩沖液和5%(M/V)脫脂奶粉封閉，將膜在4 ℃下用Caspase-3(1 ∶500)、cleaved Caspase-3(1 ∶1 000)一抗孵育過夜。洗滌后，將印跡與辣根過氧化物酶綴合的山羊抗兔IgG二抗(1 ∶5 000)在室溫下孵育45 min。用TBST洗滌后，使用ECL+化學發(fā)光試劑盒在暗室曝光。將膠片進行掃描，用凝膠圖像處理軟件分析目標條帶的光密度值。

2 結果

2.1 低溫等離子體影響細胞形態(tài)通過顯微鏡觀察到低溫等離子體處理骨肉瘤細胞改變了細胞形態(tài)，與未處理組細胞相比，低溫等離子體處理時間在4 min時細胞的出現皺縮，并有少量細胞開始漂浮在細胞培養(yǎng)基中。當暴露時間達到8 min，梭形細胞變圓并且萎縮，并且更多細胞懸浮在培養(yǎng)基中(圖1)。

圖1 不同處理時間的CAP對骨肉瘤細胞

不同的CAP處理時間：A.0 min；B.2 min；C.4 min；D.8 min

2.2 低溫等離子體對細胞增殖能力影響通過MTT法發(fā)現隨著低溫等離子體處理MG63的時間延長細胞的存活率下降，當處理時間達到8 min時細胞的存活率為(16.93±5.970)%，與未處理組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=8.41,P<0.05)。通過克隆形成實驗發(fā)現隨著低溫等離子體處理MG63的時間延長，細胞的克隆形成率下降，當處理時間達到8 min時細胞的克隆形成率(8.043±2.228)%，與未處理組間比較差異有統(tǒng)計學意義(t=7.74,P<0.05)，見圖2。

2.3 低溫等離子體誘導細胞凋亡通過流式細胞儀發(fā)現隨著低溫等離子體處理MG63的時間延長細胞的存活率下降，當處理時間達到8 min時細胞的凋亡率為(73.94±3.88)%，與未處理組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F=5.53,P<0.05)，見圖3。通過Westen blot法發(fā)現隨著低溫等離子體處理MG63的時間延長Caspase-3蛋白表達量減少，cleaved Caspase-3蛋白表達量增加，且cleaved Caspase-3/Caspase-3比率隨著處理時間的延長而增加，當處理時間達到8 min時細胞的cleaved Caspase-3/Caspase-3比為(1.33±0.24)，與未處理組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=2.19,P<0.05)，見圖4。

圖2 不同處理時間的CAP對骨肉瘤MG63細胞增殖的影響

不同的CAP處理時間處理骨肉瘤MG63細胞后克隆形成的照片；A:0 min；B:2 min；C:4 min；D:8 min；E. MTT法檢測骨肉瘤MG63細胞存活率的結果統(tǒng)計圖；F.MTT法檢測骨肉瘤MG63細胞克隆形成率的結果統(tǒng)計圖；與未處理組比較:**P<0.01

3 討論

等離子體包含各種物理和化學成分，包括電場、離子、光子、自由基和其他未知的活性物質[5]。傳統(tǒng)等離子體只能在高溫下用于工業(yè)。溫度超過10 000 ℃。低溫等離子體溫度范圍為20～50 ℃，從而保持分子結構和細胞完整性[6]。報告顯示低溫等離子體可用于傷口愈合[7]和滅菌[8]等。低溫等離子體的抗癌能力已成為研究人員的熱門話題，包括恢復化療耐藥癌細胞的敏感性[9]。

圖3 CAP誘導骨肉瘤細胞MG63凋亡

A：CAP處理細胞后流式圖；B:CAP各個處理時間誘導細胞凋亡率的統(tǒng)計圖；與未處理組比較:*P<0.05，**P<0.01

圖4 CAP促進骨肉瘤細胞MG63凋亡蛋白的表達

A：CAP處理細胞后的Caspase-3和cleaved Caspase-3蛋白表達情況；B:CAP各個處理時間后cleaved Caspase-3/Caspase-3表達量比值的統(tǒng)計圖；與未處理組比較:*P<0.05，**P<0.01

近年來隨著對骨肉瘤治療水平的提高，保肢手術得到了極大的發(fā)展[10]。但伴隨而來腫瘤復發(fā)和遠處轉移也成為了困擾骨科醫(yī)生的問題，僅僅靠最大程度上的切除和新輔助化療并不能降低這一事件的發(fā)生幾率[11]。Takeuchi et al對461例骨肉瘤患者進行了長期隨訪，結果顯示45例復發(fā)患者5年存活率30%，10年存活率只有13%[12]。因此期望通過低溫等離子體對手術中肉眼不可見殘留腫瘤細胞殺滅，達到控制腫瘤復發(fā)目的。已有研究表明[13-16]，低溫等離子體在體內或體外實驗中能夠抑制多種腫瘤細胞的增殖。在此次研究中，首先通過MTT法，檢測低溫等離子體對骨肉瘤細胞的具有明顯的增殖抑制效果，結果表明骨肉瘤細胞經低溫等離子體處理，細胞的生長受到了明顯的抑制，細胞的抑制率最高可以達到90%以上，同時還發(fā)現等離子體對細胞的增殖的抑制呈明顯的劑量依賴性。細胞克隆形成實驗也驗證了這一結果。

對于低溫等離子體誘導癌細胞凋亡已有多例報道，如Kim et al研究不同強度等離子體對人結腸癌細胞HCT-116、SW480和 LoVo的作用，發(fā)現該等離子體可以有效的誘導三種結腸癌細胞凋亡[17]；Ahn et al用低溫等離子體成功誘導了人宮頸癌細胞Hela的凋亡[18]。本次研究證明了低溫等離子體對骨肉瘤細胞活力具有顯著的抑制效果。為了證明其抑制作用可以通過程序性細胞凋亡來實現低溫等離子體激活的林格氏溶液誘導MG63細胞死亡，通過流式細胞儀觀察Annexin V/ PI對細胞的雙染情況，本次研究的結果也顯示等離子體處理所引起的凋亡早期和凋亡晚期的細胞量均多于無處理對照組，表明等離子體處理可以誘導骨肉瘤細胞凋亡，且這種凋亡作用同樣也呈明顯的劑量依賴性。為了進一步確定低溫等離子體誘導細胞凋亡信號通路，在本次研究中，Western blot結果表明凋亡蛋白Caspase-3和cleaved Caspase-3的表達同樣呈劑量依賴性。

綜上所述，低溫等離子體對人骨肉瘤細胞具有很好的殺傷作用，為臨床上治療骨肉瘤細胞提供了新的思路和方法，低溫等離子體對人骨肉瘤細胞的殺傷作用的機制可能是誘導細胞凋亡但具體的誘導凋亡的原因還有待進一步研究。