血小板反應(yīng)蛋白-1對(duì)人牙周膜成纖維細(xì)胞表達(dá)IL-6及COX-2的影響

劉笑笑，沈振國(guó)，趙榮權(quán)，邢 田，侯愛(ài)兵

慢性牙周炎是口腔常見(jiàn)的細(xì)菌感染性疾病，已成為成人牙齒缺失的重要原因?？谇晃⑸锔腥緸槭紕?dòng)因子，可直接造成牙周組織破壞，也可引發(fā)宿主免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，釋放大量炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子，間接造成牙周組織破壞。血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin,TSP)-1是Baenziger et al[1]1971年從凝血酶激活的血小板α顆粒中分離出來(lái)的糖蛋白，繼而發(fā)現(xiàn)多種類別的細(xì)胞均可表達(dá)[2]。近年來(lái)研究[3]發(fā)現(xiàn)，TSP-1在感染和炎癥免疫性疾病中具有促炎抗炎、調(diào)節(jié)免疫、局部組織重建等重要作用。2014年Gokyu et al[4]發(fā)現(xiàn)，深牙周袋的患者的牙齦組織，TSP-1 mRNA的表達(dá)水平要高于淺的牙周袋和正常牙周的牙齦組織。

現(xiàn)通過(guò)絲線結(jié)扎法構(gòu)建大鼠牙周炎模型[5]，檢測(cè)大鼠牙齦組織中TSP-1的表達(dá)水平。分離培養(yǎng)原代人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblast, hPDLFs)，通過(guò)添加重組TSP-1蛋白(recombinant TSP-1 protein, rTSP-1)或過(guò)表達(dá)TSP-1質(zhì)粒至hPDLFs，觀察hPDLFs表達(dá)白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6，環(huán)氧酶(cyclooxygenase, COX) -2的變化，從而進(jìn)一步探討TSP-1在慢性牙周炎進(jìn)展中的重要作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)6周齡雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量200～250 g，分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。室溫保持在22～24 ℃，濕度50% ～ 60%，每12 h 變換晝夜節(jié)律，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1. 2 材料腺病毒(上海漢恒生物科技有限公司)；rTSP-1(美國(guó)R&D公司)；牙齦卟啉單胞菌(porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)(美國(guó)invivogen公司)；兔抗vimentin、兔抗keratin、兔抗TSP-1、兔抗COX-2抗體(美國(guó)abcam公司)；鼠抗β-actin抗體(武漢三鷹公司)；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG抗體(北京中杉金橋公司)；qRT-PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；人IL-6 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)。體式顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Agilent公司)；化學(xué)發(fā)光成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎模型建立 隨機(jī)取6只大鼠為正常組，剩余6只大鼠以10%的水合氯醛按3 ml/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉。使用3-0絲線結(jié)扎雙側(cè)上下頜第一磨牙頸部1圈，結(jié)扎絲盡量靠近齦緣，于舌腭側(cè)打結(jié)。正常組不做處理。成功結(jié)扎4周后，所有大鼠腹腔注射過(guò)量10%水合氯醛處死，取雙側(cè)上下頜組織(牙齦、牙槽骨、牙齒)。

1.3.2骨喪失量測(cè)量 將大鼠上下頜骨置于1 mol/L的NaOH溶液中去除軟組織。用10 g/L的甲苯胺藍(lán)染色，體式顯微鏡下觀察并測(cè)量骨喪失(alveolar bone loss，ABL)情況，即測(cè)量釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂?shù)木嚯x。每個(gè)實(shí)驗(yàn)牙分別測(cè)量頰、腭(舌)側(cè)的近、中、遠(yuǎn)6個(gè)位點(diǎn)，取6個(gè)位點(diǎn)的均值作為實(shí)驗(yàn)牙的ABL值。

1.3.3hPDLFs的分離培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)所涉及的牙經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)同意。取12～18歲因正畸減數(shù)拔除的健康前磨牙，在無(wú)菌環(huán)境下PBS緩沖液及DMEM培養(yǎng)基各沖洗3次，運(yùn)用組織塊法刮取根中1/3部位的牙周膜組織，剪成1 mm3的組織塊，置于含20%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，2 d換液1次，待組織塊游出的細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，胰酶消化并傳代。取狀態(tài)較好的3～8代的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4hPDLFs的免疫組化鑒定 取第3代hPDLFs培養(yǎng)于鋪有蓋玻片的6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿蓋玻片70%時(shí)，取出蓋玻片，采用免疫組化法進(jìn)行角蛋白和波形絲蛋白染色，光鏡下觀察染色結(jié)果。

1.3.5P.gingivalisLPS(10 μg/ml)誘導(dǎo)hPDLFs 將hPDLFs以1×105/ml的密度鋪至6孔板中，分為2組:① 空白對(duì)照組；②P.gingivalisLPS組。

1.3.6攜帶TSP-1基因的重組腺病毒(Ad-TSP-1-GFP)體外轉(zhuǎn)染hPDLFs Ad-TSP-1-GFP在感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection, MOI)值為50、100、150及200分別感染細(xì)胞48 h，置于熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，確定最佳MOI值，并以此用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將hPDLFs以1×105/ml的密度鋪至6孔板中，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)結(jié)果時(shí)，同時(shí)用空白對(duì)照和陰性對(duì)照，分為3組：① 空白對(duì)照組；② Ad-GFP組；③ Ad-TSP-1-GFP組。分析Ad-TSP-1-GFP對(duì)hPDLFs炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、COX-2表達(dá)影響時(shí)分組如下：① Ad-GFP組；② Ad-GFP+P.gingivalisLPS組；③ Ad-TSP-1-GFP組。

1.3.7rTSP-1體外刺激hPDLFs 將hPDLFs以1×105/ml的密度鋪至6孔板中，分為3組：① 空白對(duì)照組；②P.gingivalisLPS組；③ rTSP-1組。研究rTSP-1(1 μg/ml)對(duì)hPDLFs炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、COX-2表達(dá)的影響。

1.3.8qRT-PCR檢測(cè)mRNA水平 使用TRIzol試劑提取細(xì)胞、組織總RNA，測(cè)定總RNA的濃度以及純度。以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；qRT-PCR 采用SYBR-Green法，β-actin作為校正內(nèi)參，2-△△Ct法分析基因相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 β-actin、TSP-1、IL-6、COX-2基因RT-PCR引物序列

1.3.9ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6水平 取出-80 ℃保存的細(xì)胞培養(yǎng)上清液, 1 000 r/min離心5 min, 取上清液, 應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)IL-6水平, 操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書。

1.3.10Western blot檢測(cè)蛋白水平 將處理后的組織、細(xì)胞置于冰上裂解，提取總蛋白。取20 μg蛋白樣品上樣，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、牛奶封閉，加一抗TSP-1(1 ∶1 000)、COX-2(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶2 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1 ∶10 000)室溫孵育90 min，ECL發(fā)光顯影。用ImageJ圖像處理軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 大鼠實(shí)驗(yàn)牙ABL檢測(cè)大鼠牙槽骨實(shí)驗(yàn)牙經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后，體式顯微鏡下拍照，見(jiàn)正常組未見(jiàn)明顯骨吸收，牙周炎組骨吸收達(dá)根分叉處(圖1A、B)，測(cè)量后的骨喪失量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示，與正常組比較，牙周炎組骨喪失量增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1C。

圖1 體式顯微鏡觀察測(cè)量牙槽骨骨喪失量 ×20

A：正常組；B：牙周炎組；C：2組牙槽骨喪失量；與正常組比較：***P<0.001

2.2 大鼠牙齦組織中TSP-1、IL-6、COX-2的表達(dá)Western blot檢測(cè)大鼠牙齦組織中TSP-1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示：與正常組比較，牙周炎組TSP-1蛋白表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2A。 qRT-PCR檢測(cè)大鼠牙齦組織中TSP-1、IL-6、COX-2 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示：與正常組比較，牙周炎組TSP-1、COX-2、IL-6 mRNA表達(dá)均不同程度升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖2B。

2.3 hPDLFs的免疫組化鑒定采用組織塊法原代培養(yǎng)hPDLFs，可見(jiàn)多數(shù)細(xì)胞呈梭形放射狀排列，少數(shù)細(xì)胞為多角形或小圓形。免疫組化檢測(cè)顯示，波形絲蛋白染色，胞質(zhì)著色呈棕黃色，結(jié)果呈陽(yáng)性(圖3A)；角蛋白染色，胞質(zhì)不著色，結(jié)果呈陰性，證實(shí)細(xì)胞源自中胚層(圖3B)。

圖2 大鼠牙齦組織TSP-1、IL-6、COX-2表達(dá)變化

A：Western blot法檢測(cè)TSP-1相對(duì)表達(dá)量；B：qRT-PCR法檢測(cè)TSP-1、IL-6、COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量；與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖3 hPDLFs免疫組化 ×100

2.4P.gingivalisLPS促進(jìn)hPDLFs TSP-1表達(dá)Western blot和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，P.gingivalisLPS (10 μg/ml)可促進(jìn)TSP-1蛋白和mRNA表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖4 P. gingivalis LPS促進(jìn)hPDLFs TSP-1表達(dá)

A：Western blot法檢測(cè)TSP-1相對(duì)表達(dá)量；B：qRT-PCR法檢測(cè)TSP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量；1. 空白對(duì)照組；2.P.gingivalisLPS組；與空白對(duì)照組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率以不同MOI值的Ad-TSP-1-GFP轉(zhuǎn)染hPDLFs，轉(zhuǎn)染48 h后觀察GFP表達(dá)情況。當(dāng)MOI為50時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)綠色熒光，熒光強(qiáng)度比較弱，陽(yáng)性細(xì)胞較少。隨著 MOI 的增加，熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，陽(yáng)性細(xì)胞逐漸增多。當(dāng)MOI>150 時(shí)，繼續(xù)增加MOI，但熒光強(qiáng)度的增強(qiáng)不明顯(圖5)，陽(yáng)性細(xì)胞比例基本達(dá)到高峰，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用MOI值為150。

圖5 Ad-TSP-1-GFP 轉(zhuǎn)染 hPDLFs熒光觀察 ×200

A：MOI= 50；B：MOI=100；C：MOI=150；D：MOI=200

2.6 Ad-TSP-1-GFP 轉(zhuǎn)染hPDLFs的效果Western blot和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與Ad-GFP組比較，轉(zhuǎn)染Ad-TSP-1-GFP可提高TSP-1蛋白和 mRNA的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F蛋白=24.14,FmRNA=550.5,P<0.05)。見(jiàn)圖6。

圖6 Ad-TSP-1-GFP轉(zhuǎn)染 hPDLFs TSP-1 的表達(dá)變化

A：Western blot法檢測(cè)TSP-1相對(duì)表達(dá)量；B：qRT-PCR法檢測(cè)TSP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量；1：空白對(duì)照組；2：Ad-GFP組；3：Ad-TSP-1-GFP組；與Ad-GFP組比較：**P<0.01，***P<0.001

2.7 TSP-1促進(jìn)hPDLFs IL-6的表達(dá)轉(zhuǎn)染Ad-TSP-1-GFP 48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA檢測(cè)IL-6蛋白含量，結(jié)果顯示：與Ad-GFP組比較，轉(zhuǎn)染Ad-TSP-1-GFP可提高細(xì)胞IL-6蛋白表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=28.41，P<0.01，圖7A)；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與Ad-GFP組比較，轉(zhuǎn)染Ad-TSP-1-GFP可促進(jìn)IL-6 mRNA 的表達(dá)(F=85.29，P<0.001，圖7B)。在細(xì)胞培養(yǎng)中添加rTSP-1，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測(cè)IL-6含量，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，rTSP-1可活化細(xì)胞，上調(diào)其IL-6蛋白表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.19，P<0.01，圖8A)；qRT-PCR的結(jié)果顯示rTSP-1可促進(jìn)IL-6 mRNA的表達(dá)，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.67，P<0.001，圖8B)。

2.8 TSP-1促進(jìn)hPDLFs COX-2的表達(dá)轉(zhuǎn)染Ad-TSP-1-GFP 48 h，分別收集細(xì)胞提取總蛋白和總RNA。Western blot檢測(cè)hPDLFs COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：與Ad-GFP組比較，轉(zhuǎn)染Ad-TSP-1-GFP可明顯增高COX-2蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.508，P<0.05，圖9A)；qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：與Ad-GFP組比較，轉(zhuǎn)染Ad-TSP-1-GFP可促進(jìn)COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量(F=42.69，P<0.001，圖9B)。在細(xì)胞培養(yǎng)中添加rTSP-1，分別收集細(xì)胞提取總蛋白和總RNA。Western blot檢測(cè)hPDLFs COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，rTSP-1可活化細(xì)胞上調(diào)其COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.954，P<0.05，圖10A)；qRT-PCR的結(jié)果顯示：rTSP-1可促進(jìn)COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量，與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=34.73，P<0.01，圖10B)。

A：ELISA法檢測(cè)IL-6含量；B：qRT-PCR法檢測(cè)IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量；1：Ad-GFP組；2：Ad-GFP+P.gingivalisLPS組；3：Ad-TSP-1-GFP組；與Ad-GFP組比較：**P<0.01，***P<0.001

A：ELISA法檢測(cè)IL-6含量；B：qRT-PCR法檢測(cè)IL-6 mRNA相對(duì)表達(dá)量；1：空白對(duì)照組；2：P.gingivalisLPS組；3：rTSP-1組；與空白對(duì)照組比較：**P<0.01，***P<0.001

圖9 Ad-TSP-1-GFP對(duì)hPDLFs COX-2表達(dá)的影響

A：Western blot法檢測(cè)COX-2相對(duì)表達(dá)量；B：qRT-PCR法檢測(cè)COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量；1：Ad-GFP組；2：Ad-GFP+P.gingivalisLPS組；3：Ad-TSP-1-GFP組；與Ad-GFP組比較：*P<0.05，***P<0.001

3 討論

慢性牙周炎的發(fā)生涉及一系列免疫炎癥反應(yīng)，微生物等通過(guò)活化組織細(xì)胞，釋放細(xì)胞因子，如IL-6、COX-2等，加劇炎癥應(yīng)答[6-7]。IL-6可促進(jìn)血管生成，趨化炎癥細(xì)胞，且能延緩巨噬細(xì)胞的吞噬作用，加重局部炎癥反應(yīng)。COX-2經(jīng)刺激迅速產(chǎn)生，作為高度可誘導(dǎo)性的COX，可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，參與炎癥反應(yīng)，加劇組織破壞。

圖10 rTSP-1對(duì)hPDLFs COX-2表達(dá)的影響

A：Western blot法檢測(cè)COX-2相對(duì)表達(dá)量；B：qRT-PCR法檢測(cè)COX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量；1：空白對(duì)照組；2：P.gingivalisLPS組；3：rTSP-1組；與空白對(duì)照組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

正常生理狀態(tài)下TSP-1表達(dá)水平很低，可限制人巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β，具有一定的免疫自穩(wěn)的作用。當(dāng)組織細(xì)胞受到外源性刺激活化，可大量分泌TSP-1，在病理情況下發(fā)揮重要作用，從而參與真菌、細(xì)菌等微生物感染性疾病和關(guān)節(jié)炎、肺纖維化等炎癥免疫性疾病進(jìn)展[8]。研究[4]發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎齦下菌斑中的P.gingivalisLPS亦可引起人單核細(xì)胞TSP-1的表達(dá)，IL-17能夠顯著促進(jìn)這一蛋白的表達(dá)。本課題組的前期研究[9]也證實(shí)活化的人巨噬細(xì)胞可高表達(dá)TSP-1，繼而通過(guò)NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的分泌水平。

本研究構(gòu)建大鼠牙周炎模型，采集炎癥牙齦組織，檢測(cè)IL-6、COX-2表達(dá)，顯示局部組織中IL-6、COX-2 mRNA表達(dá)升高，同時(shí)TSP-1蛋白和mRNA表達(dá)水平亦升高。hPDLFs是牙周膜中數(shù)目最多，功能最重要的細(xì)胞，不僅作為機(jī)械屏障參與防御，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)作用。本研究體外實(shí)驗(yàn)中，分離培養(yǎng)hPDLFs，用P.gingivalisLPS誘導(dǎo)活化細(xì)胞，TSP-1蛋白和mRNA表達(dá)水平均上調(diào)。結(jié)果表明，除了單核巨噬細(xì)胞之外，活化的hPDLFs也是TSP-1的重要來(lái)源。

之后，本研究構(gòu)建過(guò)表達(dá)TSP-1質(zhì)粒的重組腺病毒，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)hPDLFs自身TSP-1表達(dá)水平，結(jié)果顯示TSP-1基因轉(zhuǎn)染使hPDLFs在蛋白和mRNA水平均表現(xiàn)出TSP-1表達(dá)上調(diào)。同時(shí)，細(xì)胞過(guò)表達(dá)TSP-1后，可促進(jìn)IL-6蛋白和mRNA的表達(dá)，這與重組小鼠TSP-1蛋白促進(jìn)平滑肌細(xì)胞IL-6分泌的相關(guān)研究[10]一致。有研究[11]指出在紫外線輻射導(dǎo)致的皮膚癌中，TSP-1通過(guò)抑制COX-2改善紫外線對(duì)皮膚的損傷。然而在本研究中，增加 hPDLFs自身TSP-1的表達(dá)，可促進(jìn)IL-6和COX-2蛋白和mRNA表達(dá)。隨后，本研究直接在細(xì)胞培養(yǎng)中添加rTSP-1，刺激細(xì)胞24 h后，IL-6、COX-2蛋白和mRNA水平均升高，提示外源性的TSP-1亦可正向調(diào)控細(xì)胞IL-6和COX-2的表達(dá)，且TSP-1對(duì)于IL-6和COX-2的誘導(dǎo)作用與P.gingivalisLPS類似。

綜上所述，慢性牙周炎疾病進(jìn)程中，感染細(xì)菌作為始動(dòng)因子活化hPDLFs，使其高表達(dá)TSP-1，TSP-1繼而作為炎性介質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)hPDLFs牙周炎相關(guān)細(xì)胞因子的釋放。在宿主對(duì)細(xì)菌的應(yīng)答作用中，TSP-1的參與使得局部組織隨著疾病進(jìn)展進(jìn)一步崩解破壞。但目前TSP-1通過(guò)何種途徑調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)，以及在動(dòng)物模型中下調(diào)TSP-1的表達(dá)能否改善牙周局部組織破壞情況，尚需系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)進(jìn)一步的探索。