氯沙坦通過JAK2/STAT3信號(hào)通路在晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的保護(hù)機(jī)制研究

劉少志，袁中文，梅崢嶸，陳 磊，許 俊

我國(guó)糖尿病的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)[1]，患者中大部分為老年人。該病極易引起多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響了大眾的生活質(zhì)量。研究[2]發(fā)現(xiàn)，晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是誘發(fā)糖尿病的主要物質(zhì)之一,能損傷機(jī)體內(nèi)功能性的心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而導(dǎo)致大量白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-β(tumor necrosis factor-β,TNF-β)等炎癥因子[3]的釋放。這些炎性介質(zhì)通過Janus蛋白酪氨酸蛋白激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3(janus protein tyrosine protein kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號(hào)通路使心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖、分化、凋亡等生物學(xué)反應(yīng)[4-5]。氯沙坦是一種血管緊張素的拮抗劑[6]，能控制上述炎性介質(zhì)在JAK2/STAT3信號(hào)通路的表達(dá)水平，在一定程度上能緩解糖尿病。該實(shí)驗(yàn)研究氯沙坦是否能對(duì)大鼠已損傷的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有效保護(hù)，以及JAK2/STAT3信號(hào)通路與炎性介質(zhì)IL-6、TNF-β相關(guān)性的探討,為今后因糖尿病引起的心肌組織損傷尋找有效的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD實(shí)驗(yàn)大鼠40只，4月齡，體質(zhì)量250～280 g，進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分成4組，分別是空白對(duì)照組、AGEs組、AGEs加氯沙坦治療組以及氯沙坦治療組，每組10只。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑MTT檢測(cè)試劑盒(上海來銳賽生物科技有限公司)；IL-6、TNF-β、ELISA試劑盒(武漢默沙克生物科技有限公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；PCR分析儀(美國(guó)ABI公司)；多功能酶標(biāo)儀(上海沛歐分析儀器有限公司)；恒溫箱(廣東宏展科技有限公司)；DNA 提取試劑盒(加拿大Fermentas公司)。

1.3 AGEs的制備精密稱量5.00 g BSA和9.00 g的D-葡萄糖，溶解于100 ml磷酸鹽緩沖溶液中，攪拌溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，放置恒溫箱，避光孵育12周，制備AGEs。以只加BSA作為磷酸鹽緩沖溶液為對(duì)照溶液。孵育結(jié)束后，將AGEs放入無菌層析袋中，以10倍體積磷酸鹽緩沖溶液透析4次，每次6 h，即得。

1.4 大鼠血清的采集大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，隨后每只大鼠腹腔注射1 000 U肝素。腹主動(dòng)脈取血，經(jīng)3 000 r/min，離心15 min后分離上層血清。保存于-80 ℃的冰箱中，用于炎性介質(zhì)的檢測(cè)。

1.5 分離、培養(yǎng)心肌微血管組織細(xì)胞立即分離大鼠心臟，去除大血管、心房和右心室，用磷酸緩沖液洗除殘血。用剪刀剪去剩余游離在左心室壁心內(nèi)膜及心外膜1/3后，剩余心室組織放在75%乙醇溶液浸泡20 s，用磷酸緩沖液沖洗。碎心肌組織，用0.2%膠原酶在37 ℃水浴箱中震蕩孵育大約8 min，繼之以0.25%胰蛋白酶消化大約10 min。采用15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液終止消化。采集濾液離心棄上清液。最后將細(xì)胞懸于15%胎牛血清培養(yǎng)液，接種在鼠尾膠覆蓋的培養(yǎng)瓶中。

1.6 按照分組進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)培養(yǎng)在培養(yǎng)24 h后，按照之前的分組進(jìn)行不同溶液的干預(yù)。其中，空白對(duì)照組(100 μg/ml的BSA溶液)，AGEs組(100 μg/ml AGE-BSA的溶液)，AGEs加氯沙坦治療組(100 μg/ml AGE-BSA的溶液+1.33 mg/ml的氯沙坦)，氯沙坦治療組(1.33 mg/ml的氯沙坦)。

1.7 檢測(cè)方法

1.7.1MTT法檢測(cè)心肌微血管組織細(xì)胞的活力 將分離的細(xì)胞混懸于DMEM培養(yǎng)液和MTT溶液中進(jìn)行4 h孵育，孵育完成后，在490 nm處測(cè)量吸光度，并于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.7.2TUNEL法計(jì)算心肌微血管組織細(xì)胞的凋亡率 將內(nèi)皮細(xì)胞用磷酸鹽緩沖溶液清洗，按照TUNEL檢測(cè)試劑盒說明書操作。于熒光顯微鏡下觀察，用DAPI對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，經(jīng)DAPI染色后的細(xì)胞核呈藍(lán)色，而凋亡的細(xì)胞經(jīng)TUNEL后則呈綠色。計(jì)算綠色細(xì)胞與藍(lán)色細(xì)胞數(shù)量的比值來代表凋亡細(xì)胞數(shù)量占總細(xì)胞數(shù)的比例。

1.7.3ELISA試劑盒測(cè)定血清中IL-6、TNF-β的含量 根據(jù)ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行，完成后在酶標(biāo)儀上測(cè)取吸光值，測(cè)量波長(zhǎng)為450 nm。RT-PCR操作中，細(xì)胞總RNA的提取和cDNA的合成可根據(jù)說明書進(jìn)行。PCR的擴(kuò)增體系：總擴(kuò)增體系(20 μl)，主要包括cDNA(1 μl)，上游引物(10 mmol/L)，下游引物(10 mmol/L)，PCR的預(yù)混物(12.5 μl)，ddH2O補(bǔ)足至25 μl。反應(yīng)條件：95 ℃下首先預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)：變性(95 ℃，30 s)、退火(63 ℃，30 s)、延伸(72 ℃，45 s)，經(jīng)歷32次循環(huán)，最后在72 ℃的條件下延伸5 min。

1.7.4Western Blot與RT-PCR法對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路中蛋白進(jìn)行檢測(cè) Western Blot操作中需要經(jīng)過提取蛋白、檢測(cè)蛋白、配制膠體、跑電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體、顯影等操作，具體操作步驟可查閱相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行[7]。RT-PCR采用trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBG法RTPCR，采用2-ΔΔCt法計(jì)算倍數(shù)關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 心肌微血管組織細(xì)胞活力結(jié)果與空白對(duì)照組相比，AGEs組的細(xì)胞活力明顯降低；AGEs加氯沙坦治療組的細(xì)胞活力稍有下降；氯沙坦治療組的細(xì)胞活力沒有特別明顯的變化。各組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組心肌細(xì)胞活力比較

1:空白對(duì)照組; 2:AGEs組; 3:AGEs加氯沙坦治療組; 4:氯沙坦治療組；與空白對(duì)照組比較,*P<0.05

2.2 各組心肌微血管組織細(xì)胞的凋亡率與空白對(duì)照組比較，AGEs組的細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡的情況，AGEs加氯沙坦治療組次之，氯沙坦治療組的細(xì)胞少有凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 TUNEL法觀察各組大鼠心肌微血管

A：空白對(duì)照組；B：AGEs組；C：AGEs加氯沙坦治療組；D：氯沙坦治療組

表2 各組大鼠的心肌微血管組織細(xì)胞凋亡率

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05;與AGEs組比較；#P<0.05;與AGEs加氯沙坦治療組比較：&P>0.05

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞在JAK2/STAT3信號(hào)通路中的影響通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞的JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)水平檢測(cè)我們可知：AGEs組的磷酸化水平明顯高于空白對(duì)照組；AGEs加氯沙坦治療組的磷酸化水平較空白對(duì)照組高而低于AGEs組；氯沙坦治療組的磷酸化水平與空白對(duì)照組表達(dá)相差不大。各組與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠心肌細(xì)胞在JAK2/STAT3信號(hào)通路中的表達(dá)結(jié)果

1:空白對(duì)照組; 2:AGEs組; 3:AGEs加氯沙坦治療組; 4:氯沙坦治療組

2.4 各組血清炎性介質(zhì)IL-6、TNF-β的表達(dá)與空白對(duì)照組比較，AGEs組大鼠血清中炎性介質(zhì)IL-6、TNF-β的表達(dá)均明顯升高； AGEs加氯沙坦治療組IL-6、TNF-β表達(dá)水平比空白對(duì)照組要高但低于AGEs組；氯沙坦治療組大鼠的炎性介質(zhì)IL-6、TNF-β表達(dá)水平與空白對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠血清炎癥因子IL-6、TNF-β的表達(dá)

1:空白對(duì)照組; 2:AGEs組; 3:AGEs加氯沙坦治療組; 4:氯沙坦治療組

表3 各組大鼠血清中血清炎癥因子IL-6、TNF-β的表達(dá)結(jié)果

與空白對(duì)照組比較：*P<0.05;與AGEs組比較：#P<0.05

3 討論

本研究旨在探討氯沙坦對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。從MTT和TUNEL法結(jié)果可知，在氯沙坦的干預(yù)下，心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的活力與AGEs組比較得到提升，細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少。通過研究JAK2/STAT3通路發(fā)現(xiàn)，在氯沙坦的干預(yù)下，磷酸化水平與AGEs組比明顯下降，同時(shí)炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-β的表達(dá)水平也明顯下降。

糖尿病在我國(guó)一直處于高發(fā)狀態(tài)，并且患病人群逐步年輕化。發(fā)病原因通常是對(duì)葡萄糖的過量攝入和不規(guī)律的生活方式[8]。患有糖尿病的患者對(duì)葡萄糖的攝入需要嚴(yán)格的控制，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)藥物治療才能有效緩解病情。糖尿病通常會(huì)引起心血管并發(fā)癥[9-11]，常規(guī)的降血糖治療方案無法對(duì)心血管疾病進(jìn)行有效干預(yù)，反而可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)低血糖乃至心血管原因的死亡。因此，糖尿病以及糖尿病引起的心血管疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了公眾的健康和生命安全。因此，探索糖尿病對(duì)心肌和血管的損傷機(jī)制，將為今后因糖尿病引起的心血管疾病的預(yù)防和治療尋找相關(guān)作用點(diǎn)。

AGEs是人體處于長(zhǎng)期高糖狀態(tài)下，蛋白質(zhì)和還原糖發(fā)生糖基化反應(yīng)所得到的產(chǎn)物[12]。該物質(zhì)會(huì)對(duì)人體的心肌細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行侵犯，使它喪失自己的功能，最后使細(xì)胞死亡。氯沙坦[13-14]為血管緊張素受體拮抗劑，目前臨床上用于保護(hù)心肌細(xì)胞抗心室的重塑。先前有文獻(xiàn)報(bào)道[15-16]氯沙坦可對(duì)糖尿病心肌微血管進(jìn)行有效保護(hù)作用，因此本實(shí)驗(yàn)首先從細(xì)胞水平研究氯沙坦的治療作用。通過MTT法和TUNEL法對(duì)各組細(xì)胞活力和凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，AGEs組的細(xì)胞活力明顯下降和凋亡率上升(P<0.05)，而在氯沙坦的干預(yù)下，AGEs加氯沙坦治療組的細(xì)胞活力得到了提升，凋亡率也有所下降(P<0.05)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本相符。根據(jù)細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們確定了氯沙坦對(duì)治療心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞有著很好的療效，接著從基因方向研究其保護(hù)的作用機(jī)制。

有研究表明[17]，糖尿病心肌微血管的損傷與內(nèi)皮細(xì)胞和吞噬細(xì)胞的活動(dòng)息息相關(guān)，其活動(dòng)會(huì)使得大量炎癥因子和自由基的釋放，造成內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，最終導(dǎo)致病變。促炎因子[18]可對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，如IL-6、IL-8、TNF-α等，而抗炎介質(zhì)[19]可使炎癥擴(kuò)散，有IL-4、IL-10、TGF-β等。有文獻(xiàn)報(bào)道[20-21]，TNF-β和IL-6通過JAK/STAT信號(hào)通路來促成心血管損傷和心肌肥厚。通過Western blot和RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果可知，與空白對(duì)照組相比，AGEs組JAK2/STAT3信號(hào)通路的磷酸化水平明顯提高(P<0.05)，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相一致。經(jīng)過氯沙坦的干預(yù)后，AGEs加氯沙坦治療組的磷酸化水平較AGEs組有所下降(P<0.05)，即氯沙坦通過JAK2/STAT3信號(hào)通路發(fā)揮療效。通過對(duì)炎癥因子TNF-β和IL-6的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，AGEs組TNF-β和IL-6的表達(dá)水平有上升趨勢(shì)(P<0.05)，而AGEs加氯沙坦治療組中TNF-β和IL-6的表達(dá)水平得到了有效的控制(P<0.05)。由此可知，氯沙坦通過對(duì)JAK2/STAT3信號(hào)通路磷酸化水平進(jìn)行控制，同時(shí)抑制TNF-β和IL-6的表達(dá)水平。

綜上所述，氯沙坦可以通過JAK2/STAT3信號(hào)通路來對(duì)AGEs患者的心肌微血管細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，從而保護(hù)微血管心肌細(xì)胞，為以后更深入的研究奠定了理論基礎(chǔ)。