利用MALDI-TOF MS檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素耐藥性的研究

李蓉蓉，方亞平，李亞娟，沈繼錄，3

致病菌的快速鑒定與藥敏結(jié)果的獲得能夠指導(dǎo)臨床抗生素的針對(duì)性用藥，從而提高病人的生存率[1]。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要是培養(yǎng)、生化實(shí)驗(yàn)、分子診斷等,費(fèi)用昂貴，人力需求大[2]。目前，實(shí)驗(yàn)室新興了一種對(duì)病原菌的檢測(cè)方法：基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser resolutionu ionization time-of-flight mass spectrometry , MALDI-TOF MS)。該技術(shù)結(jié)果可靠，鑒定快速，成本低[3]?；诖?，科研人員逐漸將目光放在對(duì)細(xì)菌耐藥性的應(yīng)用上[4-6]。替加環(huán)素是FDA 批準(zhǔn)用于治療感染性疾病的抗生素，現(xiàn)已出現(xiàn)了部分替加環(huán)素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌[7]，其耐藥機(jī)制復(fù)雜[8]，目前，對(duì)替加環(huán)素敏感性的檢測(cè)主要通過(guò)K-B法及MIC法，其耗時(shí)長(zhǎng)，因此，該研究將通過(guò)利用MALDI-TOF MS技術(shù)建立快速檢測(cè)替加環(huán)素耐藥性的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來(lái)源 隨機(jī)收集安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2016～2019年間保存的107株鮑曼不動(dòng)桿菌。

1.1.2試劑與儀器 MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)；無(wú)菌96孔板(上海生工有限公司)；替加環(huán)素(美國(guó)惠氏公司)；胰蛋白胨(英國(guó)OXOID公司)；酵母提取物(英國(guó)OXOID公司)；NaCl(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司)；麥康凱平板、哥倫比亞血平板、MH平板(合肥天達(dá)有限公司)；替加環(huán)素紙片(英國(guó)OXOID公司)；超純水，96孔靶板(德國(guó)Bruker公司)；MALDI-TOF MS配套試劑包括α-氰基-4-羥基肉桂酸 (德國(guó)Bruker公司)；多肽標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Bruker公司)；無(wú)水乙醇(上海沃凱生物技術(shù)有限公司)；乙腈(天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司)；甲酸(天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司)；三氟乙酸(天津市化學(xué)試劑供銷(xiāo)公司)均為分析純。

1.1.3軟件 Bruker質(zhì)譜儀配套軟件MALDI Biotyper3.0、FlexControl3.0及WHONET5.6。

1.2 方法

1.2.1細(xì)菌復(fù)蘇 將107株細(xì)菌從-20 ℃冰箱取出四區(qū)劃線(xiàn)接種于麥康凱平板，置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，從麥康凱平板上挑取單個(gè)菌落接種于血平板上，再置于35 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2MALDI-TOF MS鑒定細(xì)菌 將血平板上培養(yǎng)18～24 h后長(zhǎng)出的純菌落用甲酸/乙腈法處理，采用MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定，每株細(xì)菌點(diǎn)3個(gè)靶點(diǎn)，每個(gè)靶點(diǎn)打3張圖譜，圖譜由FlexControl 3.0軟件手動(dòng)獲取。

1.2.3藥敏試驗(yàn) 先利用K-B法檢測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌敏感性，游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈(≤12 mm為耐藥，13～15 mm為中介，≥16 mm為敏感)，結(jié)果顯示敏感的菌株視為對(duì)替加環(huán)素敏感，對(duì)替加環(huán)素非敏感菌株再利用微量肉湯稀釋法復(fù)查，結(jié)果判讀采用美國(guó)FDA推薦的折點(diǎn)判讀標(biāo)準(zhǔn)(MIC≤2 mg/l為敏感，4 mg/l是中介，≥8 mg/l為耐藥)[9]，采用替加環(huán)素耐藥株及敏感株構(gòu)建數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.4自建庫(kù)及算法分析 上述微量肉湯稀釋法檢測(cè)的敏感和耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的圖譜導(dǎo)入MALDI Biotyper 3.0、去掉低質(zhì)量圖譜(score<2.3)。隨機(jī)選出20株替加環(huán)素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌及20株替加環(huán)素敏感菌株導(dǎo)入MALDI Biotyper 3.0建立數(shù)據(jù)庫(kù)，余下鮑曼不動(dòng)桿菌的圖譜用于驗(yàn)證。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理將替加環(huán)素耐藥株和敏感株的圖譜導(dǎo)入MALDI Biotyper 3.0利用PCA聚類(lèi)分析進(jìn)行同源性分析。利用WHONET5.6軟件統(tǒng)計(jì)不同型別細(xì)菌的藥物敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌鑒定及藥敏結(jié)果107株細(xì)菌經(jīng)MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果為：103株鮑曼不動(dòng)桿菌、3株瓊氏不動(dòng)桿菌、1株醫(yī)院不動(dòng)桿菌，鑒定分?jǐn)?shù)均>2.0。103株鮑曼不動(dòng)桿菌利用K-B法檢測(cè)對(duì)替加環(huán)素敏感性，結(jié)果為敏感的有10株、耐藥有54株、中介有39株。對(duì)K-B法結(jié)果為非敏感的93株鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行微量肉湯稀釋法檢測(cè)，結(jié)果顯示為敏感的有29株、耐藥有37株、中介有27株，兩種方法的一致率為68.82%(64/93)，替加環(huán)素敏感及耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1。利用WHONET 5.6對(duì)37株替加環(huán)素耐藥的泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的科室分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中干部呼吸內(nèi)科6株、急診ICU 8株、重癥監(jiān)護(hù)室10株、心外科3株、急診外科、心內(nèi)科、干部神經(jīng)內(nèi)科均2株、肝膽胰外科、呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科、胸外科均1株。

圖1 替加環(huán)素敏感和替加環(huán)素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌質(zhì)譜圖

圖2 76株鮑曼不動(dòng)桿菌的同源性關(guān)系圖

2.2 同源性分析結(jié)果將微量肉湯稀釋法確定為替加環(huán)素敏感和耐藥的76株鮑曼不動(dòng)桿菌的圖譜進(jìn)行同源性分析，可將76株鮑曼不動(dòng)桿菌明顯分為2大簇4個(gè)分型，見(jiàn)圖2。分別命名為Ⅰa、Ⅰb、Ⅰc、Ⅱ，將泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌定義為對(duì)包括替加環(huán)素及常規(guī)抗菌藥物均耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌，這4種型別中對(duì)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的比例分別為0%(0/10)、50%(8/16)、44.83%(13/29)、71.42%(15/21)。利用WHONET5.6軟件統(tǒng)計(jì)出4種型別鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)19種抗生素的耐藥率，結(jié)果見(jiàn)表1，顯示4種型別鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)常規(guī)應(yīng)用抗生素出現(xiàn)高耐藥率，對(duì)米諾環(huán)素、替加環(huán)素和多黏菌素B的耐藥率較低。對(duì)上述泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，急診ICU、急診外科、心外科、重癥監(jiān)護(hù)室均有Ⅰ、Ⅱ型泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，干部呼吸內(nèi)科、干部神經(jīng)內(nèi)科出現(xiàn)Ib、Ic型，肝膽胰外科、神經(jīng)外科僅有Ib型、呼吸內(nèi)科僅有Ic型，心內(nèi)科、胸外科僅有Ⅱ型菌。

2.3 自建庫(kù)結(jié)果40株菌共得到280張(去掉80張低質(zhì)量圖譜)圖譜建立替加環(huán)素敏感和耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌數(shù)據(jù)庫(kù)，利用自建庫(kù)檢測(cè)余下36株鮑曼不動(dòng)桿菌的256張圖譜(去掉77張低質(zhì)量圖譜)，對(duì)替加環(huán)素耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌的正確檢出率為87.4%，替加環(huán)素敏感菌株的正確檢出率為77.5%。

表1 四種型別鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)不同藥物的藥敏結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表格內(nèi)“-”代表相應(yīng)抗生素?zé)o統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥率為35.92%(37/103)。出現(xiàn)這一高耐藥性可能原因可能是收集菌株大部分多來(lái)源于急診科同源性較強(qiáng)，并且入院感染患者多屬于重癥感染患者，耐藥菌感染率高。替加環(huán)素屬于高級(jí)抗生素，出現(xiàn)對(duì)此藥耐藥后，感染的治療會(huì)變得困難，并且多次抗生素誘導(dǎo)后敏感性細(xì)菌也可產(chǎn)生耐藥性[10]。因此，臨床感染的治療需要合理應(yīng)用抗生素，降低耐藥菌的產(chǎn)生。

本研究中，K-B法和微量肉湯稀釋法的一致率為68.82%，這種低一致率提示K-B法不能作為鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素耐藥性檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)。將微量肉湯稀釋法結(jié)果作為參考，自建庫(kù)對(duì)替加環(huán)素敏感及耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的分類(lèi)正確率分別為77.5%、87.4%。研究發(fā)現(xiàn)[11-12]，實(shí)驗(yàn)環(huán)境、預(yù)處理過(guò)程等均可影響圖譜結(jié)果，因此出現(xiàn)上述結(jié)果的可能原因包括以下幾點(diǎn)：① 數(shù)據(jù)庫(kù)較小，本課題組僅應(yīng)用20株細(xì)菌建庫(kù)；② 培養(yǎng)環(huán)境、預(yù)處理過(guò)程等影響MALDI-TOF MS圖譜；③ 不同菌株用于驗(yàn)證的圖譜數(shù)不等影響驗(yàn)證結(jié)果；④ 鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，將所有耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌歸為一個(gè)庫(kù)后檢測(cè)效率低。因此，對(duì)于一個(gè)新的數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，可擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)菌株，并控制所有菌株的實(shí)驗(yàn)條件，以提高數(shù)據(jù)庫(kù)的準(zhǔn)確率。兩個(gè)自建庫(kù)的結(jié)果正確率分別為77.5%、87.4%，提示通過(guò)自建庫(kù)預(yù)測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的敏感性也可能成為細(xì)菌敏感性檢測(cè)的新方法。

此外，37株替加環(huán)素耐藥的泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的科室分布統(tǒng)計(jì)顯示泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌主要集中在急診ICU、干部呼吸內(nèi)科及重癥監(jiān)護(hù)室(64.9%)，其余則少量分布在急診外科、心內(nèi)科、干部神經(jīng)內(nèi)科、肝膽胰外科、呼吸內(nèi)科、神經(jīng)外科、胸外科。上述數(shù)據(jù)提醒這些科室目前需要嚴(yán)格的消毒滅菌，控制院內(nèi)感染的爆發(fā)。

利用MALDI-TOF MS進(jìn)行同源性分析在之前文獻(xiàn)也有出現(xiàn)[13]，但結(jié)果不如PFGE法準(zhǔn)確，尚在探索研究階段，不作為流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)分析的推薦方法。同源性分析結(jié)果顯示，Ⅱ型泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的檢出比例最高，占71.42%，Ia型未見(jiàn)泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，所以同源性分析可用于初步篩選替加環(huán)素耐藥的泛耐藥不動(dòng)桿菌。統(tǒng)計(jì)顯示各型鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)氨芐青霉素、氨芐青霉素-舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、亞胺培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、頭孢噻肟、哌拉西林、美羅培南均顯示高耐藥率，對(duì)米諾環(huán)素、替加環(huán)素、多黏菌素B的耐藥率出現(xiàn)差別，Ia型鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素耐藥率為0%，可用替加環(huán)素治療Ia型鮑曼不動(dòng)桿菌的感染，神經(jīng)外科僅有Ib型，該型鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)多黏菌素B的耐藥率為0%，因此，該型鮑曼不動(dòng)桿菌感染后可用多黏菌素B治療。而急診ICU、急診外科、心外科、重癥監(jiān)護(hù)室均有Ⅰ、Ⅱ型耐替加環(huán)素鮑曼不動(dòng)桿菌存在，說(shuō)明這幾個(gè)科室可能存在交叉感染。

綜上所述，MALDI-TOF MS可快速鑒定鮑曼不動(dòng)桿菌、瓊氏不動(dòng)桿菌、醫(yī)院不動(dòng)桿菌，同源性分析可篩查泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌，自建庫(kù)可預(yù)測(cè)鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)替加環(huán)素的耐藥性，這為臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)細(xì)菌的藥物敏感性提供了一種新的思路。