小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的穩(wěn)定高效培養(yǎng)及外泌體的提取

程 歡，蘇 蓋，陶思躍，尤 濤

干細胞是具有良好的增殖、自我復制能力以及多向分化潛能的一類細胞，已經(jīng)廣泛應用于醫(yī)學科學研究，甚至于臨床治療。間充質(zhì)干細胞(mesenchyma stem cells，MSCs)具有免疫源性低，來源豐富，具備免疫調(diào)理特性，得到特別的重視，是現(xiàn)在研究最為廣泛的干細胞之一[1]?，F(xiàn)在越來越多的研究認為，MSCs的治療與其外分泌功能密切相關(guān)[2]。外泌體是MSCs外分泌的主要成分之一，所以MSCs外泌體的獲取是研究MSCs外分泌的“無細胞治療”效應及機制的必要基礎(chǔ)條件。小鼠因具有價格低廉、易于飼養(yǎng)及有多種基因型等特點，在基礎(chǔ)科學研究中得以廣泛應用[3]；但小鼠MSCs量極少、存活率低，其培養(yǎng)異常困難，也使得小鼠MSCs外泌體的獲取也變得相當困難。該研究在總結(jié)以前方法的基礎(chǔ)上應用全骨髓、差速貼壁并輔助以低氧環(huán)境的培養(yǎng)方法進行了小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)的培養(yǎng)，并對其進行外泌體提取和檢測，希望可以發(fā)現(xiàn)小鼠MSCs穩(wěn)定、高效的培養(yǎng)以及有效提取外泌體的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 4～8周齡SPF級C57 BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量15～20 g，共8只，SPF級飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 MesenCultTM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(不含谷氨酰胺，不含青霉素、鏈霉素，STEMCELL TECHNOLOGIES,Cat.NO.05514)；MesenCultTM10×添加物(STEMCELL TECHNOLOGIES, Cat. NO.05515)；MesenPureTM 1000×(STEMCELL TECHNOLOGIES, Cat. NO.05500)；0.25%胰酶/0.02% EDTA(BI Biological Industries Cat. NO.03055-1A)；GlutaMAXTM 添加劑100×(Gibco Cat.NO.35050061)；青鏈霉素 (SIGMA Cat.NO.V900929)；PBS (上海生工 Cat.NO.BN40100-0500); FBS(BI Biological Industries); EDTA(0.5 mol/L, pH8.0, Thermo Scientific Cat.NO. R1021)；IBMX(MedChemExpress)。

1.1.3主要儀器 超凈工作臺、細胞培養(yǎng)箱、離心機(Thermo Scientific)，細胞培養(yǎng)缺氧小室(STEMCELL TECHNOLOGIES)，減壓閥(有流量控制器)(上海減壓器廠有限公司)，70 μm細胞篩、50 ml離心管、100 mm細胞培養(yǎng)皿(BI Biological Industries)。

1.3 小鼠BM-MSCs的分離和培養(yǎng)[4]頸椎脫臼法處死小鼠，酒精浸泡后剝離出股骨和脛骨，組織鑷去除殘存軟組織；剝離完全后切除股骨上1/3，將所得的股骨和脛骨置于研缽內(nèi)，并加入適量分離buffer。杵輕輕按壓破壞骨髓腔，使細胞流出，再通過細胞篩收集細胞；反復清洗，直到骨髓腔變白。1 000 r/min離心含有骨髓細胞的懸液5 min；去除上清液，重懸細胞沉淀。取出細胞，加入等量臺盼藍，混勻后將10 ml全骨髓細胞鋪在100 mm細胞培養(yǎng)皿。將培養(yǎng)皿置于充滿低氧混合氣(5% O2，10% CO2，85% N2)的缺氧小室后，將其置于37 ℃細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。靜置培養(yǎng)3～4 d后打開缺氧小室，觀察MSCs如果細胞貼壁成簇生長達到80%即可進行傳代工作；如果沒有達到80%，繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d。傳代：PBS清洗，胰酶消化。加入完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min，去除上清液加入完全培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，1 ∶2進行傳代。2～3 d后，細胞匯合度達80%以上可再次傳代。

1.4 流式細胞術(shù)鑒定BM-MSCs表面標志物用流式細胞緩沖液重懸細胞。 取細胞懸液至EP管中，每管加入一抗，混勻。2～8 ℃孵育30 min后用流式細胞緩沖液清洗樣品。1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，每組各加入流式細胞緩沖液重懸。每組各加入熒光二抗，重懸細胞，2～8 ℃，避光孵育30 min后，用流式細胞緩沖液清洗樣品3次后，用500 μl流式細胞緩沖液重懸細胞，等待上機檢測。

1.5 BM-MSCs誘導分化實驗[5]

1.5.1成骨誘導分化 成骨誘導分化培養(yǎng)基：89%α-MEM+10% FBS+1%雙抗+50 μmol/L 抗壞血酸+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+100 nmol/L地塞米松。在6孔板每孔中加入1 ml促貼壁因子，放入37 ℃培養(yǎng)箱30 min后吸走促貼壁因子，晾干后，將小鼠BM-MSCs接種到6孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基，置于缺氧小室培養(yǎng)2～3 d后更換成成骨誘導分化培養(yǎng)基， 3～4周后觀察細胞完全長滿皿底，終止誘導分化。洗滌后，每孔加入2 ml 4%多聚甲醛，室溫固定15 min；PBS洗滌，每孔加入茜素紅染液染色5 min；顯微鏡下觀察成骨效率。

1.5.2成脂肪誘導分化 配制成脂肪誘導分化培養(yǎng)基(誘導液)：89%高糖(HG)DMEM+10% FBS+1%雙抗+10 μg/ml胰島素+200 μmol/L吲哚美辛+0.5 mmol/L IBMX+1 μmol/L地塞米松。配制成脂肪誘導分化培養(yǎng)基(維持液)：89% HG-DMEM+10% FBS+1%雙抗+10 μg/ml胰島素。將小鼠BM-MSCs接種到6孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基，于缺氧小室培養(yǎng)2～3 d后更換成成脂肪誘導分化培養(yǎng)基，3 d后更換成成脂肪誘導分化培養(yǎng)基，24 h后再換回誘導液，反復4次，用維持液培養(yǎng)4～7 d。多聚甲醛固定后每孔中加入1 ml油紅O染料液染色，于倒置顯微鏡下觀察成脂肪效率。

1.5.3成軟骨誘導分化 配制成骨誘導分化培養(yǎng)基：89% HG-DMEM+1%雙抗+10%轉(zhuǎn)鐵蛋白100 nmol/L地塞米松+1 μmol/L 抗壞血酸+1%丙酮酸鈉+1%脯氨酸+10 ng/mlTGF-β3。小鼠BM-MSCs接種到96孔板，每孔加入完全培養(yǎng)基，于缺氧小室培養(yǎng)1～2 d后，換成成骨誘導分化培養(yǎng)基， 3～4 d更換1次，持續(xù)3～4周。4%多聚甲醛固定30～60 min，然后加入200 μl 1%阿利辛藍染色過夜，于倒置顯微鏡下觀察成軟骨效率。

1.6 小鼠BM-MSCs的外泌體提取與鑒定[6]將小鼠BM-MSCs擴增至第5代后，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3 d，隨后將10% MesenCultTM10×添加物更換成10% Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum，低氧繼續(xù)培養(yǎng)2 d。傳下一代時收集上清液，置于-80 ℃保存。將收集的細胞上清液用水平轉(zhuǎn)子去除死細胞、細胞碎片和大的細胞污染物；再次收集細胞上清液，置于超速離心管內(nèi)30 000 r/min超速離心2 h；棄上清液，重懸外泌體沉淀，再次30 000 r/min 超速離心2 h后，500 μl PBS重懸外泌體沉淀。上透視電鏡拍照、成像。采用Western blot鑒定外泌體表面陽性蛋白特異性標志物HSP70、Syntenin1、CD9、CD63、TSG101及陰性蛋白標志物Grp94。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BM-MSCs的分離和培養(yǎng)該方法培養(yǎng)的小鼠BM-MSCs生長狀態(tài)好、穩(wěn)定、高效，第三代細胞就可達到95%以上的純度且可穩(wěn)定傳代至15代左右。見圖1。

2.2 流式細胞儀鑒定BM-MSCs表面標志物培養(yǎng)出來的BM-MSCs不表達細胞抗原CD117和細胞抗原CD31，而表達了整合素家族類抗原標志分子CD29、黏附分子家族類抗原標志分子CD44和Ly-6抗原家族成員Sca-1，見圖2。

中性點套管采用鋼壓塊壓接瓷套的固定方式，在變壓器抽真空期間，油箱頂部變形較大，變形產(chǎn)生的應力通過鋼制壓板直接作用在套管的瓷套上，超過瓷套的機械強度后將導致其出現(xiàn)裂紋，甚至斷裂。

2.3 BM-MSCs誘導分化結(jié)果

2.3.1成骨誘導分化 細胞形態(tài)由梭形變?yōu)槎嘟切?，細胞呈多層性、重疊性排列，形成間質(zhì)內(nèi)含大量礦鹽沉積的鈣化結(jié)節(jié)。茜素紅S染色礦化結(jié)節(jié)呈現(xiàn)紅色，見圖3A。

2.3.2成脂肪誘導分化 誘導而成的脂肪細胞累積脂質(zhì)，脂滴變大并合并呈串珠狀。經(jīng)油紅O染色呈鮮紅色，見圖3B。

2.3.3成軟骨誘導分化 多數(shù)細胞變成多邊形,核周顆粒密集排布,部分細胞邊界不清,呈圓形,核偏位,核周顆粒明顯，經(jīng)阿利辛藍染色后，在軟骨細胞周圍可見到藍染的酸性蛋白聚糖，見圖3C。

2.4 小鼠BM-MSCs外泌體的電鏡觀察及標志物檢測電鏡下觀察到外泌體典型的杯口狀結(jié)構(gòu)，同時Western blot結(jié)果顯示HSP70、Syntenin1、CD9、CD63及TSG101都是陽性，而Grp94只存在于BM-MSCs內(nèi)，不存在于外泌體內(nèi)，見圖4。

A：第1次換液后MSCs鏡下成像；B：第1次傳代前MSCs鏡下成像；C：第1次傳代后MSCs鏡下成像；D：第10代MSCs鏡下成像

圖2 流式細胞術(shù)鑒定BM-MSCs表面標志物

A：CD117檢測; B:CD31檢測; C:CD44檢測; D:CD29檢測; E:Sca-1檢測

圖3 BM-MSCs誘導分化實驗 ×100

圖4 小鼠BM-MSCs外泌體的提取與鑒定

A：電鏡下觀察到外泌體典型的杯口狀結(jié)構(gòu)×100 000；B：外泌體標志物的檢測

3 討論

MSCs是最為常見的干細胞之一，其主要存在于骨髓組織中，具有分化成多種結(jié)締組織細胞的潛能[1]。人們從骨、脂肪、臍血等多種組織中成功分離培養(yǎng)出MSCs, 但目前從骨髓中分離培養(yǎng)仍為獲取MSCs的最主要方法[4]。BM-MSCs具有病原微生物感染率低、生物性能穩(wěn)定、低免疫原性及移植免疫排斥反應弱等特性，且可為諸如骨及軟骨損傷中組織再生修復提供了很好的材料[7]。BM-MSCs在造血、心肌梗死或關(guān)節(jié)疾病患者中的有效性在臨床上已得到充分證明?；A(chǔ)實驗中的BM-MSCs常來源于大鼠、兔、狗等形體較大動物，但它們具有不便于飼養(yǎng)、價格較高、繁殖較慢以及缺乏基因型的缺點。小鼠的基因與人的基因相似度近99%，且較大鼠及其他實驗動物而言，具有形體較小、飼養(yǎng)方便、易于管理、價格低廉、生產(chǎn)繁殖及成熟快，尤其是具有諸多基因型等優(yōu)點，是現(xiàn)代基礎(chǔ)研究中必不可少的，最為常見的實驗動物之一。此外，成功培養(yǎng)后的BM-MSCs具有干細胞特性穩(wěn)定、傳代次數(shù)多，可達10代以上等優(yōu)勢。雖然目前已有一些成功培養(yǎng)小鼠BM-MSCs的報道[8]，但是由于小鼠骨髓腔細短，間充質(zhì)細胞和非間充質(zhì)細胞的“復合物”隱藏于緊密的骨內(nèi)膜中[9]，難以釋放出來；而且小鼠骨髓間充質(zhì)的含量也非常低，僅為0.001%～0.01%[10]，所以在實際操作中想要從小鼠骨髓中穩(wěn)定、高效的獲取濃度和純度相對較高的MSCs仍然較為困難。本研究采用研缽和杵壓碎骨髓腔及細胞篩過濾方法，使得小鼠BM-MSCs充分溶解釋放，大大提高了初始培養(yǎng)階段的MSCs濃度及純度。然后根據(jù)小鼠的BM-MSCs較其他實驗動物的BM-MSCs傳代的潛伏期要長的特點，延長初次的培養(yǎng)時間至5 d以上[11]；此外，根據(jù)常規(guī)培養(yǎng)條件下，小鼠的BM-MSCs會逐漸失去增殖分化能力[12]的特點，使用專用的培養(yǎng)基和特殊的添加物，并放置在5%氧濃度的低氧環(huán)境下培養(yǎng)，更有利于BM-MSCs的增殖分化[13]。這種全骨髓、差速貼壁及低氧環(huán)境培養(yǎng)方法可以使得小鼠BM-MSCs的增殖速度加快，純度更高，甚至傳至15代仍然保持干細胞的活力。誘導分化實驗結(jié)果亦顯示此方法培養(yǎng)的小鼠BM-MSCs可很好的誘導成骨、成脂肪及成軟骨，證實了其具有良好的分化能力。符合體外細胞實驗的要求，可以應用于MSCs相關(guān)的研究。

MSCs可以產(chǎn)生大量豐富的生長因子和細胞因子，越來越多的研究顯示MSCs是通過其外分泌的無細胞治療效應，發(fā)揮其功能的，這減輕了免疫源性，避免了干細胞成瘤性等缺點。外泌體是一類大小約50～200 μm的，由細胞分泌的細胞外囊泡，其可以攜帶多種活性蛋白，非編碼RNA等物質(zhì)介導細胞間通訊；它可促進很多疾病的發(fā)生及發(fā)展，又可作為疾病生物標志物，同時對疾病也具備治療潛力[14]。外泌體是MSCs外分泌的主要成分之一，被認為是MSCs旁分泌的無細胞(cell-free)治療最重要的機制之一[15]。對其研究有利于進一步闡明MSCs的無細胞治療的理論及機制，是當今的熱點。正如上所述，小鼠MSCs的培養(yǎng)極其困難，制約了它的外泌體的獲??；但它的外泌體又是基礎(chǔ)研究中不可缺少的材料。本研究通過“全骨髓、差速貼壁及低氧方法”成功培養(yǎng)小鼠BM-MSCs的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)其經(jīng)過5代培養(yǎng)后，可自然分泌出外泌體，超速離心可得到符合實驗條件的外泌體。Western blot結(jié)果顯示外泌體的蛋白標志物：特異性的標志物 HSP70、Syntenin1、CD9、CD63及TSG101為陽性；排除標志物 Grp94為陰性。透視電鏡見典型的外泌體樣結(jié)構(gòu)(通茶托型、一側(cè)凹陷的半球形)符合外泌體的特征。所以可以認為應用此方法培養(yǎng)出的小鼠BM-MSCs可更穩(wěn)定的自然分泌外泌體，且易于提取。當然，本實驗所用的小鼠為C57 BL/6小鼠，其他品系小鼠能否獲得如此效果需進一步研究證實。

綜上所述，本研究建立了一種穩(wěn)定、高效的小鼠BM-MSCs培養(yǎng)方法，為MSCs的功能機制研究提供了良好的種子細胞；同時驗證了用此方法培養(yǎng)的小鼠BM-MSCs能穩(wěn)定、高效的自然分泌外泌體，且易于提取，為MSCs的無細胞的外泌體治療的深入研究提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。