低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對甲基苯丙胺成癮大鼠復(fù)吸行為、記憶功能和海馬結(jié)構(gòu)的影響

徐曉津，房茂勝，繆 楹，徐艷芩

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)俗稱“冰毒”，是2000年以后我國毒品濫用中最具代表性、最常見且濫用增長速度最快的毒品，其起效迅速，口服后數(shù)分鐘即可表現(xiàn)出明顯的中樞和外周反應(yīng)，且半衰期較長[1-2]。有研究[3]報道稱小劑量使用MA可促進長期智力發(fā)展，而長時間大量使用MA會嚴(yán)重損傷機體，降低認知功能，嚴(yán)重者會導(dǎo)致死亡?，F(xiàn)階段研究[4]表明氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡、興奮性毒性都參與到MA的神經(jīng)毒性過程中。低頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS)作為一種新發(fā)展的神經(jīng)電生理技術(shù)，其在改善抑郁癥患者認知功能方面效果得到了肯定，但目前rTMS防治MA戒毒后復(fù)吸的相關(guān)研究鮮少報道。該研究旨在通過構(gòu)建MA自身給藥模型，給予rTMS治療，來觀察rTMS防治MA復(fù)吸的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物來源健康雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～220 g，購于中國食品藥品檢定研究院[許可證號：SCXK(京)2017-0005]，所有SD大鼠均飼養(yǎng)在中國檢驗檢疫科學(xué)研究院屏障環(huán)境動物房[SYXK(京)2016-0011]，培育室溫度20～25 ℃，濕度保持在65%～70%，進行人工光照(12 h/12 h)，大鼠全天自由飲水，常規(guī)飼料飼養(yǎng)。實驗過程中均嚴(yán)格遵循“3R”原則。

1.2 主要試劑與儀器MA(購自中國藥品生物制品鑒定所，批號171212)；Mag Pro30型經(jīng)顱磁刺激儀(丹麥Dantec公司)；RB-100A水迷宮測試系統(tǒng)(北京新天地科技有限公司)；大鼠自身給藥訓(xùn)練籠及相關(guān)配件(寧波市俺來科技有限公司)。

1.3 實驗動物分組與MA自身給藥模型建立將60只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、實驗組，每組20只。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后同時給予0.3 mg/kg的阿托品鎮(zhèn)靜；將大鼠固定于手術(shù)臺上，快速分離出右側(cè)靜脈，并剪出“V”字型切口，然后用長度3.5 cm的PE50插管沿切口迅速插入，醫(yī)用尼龍線固定，并在靜脈遠心端結(jié)扎，在插管的另一端用10 cm長的PE20經(jīng)皮下組織由背部穿出體外，并用消毒過的堵頭封口，手術(shù)后每天通過插管給予0.1 ml的肝素鈉抗凝，并在術(shù)后3 d內(nèi)給予2×105U的青霉素抗感染，所有大鼠單籠飼養(yǎng)，全天自由飲食。手術(shù)完成后恢復(fù)7 d左右，對模型組和實驗組大鼠進行MA自身給藥訓(xùn)練，采用固定比例程序進行訓(xùn)練，每天訓(xùn)練3 h，將大鼠放入訓(xùn)練籠中，亮起籠燈，大鼠在訓(xùn)練籠中的碰觸有效鼻觸，籠燈熄滅，完成1次有效鼻觸可獲得1次0.05 mg/kg劑量的MA給藥，給藥時間過程持續(xù)5 s，每次給藥后會有20 s不應(yīng)期，不應(yīng)期內(nèi)僅記錄有效鼻觸次數(shù)但不進行給藥，結(jié)束后亮起籠燈，進入下一個循環(huán)。訓(xùn)練時間持續(xù)8 d，以連續(xù)3 d有效鼻觸次數(shù)超過50次，且變化幅度低于10%，判定為模型建立成功[5]。

1.4 rTMS治療方法將各組大鼠放置在長圓型塑料器具中固定，使大鼠的頭頸部皮膚緊貼在內(nèi)徑10 mm、外徑60 mm的MC125圓形線圈正中心，調(diào)整輸出場強在3.7 T，保持刺激強度為1 T，頻率為1 Hz，連續(xù)刺激25次后間隔2 min繼續(xù)刺激，一共5個序列，每天1次，對照組和模型組大鼠，僅用線圈緊貼頭部，但不給予刺激，共持續(xù)治療7 d，每天均在20：00進行試驗。

1.5 行為學(xué)試驗

1.5.1曠野實驗 采用文獻[6]中相關(guān)方法，在rTMS治療后將大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm的內(nèi)空敞箱中，將箱子內(nèi)壁涂成黑色，且底部用黑線劃分為面積相等的25塊，記錄大鼠穿越地面方塊數(shù)作為水平活動得分，直立次數(shù)則作為垂直得分。測試過程中周圍保持安靜，且每只大鼠完成試驗后，清理平臺及氣味，避免對后面大鼠的實驗造成影響。

1.5.2水迷宮實驗 采用文獻[7]中的相關(guān)方法，在曠野實驗結(jié)束后開始進行，RB-100A水迷宮測試裝置有棕黑色塑料板制成，水深度為22 cm，將裝置分為A區(qū)、B區(qū)、C區(qū)、終點區(qū)，在終點區(qū)位置有臺階能夠讓實驗動物爬出水面，A、B、C區(qū)到終點區(qū)均進行訓(xùn)練，每個區(qū)域訓(xùn)練3次。訓(xùn)練完成后，記錄5 min內(nèi)實驗動物從C區(qū)起點處進入終點區(qū)所需時間以及進入盲端次數(shù)(錯誤次數(shù))，24 h后復(fù)測1次。

1.6 大鼠復(fù)吸行為檢測將經(jīng)過rTMS治療后的大鼠放入飼養(yǎng)籠，觀察其完成自然戒斷后，再次放入自身給藥實驗籠中，進行3 h的訓(xùn)練，開始訓(xùn)練前給予1次條件性刺激，即燈籠、鼻觸紅燈以及注射泵開啟聲音，但不給予MA注射，之后每次有效鼻觸反應(yīng)均可獲得1次條件性刺激，但同樣不給予MA注射，記錄大鼠實驗過程中的有效鼻觸反應(yīng)和無效鼻觸反應(yīng)次數(shù)。

1.7 大鼠海馬組織病理變化情況觀察將完成行為學(xué)試驗后的各組大鼠用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉后側(cè)腹朝上固定，剪開胸腔將心臟完全暴露出來，用注射針插入左心室心尖處，剪開右心耳，通過注射泵注射含20 IU/ml肝素的生理鹽水，待流出液無血色后，用4%多聚甲醛溶液灌流，發(fā)現(xiàn)軀體變白、僵硬后于冰上迅速斷頭處死，剝離海馬組織后，用10%甲醛固定3 d后，用石蠟包埋后制成5 μm厚的切片。

1.7.1HE染色觀察海馬組織 將制備好的切片經(jīng)二甲苯脫蠟2次后，用從高到低的梯度乙醇透明，蘇木精染色5 min，鹽酸分化15 s，流水返藍15 min，伊紅染色2 min，在用從低到高的梯度乙醇脫色，二甲苯脫水透明后封片，利用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織病理形態(tài)學(xué)變化，并拍照記錄。

1.7.2尼氏染色觀察海馬組織 將制備好的切片用去離子水洗滌2次，2 min/次，用提前配制好的尼氏染色液染12～15 min，完成后再次用去離子水清洗2次、30 s/次，95%乙醇脫水2次、2 min/次，二甲苯脫水透明2次、5 min/次，完成后用中性樹膠封片，利用Olympus光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織病理形態(tài)學(xué)變化，并拍照記錄。

1.7.3電鏡下觀察海馬CA3區(qū)突觸超微結(jié)構(gòu) 利用KBL III型超薄切片機先切取1 μm半薄切片觀察定位后，繼續(xù)切取75 nm的超薄切片，用醋酸雙氧鈾-枸櫞酸鉛染色后，在H-800型透射電鏡下觀察并拍照記錄用于分析大鼠神經(jīng)突觸的面數(shù)密度、面積密度和體積密度情況。

2 結(jié)果

2.1 rTMS對MA大鼠曠野實驗的影響與對照組相比，模型組大鼠曠野實驗的水平及垂直得分均降低；與模型組向比，實驗組大鼠水平及垂直得分均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠曠野實驗結(jié)果比較(分，

與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.2 rTMS對MA大鼠水迷宮實驗的影響與對照組相比，模型組和實驗組大鼠水迷宮學(xué)習(xí)及記憶任務(wù)完成時間延長，錯誤次數(shù)增多，而實驗組大鼠水迷宮學(xué)習(xí)、記憶任務(wù)完成時間要短于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但錯誤次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠水迷宮實驗結(jié)果比較

與對照組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.3 rTMS對條件線索誘導(dǎo)大鼠MA復(fù)吸行為的影響與自然戒斷前相比，條件線索誘導(dǎo)后模型組大鼠有效鼻觸次數(shù)減少，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，實驗組大鼠有效鼻觸數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，條件線索誘導(dǎo)后實驗組大鼠有效鼻觸數(shù)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，無效鼻觸數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 模型組與實驗組大鼠復(fù)吸行為情況比較(次，

與自然戒斷前比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05

2.4 rTMS對MA大鼠海馬組織病理學(xué)影響HE染色結(jié)果顯示：對照組大鼠海馬細胞排列整齊緊密，細胞大小均一，細胞核明顯，模型組大鼠可見海馬細胞排列分散，形態(tài)不規(guī)則，部分細胞細胞核明顯變小甚至消失，實驗組大鼠海馬細胞結(jié)構(gòu)基本正常，排列較為整齊，細胞核變形情況較少。見圖1。

尼氏染色結(jié)果顯示：與對照組大鼠相比，模型組和實驗組大鼠尼氏小體數(shù)目和平均光密度均降低，與模型組大鼠相比，實驗組大鼠尼氏小體數(shù)目和平均光密均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

2.5 rTMS對MA大鼠突觸超微結(jié)構(gòu)的影響醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色結(jié)果顯示：對照組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)突觸數(shù)量多，結(jié)構(gòu)清晰，突觸前成分中可見數(shù)量較多且排列緊密的圓形突觸小泡(圖3A中黑色箭頭所指)，模型組大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)突觸數(shù)量明顯減少，突觸前、后膜有融合情況，突觸小體較為松散，且數(shù)量也明顯減少(圖3B中黑色箭頭所指)，實驗組大鼠海馬A3區(qū)突觸數(shù)量較對照組少，模型組多，突觸前、后膜之間可見少量融合，分界線較為清晰(圖3C中黑色箭頭所指)。與對照組相比，模型組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)突觸面數(shù)密度、面積密度及體積密度均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，實驗組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)突觸面數(shù)密度、面積密度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，體積密度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，實驗組大鼠CA3區(qū)神經(jīng)突觸面數(shù)密度、面積密度及體積密度均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠海馬CA3區(qū)突觸相關(guān)指標(biāo)比較

與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05

3 討論

靜脈自身給藥MA模型，作為目前國際公認的一種能夠有效模擬人類主動吸食MA的模型，通過完整的給藥獲得、維持、戒斷、消退及條件線索誘導(dǎo)復(fù)吸過程，能夠為MA成癮的研究提供很好的參考作用[8]。本研究為了探討rTMS對MA依賴大鼠復(fù)吸行為的影響，在自然戒斷過程中給予了持續(xù)7 d的rTMS治療，與開始自然戒斷前相比，治療后的MA大鼠有效鼻觸數(shù)明顯減少，表明rTMS治療能夠有效干預(yù)條件線索誘導(dǎo)的MA復(fù)吸行為?？赡苁且驗閞TMS作為一種非侵入生物刺激技術(shù)，對于神經(jīng)系統(tǒng)功能有較大的影響，有研究表明，rTMS能夠影響神經(jīng)遞質(zhì)水平，降低多巴胺水平[9]，而腹側(cè)背蓋區(qū)投射到伏隔核及前額葉皮層的中腦-邊緣多巴胺獎賞系統(tǒng)環(huán)路是MA成癮及復(fù)吸的關(guān)鍵神經(jīng)通路[10]，因此推測rTMS可能是通過抑制多巴胺水平，阻滯中腦-邊緣多巴胺獎賞系統(tǒng)環(huán)路，從而干預(yù)了MA大鼠復(fù)吸行為。

圖1 各組大鼠海馬組織的HE染色結(jié)果 ×400

圖2 各組大鼠海馬組織的尼氏染色結(jié)果 ×100

曠場實驗?zāi)軌蛲ㄟ^觀察實驗動物在新環(huán)境下的特定行為發(fā)生頻率和持續(xù)時間來反映實驗動物的自主行為及探索行為，而這一過程與人類的復(fù)雜情緒變化類似，因此常用于實驗動物海馬功能的測試[11]。水迷宮實驗作為研究海馬功能相關(guān)的空間學(xué)習(xí)記憶的檢測手段，可有效反映動物的空間學(xué)習(xí)記憶能力[12]。對MA成癮大鼠進行曠野實驗及水迷宮實驗發(fā)現(xiàn)，其曠野實驗的水平及垂直得分明顯降低，水迷宮實驗的學(xué)習(xí)、記憶時間顯著變長，錯誤次數(shù)也顯著增多，表明MA能夠顯著損傷大鼠的神經(jīng)學(xué)習(xí)記憶能力，而經(jīng)過rTMS治療后，曠野實驗的水平及垂直得分明顯升高，且與正常大鼠沒有明顯差異，而水迷宮的學(xué)習(xí)、記憶時間雖然明顯縮短，但還是要高于對照組，且錯誤次數(shù)沒有明顯變化，這表明雖然rTMS能夠一定程度的改善MA引起的神經(jīng)損傷，但由于MA引起神經(jīng)損傷的機制較為復(fù)雜，因此僅通過rTMS治療是無法完全恢復(fù)的。有研究[13]表明，突觸前突觸素(synap tophysin，Syn)作為研究突觸可塑性最常用的1個指標(biāo)，rTMS治療后，腦缺血大鼠海馬組織中Syn表達水平顯著升高，突觸后致密物質(zhì)(postsynaptic density，PSD)作為中樞突觸結(jié)構(gòu)可塑性的重要指標(biāo)，與學(xué)習(xí)、記憶的訓(xùn)練及保持能力關(guān)系密切，缺血時會引起PSD厚度減少，而rTMS治療后，可明顯增加PSD厚度，改善突觸界面曲率和穿孔性突觸比率，進而改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[14]，因此推測rTMS可能是通過促進MA大鼠海馬組織中Syn表達水平及改變PSD厚度，來改善MA引起的神經(jīng)學(xué)習(xí)記憶功能損傷。同時對各組大鼠海馬組織結(jié)構(gòu)進行光鏡和電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MA大鼠海馬細胞損傷較為嚴(yán)重，尼氏小體及平均光密度均顯著降低，CA3區(qū)神經(jīng)突觸數(shù)量減少，突觸前、后膜融合，突觸小泡數(shù)量減少，均表明MA對神經(jīng)元產(chǎn)生了損傷，但經(jīng)過rTMS治療后，神經(jīng)元損傷明顯改善，且突觸形態(tài)學(xué)參數(shù)也有所改善，但尚未達到正常水平，可能是突觸可塑性改變速度相對較慢，與白冰 等[15]研究一致。

綜上所述，rTMS可有效干預(yù)MA大鼠的復(fù)吸行為，并且還可能通過改善大鼠的突觸可塑性來緩解MA對大鼠神經(jīng)海馬組織的損傷及學(xué)習(xí)記憶功能的影響。但rTMS改善MA神經(jīng)毒性作用的具體機制尚不清楚，還需要進一步探討。