雷公藤甲素通過抑制細(xì)胞色素P450 3A4酶增強(qiáng)肝損傷研究

楊新華，夏宏光，金 涌

雷公藤(tripterygium wilfordii hook F，TWHF)是一種藤本植物，TWHF的粗提物已被廣泛用作治療自身免疫性疾病和炎癥性疾病的處方[1]，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、IgA腎病、狼瘡性腎炎、腎小管間質(zhì)性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)并對組織和器官移植有益[2]。雷公藤甲素(triptolide，TP)又稱雷公藤內(nèi)酯醇，是從TWHF的粗提取物中分離的復(fù)合三環(huán)氧化物二萜。作為TWHF的主要生物活性成分之一，它在體外和體內(nèi)均具有獨(dú)特的生物活性。然而在TP達(dá)到其臨床潛力之前，仍然需要克服眾多問題，如水溶性差、治療窗口狹窄和多器官毒性(包括損害消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)以及骨髓)。長期使用可導(dǎo)致嚴(yán)重的不良事件，如肝腫大、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酸(alanine transaminase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase，AST)升高等[3]。目前TP誘發(fā)肝臟損傷的確切作用機(jī)制尚不明確。細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)是一組結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的超家族基因編碼的同工酶，主要存在于生物體的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)，是混合功能氧化酶中最重要的一種酶系[4]。CYP3A 酶有3A4、3A5、3A7和3A43 4個(gè)亞型[5]，成人CYP3A酶分別占肝臟和小腸總P450酶的40%和80%，以3A4為主[6]。CYP3A酶參與機(jī)體內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，在調(diào)節(jié)機(jī)體與外環(huán)境的相互作用以及保持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[7]。CYP3A酶活性受多種因素影響，例如遺傳多態(tài)性、機(jī)體生理或病理狀態(tài)以及合并用藥情況，尤以遺傳多態(tài)性最為顯著。TP在大鼠肝微粒體中代謝主要由CYP3A介導(dǎo)。該文主要研究TP對其主要代謝酶CYP3A4的影響以及與肝損傷之間的關(guān)聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株與動物 L-02細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。生長于含10%胎牛血清培養(yǎng)液中，在37℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)換液傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)均采用對數(shù)期細(xì)胞。24只C57BL/6雄性小鼠(6～8周，18～20 g)購自安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，小鼠的飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級動物房，室溫20～25 ℃，濕度為40%～60%，每籠2只。

1.1.2主要試劑 TP(成都普思生物)；卡馬西平(carbamazepine, CBZ)(上海阿拉丁)、氨氯地平(amlodipine，AML)(上海阿拉丁)、甲醇(色譜純) 購自上?；瘜W(xué)試劑總廠；RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國 Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma 公司；β-actin抗體和山羊抗兔 IgG均購自北京博奧森科技有限公司；CYP3A4抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司； ALT、AST檢測試劑盒購自南京建成公司。

1.1.3主要儀器 全波長酶標(biāo)儀(美國Biotek公司)；顯影儀(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)；色譜柱：Shim-pack ODS C18柱，4.6 mm×250 mm，高效液相色譜儀(日本島津)。

1.2 方法

1.2.1MTT法篩選CBZ(CYP3A4酶誘導(dǎo)劑)、AML(CYP3A4酶抑制劑)[8]和TP對L-02細(xì)胞株的生長抑制率 取消化后的L-02細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板。觀察細(xì)胞貼壁后加入藥物CBZ，濃度分別為25、50、60、70、80、90、100、110、120 μmol/L，每組做6個(gè)復(fù)孔，再取消化后的L-02細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板。觀察細(xì)胞貼壁后加入藥物AML，濃度分別為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 μmol/L，每組做6個(gè)復(fù)孔，再取消化后的L-02細(xì)胞，以每孔1×104個(gè)細(xì)胞密度接種于96孔板。觀察細(xì)胞貼壁后加入藥物TP，濃度分別為23、24、25、26、27、28、29、30、31 nmol/L, 每組做6個(gè)復(fù)孔。加藥刺激24 h。并于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均加入MTT(5 mg/ml)20 μl并繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將上清液倒掉，每孔再加入DMSO 200 μl，震蕩至溶解完全，以酶標(biāo)儀測定490 nm吸光度。

1.2.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組及對肝細(xì)胞存活的影響 取消化后L-02細(xì)胞，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞密度接種于6孔板。觀察細(xì)胞貼壁后將細(xì)胞分為C組、TP組、TP+CBZ組、TP+AML組。C組加入少量DMSO作空白對照，TP組加入23 nmol/L的TP，TP+CBZ組加入23 nmol/L的雷公藤甲素和25 μmol/L的CBZ，TP+AML組加入23 nmol/L的TP和10 μmol/L的AML，作用24 h。貼壁細(xì)胞的收集用不含有乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)的胰酶消化(胰酶消化的時(shí)間不易過長，否則易引起假陽性)，1 000 r/min 離心5 min后收集，用PBS洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞(1～5)×105個(gè)，然后加入100 μl的Binding Buffer懸浮細(xì)胞，再加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，最后加入2 μl Propidium Iodide，充分混勻。避光、室溫37 ℃、反應(yīng)時(shí)間5～15 min，在1 h內(nèi)，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。并單獨(dú)收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)液用于檢測。

1.2.3動物實(shí)驗(yàn)分組 取24只C57BL/6雄性小鼠(6～8周)，喂養(yǎng)1周適應(yīng)環(huán)境后分別喂食正常飼料、TP(0.6 mg/kg/d)、TP(0.6 mg/kg/d)+AML(1.0 mg/kg/d)、TP(0.6 mg/kg/d)+CBZ(24 mg/kg/d)，喂食2周后安樂死，取血清、肝臟。

1.2.4小鼠蘇木精-伊紅(HE)染色 將活組織用4%多聚甲醛溶液固定后包埋在石蠟中。將切片(4 μm)用蘇木精(5%)染色10 min。首先將組織切片在蒸餾水中漂洗、酸化，然后在伊紅中染色5 min。脫水和蓋玻片安裝后，在明視野顯微鏡下觀察組織切片。

1.2.5ALT、AST的檢測 按照試劑盒說明書用酶標(biāo)儀測定各組L-02細(xì)胞上清液和小鼠血清中AST、ALT的含量。

1.2.6CYP3A4 mRNA的檢測 采用RT-PCR法，首先按照takara試劑盒說明書提取4組L-02細(xì)胞及小鼠肝臟的RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。使用qPCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl。

CYP3A4上游引物：5′-GCACCGAGTGGATTTCCTTC-3′;下游引物：5′-CGTGGTTTCATAGCCAGCAA-3′。β-acting上游引物：5′-AGTGTGACGTTGACATCCGT-3′,下游引物：5′-TGCTAGGAGCCAGAGCAGTA-3′。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct計(jì)算mRNA表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7CYP3A4的Western blot分析 采用Western blot 法，收取4組L-02細(xì)胞和小鼠肝臟并加入RIPA細(xì)胞裂解液提取蛋白質(zhì)，1 ∶4加入5X上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min冷卻后上SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，半干轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜;5%脫脂奶粉封閉;滴加CYP3A4一抗(CYP3A4抗體，兔，武漢三鷹，1 ∶1 000；β-actin抗體，小鼠，中杉金橋，1 ∶1 000),4 ℃過夜;加入適當(dāng)稀釋度的辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP) 標(biāo)記的二抗(山羊抗兔辣根過氧化物酶，中杉金橋，1 ∶5 000),室溫孵育2 h,然后TBST洗滌3次;加入 ECL曝光液,曝光顯影后,使用 Image J 軟件進(jìn)行條帶分析。

1.2.8TP含量檢測 取L-02細(xì)胞上清液和小鼠血清，加入地西泮溶液作為內(nèi)標(biāo)溶液，溶劑為甲醇，流動相為甲醇 ∶水(50 ∶50)，流速1 ml/min，柱溫40 ℃，檢測波長217 nm。精密吸取200 μl內(nèi)標(biāo)液(0.5 μg/ml)于玻璃試管中，40 ℃氮?dú)獯蹈?。先后于此玻璃管中加? ml培養(yǎng)液，渦旋混合3 min，1 200 r/min離心5 min，取上清液后加入1 ml乙酸乙酯，靜置分層后，12 000 r/min離心30 min，離心后取上清液，用氮?dú)獯蹈?，溶解?00 μl甲醇中，取20 μl進(jìn)樣。

2 結(jié)果

2.1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同濃度的CBZ對L-02細(xì)胞的抑制率如圖1A所示，不同濃度的AML對L-02細(xì)胞的抑制率如圖1B所示，不同濃度的TP對L-02細(xì)胞的抑制率如圖1C所示，但在選擇藥物對細(xì)胞作用的最佳濃度時(shí)，應(yīng)考慮到細(xì)胞存活率這個(gè)影響因素，若細(xì)胞存活率過低，提示藥物對細(xì)胞造成過度損傷，過度損傷的細(xì)胞再用藥物進(jìn)行作用，效果不明顯。故本研究最終選擇CBZ的藥物作用濃度為25 μmol/L，AML的藥物作用濃度為10 μmol/L,TP的藥物作用濃度為23 nmol/L，因?yàn)檫@個(gè)藥物濃度對L-02細(xì)胞的損傷作用較小，L-02細(xì)胞的存活率較高。

2.2 藥物聯(lián)合應(yīng)用后各組細(xì)胞凋亡率如圖2所示，在L-02細(xì)胞中單獨(dú)加入TP后與正常組相比細(xì)胞凋亡率升高，加入CYP3A4酶誘導(dǎo)劑TP+CBZ 組細(xì)胞凋亡率與TP組相比有所降低，但仍高于正常組的凋亡率，CYP3A4酶抑制劑的TP+AML組細(xì)胞凋亡率與TP組相比有所升高。

圖1 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A：CBZ；B：AML；C：TP；0 nmol/L比較：**P<0.01

2.3 各組細(xì)胞上清的ALT、AST含量使用試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALT、AST結(jié)果如圖3所示，在圖中可以看出TP+AML且中的AST、ALT含量最高，說明抑制劑組的L-02細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重，其次是TP組，再然后是TP+CBZ組。

圖2 各組細(xì)胞凋亡結(jié)果 A: 細(xì)胞流式圖；B：凋亡定量分析圖；C：正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

圖3 各組細(xì)胞上清AST和ALT含量

A：各組細(xì)胞上清AST含量；B：各組細(xì)胞上清ALT含量；C：正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

2.4 各組肝臟細(xì)胞CYP3A4 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平定量PCR結(jié)果表明，TP明顯下調(diào)肝臟細(xì)胞CYP3A4 mRNA表達(dá)，CBZ顯著拮抗TP對肝臟細(xì)胞CYP3A4 mRNA表達(dá)的下調(diào)效應(yīng)，而AML進(jìn)一步加劇TP對肝臟細(xì)胞CYP3A4 mRNA表達(dá)的下調(diào)效應(yīng)(圖4A)。Western blot結(jié)果顯示，TP明顯下調(diào)肝臟細(xì)胞CYP3A4 蛋白質(zhì)表達(dá)，CBZ顯著拮抗TP對肝臟細(xì)胞CYP3A4 蛋白質(zhì)表達(dá)的下調(diào)效應(yīng)，而AML進(jìn)一步加劇TP對肝臟細(xì)胞CYP3A4 蛋白質(zhì)表達(dá)的下調(diào)效應(yīng)(圖4B)。

2.5 各組細(xì)胞上清中TP的含量高效液相色譜結(jié)果顯示，該方法的校正曲線公式為Y=503.5X-0.564(R2=0.999)。高效液相色譜圖結(jié)果如圖5，各組培養(yǎng)基中剩余TP的含量如表1，結(jié)果顯示TP+AML組中TP的含量最高，TP+CBZ組中TP的含量最低。

表1 各組中剩余TP含量

與TP組比較：*P<0.05

圖4 聯(lián)合用藥后各組CYP3A4 mRNA和蛋白表達(dá)水平

A：CYP3A4 mRNA水平；B：CYP3A4蛋白表達(dá)水平；C: 正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

2.6 小鼠肝臟HE染色結(jié)果與血清AST、ALT的含量HE染色結(jié)果顯示TP+AML組肝臟損傷最為嚴(yán)重，AST及ALT的含量最高。其次是TP組，程度最輕的是TP+CBZ組。見圖6。

2.7 各組小鼠肝臟中CYP3A4的mRNA及蛋白表達(dá)水平結(jié)果顯示TP+AML組的CYP3A4的mRNA及蛋白表達(dá)最低，其次是TP組，降低最少的是TP+CBZ組。見圖7。

2.8 各組小鼠血清中TP的含量高效液相色譜結(jié)果顯示各組小鼠血清中TP的含量如表1，結(jié)果顯示TP+AML組中TP的含量最高，TP+CBZ組中TP的含量最低。

3 討論

既往研究[9]表明，TP可通過多種機(jī)制引起肝損傷，如誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)、引起免疫損傷等，其中CYP450代謝異常是藥物性肝損傷的主要發(fā)病機(jī)制之一[10]。一項(xiàng)關(guān)于肝臟小鼠模型的研究[11]報(bào)道，肝臟CYP450的失活抑制了肝臟中的TP代謝，導(dǎo)致該化合物的生物利用度和毒性增加。

圖5 高效液相色譜圖

A：未添加；B：添加TP；C：添加地西泮；D：添加地西泮和TP；1：地西泮(內(nèi)標(biāo))；2：TP

CYP450酶參與大多數(shù)異生化合物的生物轉(zhuǎn)化[12]。CYP3A4是CYP450的一種亞型，TP主要被CYP3A代謝[10]。CYP3A4不僅參與了TP的代謝，TP對它還有一定的抑制作用[13]。本研究以正常肝細(xì)胞L-02 和C57BL/6雄性小鼠為對象，探討CYP3A4在TP對肝損傷中的作用。

圖6 肝臟HE染色結(jié)果與血清AST、ALT的含量

A： HE染色結(jié)果×200(空泡代表肝臟損傷)；B:小鼠血清中AST含量；C: 小鼠血清中ALT含量； C：正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

本研究的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TP對L-02細(xì)胞和C57BL/6雄性小鼠的CYP3A4的表達(dá)均有明顯的抑制作用，與此同時(shí)，TP對L-02細(xì)胞和C57BL/6小鼠肝臟均有損傷作用。加入CYP3A4抑制劑AML后，CYP3A4的表達(dá)進(jìn)一步減少，TP含量明顯增加，提示TP代謝降低，其結(jié)果是TP對L-02細(xì)胞以及小鼠肝臟的損傷增大；與之相反，加入CYP3A4誘導(dǎo)劑CBZ后，CYP3A4的表達(dá)明顯增加，TP含量明顯降低，提示TP代謝加速，產(chǎn)生的結(jié)果是TP對L-02細(xì)胞和小鼠肝臟的損傷則顯著降低。

圖7 聯(lián)合用藥后各組CYP3A4的蛋白及mRNA結(jié)果

A：CYP3A4 mRNA水平；B：CYP3A4蛋白表達(dá)水平；C: CYP3A4/β-actin； C：正常組；TP：TP組；CA：TP+CBZ組；AM：TP+AML組；與C組比較：##P<0.01；與TP組比較：**P<0.01

由上述結(jié)果可能得出結(jié)論，TP通過抑制了CYP3A4的表達(dá)，減慢自身代謝，因而造成對了肝臟的損傷，但是否是產(chǎn)生肝損傷的主要機(jī)制還有待下一步的實(shí)驗(yàn)證明。