孕晚期炎癥暴露對中老年子鼠海馬谷氨酸受體1含量及與認知損害相關性研究

孫似玉，葛荷花，莊戰(zhàn)強，李學偉，陳貴海

衰老相關性認知功能減退是老年期癡呆癥最一致的危險因素，但確切發(fā)病機制尚不清楚。中樞神經系統(tǒng)突觸可塑性改變可能參與其中[1]。α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異反應丙酸受體(AMPAR)是一種離子型谷氨酸受體，構成亞基為谷氨酸受體(GluR)1～4，在突觸可塑性中起重要作用。研究表明海馬區(qū)GluR1表達增加可改善大鼠海馬依賴的空間學習記憶[2-3]。細菌脂多糖(LPS)是革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，會引起機體產生炎癥反應。研究[4]發(fā)現孕晚期母體暴露LPS，可加速子代衰老相關性學習記憶損害。然而，目前對衰老過程中海馬GluR1含量改變與空間學習記憶損害的相關性尚不了解，母孕晚期炎癥暴露是否會加速改變也未見報道。該研究采用正常衰老及母孕期炎癥暴露加速衰老小鼠模型，探討衰老是否伴隨海馬GluR1含量改變及其是否與空間學習記憶能力改變相關，母孕晚期炎癥暴露是否會加重這種改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑清潔級2月齡CD-1小鼠(合格證號：NO.43 004 700 010 146)，購自湖南省斯萊克景達實驗動物公司。兔多克隆Anti-Glutamate Receptor1一抗(1 ∶1 000,美國Abcam 公司)；辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗(1 ∶20 000，北京Zs-BIO公司)。

1.2 實驗動物模型建立清潔級2月齡CD-1小鼠(雌鼠25～27 g，雄鼠28～30 g)飼養(yǎng)于本實驗室動物房，實驗動物正常進食攝水，適應環(huán)境1周，維持溫度(22±1) ℃，濕度(50±5)%。明暗周期12 h交替進行。CD-1小鼠按1 ∶2(雄 ∶雌)于21:00合籠，次日7:00查陰栓。查到陰栓者定為受孕第0天(G0)。受孕鼠單籠飼養(yǎng)并隨機分為LPS組和生理鹽水組，LPS組在孕第15～17天每天經腹腔注射LPS 50 μg/kg，生理鹽水組同期經腹腔注射等容積生理鹽水。將兩組產下的子代小鼠各取12只雄鼠，再隨機分為3月齡和15月齡，即3月齡生理鹽水組、3月齡LPS組、15月齡生理鹽水組和15月齡LPS組。所有實驗操作均符合安徽醫(yī)科大學動物實驗倫理委員會的要求。

1.3 行為學檢測采用Morris水迷宮任務對動物的空間學習記憶能力進行檢測。實驗裝置為直徑150 cm，高30 cm的圓形黑色水池，池內充入適量自來水，水溫保持在(22±2) ℃，水池內放入一個直徑10 cm，高24 cm的黑色圓柱狀平臺。迷宮周圍用白色布簾圍起，距水池底1.5 m高處，等距離懸掛三個黑色線索，上方安裝攝像系統(tǒng)，采集小鼠在水迷宮中的運動軌跡，運用Any-maze軟件對圖像進行分析。實驗過程分為定位航行(學習)期和空間探索(記憶)期。定位航行期：平臺固定于靶象限(定義第四象限為靶象限)，低于水面1 cm，首次測試前，將小鼠放到平臺休息30 s。然后將小鼠從不同象限面向池壁放入水中，游泳60 s以便尋找平臺，60 s內無論是否成功游上平臺都將小鼠放到平臺休息30 s。每次測試間隔約15 min，每天完成4次測試，重復7 d?？臻g探索期：在定位航行階段的最后1 d，小鼠完成4次測試后，休息30 min,撤去平臺，將小鼠從靶象限相對的象限放入，自由探索60 s。本實驗選取小鼠在定位航行期的平均游泳路程作為學習能力指標和在空間探索期的靶象限游泳路程占總路程的百分比作為記憶能力的指標。

1.4 標本制備行為學結束15 d，小鼠氟烷吸入麻醉，頸脫臼處死，冰上取腦快速分離出海馬，置于-80 ℃超低溫冰箱凍存。

1.5 Western blot分析蛋白質中性裂解緩沖液(RIPA)提取蛋白組織，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液,沸水浴加熱10 min，以充分變性蛋白, 待樣品冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣SDS-PAGE膠加樣孔內,電泳儀先用80 V、30 min；然后改為120 V、1 h。恒流轉膜110 min，漂洗5 min后，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗[Anti-Glutamate Receptor1抗體屬性為兔抗1 ∶1 000稀釋(10%分離膠)]，4 ℃過夜。第2天PBST洗滌3次10 min。加入二抗(1 ∶20 000),室溫孵育2 h,PBST洗滌后，用ECL發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。Image J軟件進行膠片條帶的結果分析，計算GluR1的相對表達量。

2 結果

2.1 Morris水迷宮實驗

2.1.1學習期 重復測量方差分析表明(圖1A)所有小鼠合并的游泳路程隨天數增加而下降[F(6,120)=71.367,P<0.01],且四組間游泳路程差異有統(tǒng)計學意義[F(3,20)=14.996,P<0.01]。兩兩比較分析顯示，15月齡生理鹽水組的游泳路程比3月齡生理鹽水組延長，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014)；15月齡LPS組也比同齡生理鹽水組延長，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.011)；在3月齡時，LPS組與生理鹽水組間游泳路程差異無統(tǒng)計學意義(P=0.645)。

2.1.2記憶期 四組間小鼠游泳路程百分比差異有統(tǒng)計學意義[F(3,20)=13.175,P<0.01],組間比較顯示，與3月齡生理鹽水組相比，15月齡生理鹽水組在靶象限的游泳路程百分比下降，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.012；圖1B)；與同齡生理鹽水組相比，15月齡LPS組在靶象限的游泳路程百分比下降，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.043)，而3月齡時的LPS組與生理鹽水組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.167)。

圖1 各組小鼠學習期游泳路和記憶期靶象限游泳路程百分比比較

A：游泳路程；B：游泳路程百分比；與3月齡生理鹽水組比較：*P<0.05；與15月齡生理鹽水組比較：#P<0.05

2.2 海馬GluR1水平免疫印跡結果表明四組間的海馬GluR1水平差異有統(tǒng)計學意義(F=334.583，P<0.01)，組間比較顯示，15月齡生理鹽水組海馬GluR1水平低于3月齡生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；15月齡LPS組海馬GluR1水平低于同齡生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；而3月齡的LPS組和生理鹽水組間差異無統(tǒng)計學意義(P=0.964)。見圖2。

圖2 Western Blot檢測小鼠海馬GluR1的表達

與3月齡生理鹽水組比較：**P<0.01；與15月生理鹽水組比較：##P<0.01

2.3 海馬GluR1水平與空間學習記憶能力的相關性Pearson相關分析表明，15月齡生理鹽水組和LPS組海馬GluR1水平均與游泳路程負相關(r=-0.853，P=0.03；r=-0.919，P=0.01)，與靶象限游泳路程百分比正相關(r=0.968，P=0.002；r=0.906，P=0.013)，而3月齡生理鹽水組和LPS組GluR1水平均與游泳路程和靶象限的游泳路程百分比無相關性(P>0.05)，見表1。

表1 海馬GluR1水平與Morris水迷宮成績的相關性

3 討論

眾所周知，隨著年齡的不斷增長，人類和嚙齒動物的各項生理機能都發(fā)生著退行性變化，而大腦區(qū)域的海馬在衰老過程中尤其脆弱。海馬的結構和功能完整性對正常的學習、記憶鞏固和突觸可塑性至關重要[5]。研究[6]表明衰老會導致海馬相關性空間學習記憶減退，且母孕晚期炎癥暴露會導致小鼠海馬相關性空間記憶在中年早期出現減退[7]，如在Morris水迷宮定位航行期和空間探索期, 13月齡的CD-1小鼠，LPS組的學習成績和記憶成績均顯著低于生理鹽水組。本實驗表明，15月齡生理鹽水組比3月齡生理鹽水組的游泳路程延長(P=0.014)，在靶象限的游泳路程百分比下降(P=0.012)；15月齡LPS組比同齡生理鹽水組的游泳路程延長(P=0.011)，在靶象限的游泳路程百分比下降(P=0.043)。這表明CD-1小鼠發(fā)生了空間學習記憶損害且母孕晚期炎癥刺激會加速其損害，與既往的研究相一致[8]。

成人疾病胎源學說認為生命早期暴露不良因素，尤其是胚胎期會造成胎兒組織器官發(fā)生永久性“程序化改變”，使得個體成年后對外界不良因素(如應激、炎癥、衰老等)抵抗力降低，增加了個體對許多慢性疾病的易感性如老年癡呆癥、糖尿病、高血壓等[9]。炎癥感染是母體孕期遭受不良因素最常見的現象之一。LPS是實驗動物模型中經典的炎癥刺激劑，孕晚期母鼠暴露LPS可模擬小鼠生命早期遭受炎癥刺激[10]。前期實驗室研究證明低劑量LPS的母體暴露不會導致子鼠死亡或發(fā)育異常，但會導致小鼠提前出現學習和記憶能力減退[7]。突觸后膜上AMPA受體是離子型門控通道受體，其數量和亞單位組成決定了中樞神經系統(tǒng)中谷氨酸能信號傳遞的快慢，同時也調控突觸可塑性的表達。在海馬區(qū)，90%的AMPA受體復合物由GluR1/R2或GluR2/R3異構體組成，其中CA1錐體神經元突觸AMPA受體近80%由GluR1/R2異構體組成[11-12]。目前有研究[13]結果表明，母代睡眠剝奪(MSD)誘導的突觸后AMPAR內吞作用，導致LTP受損和LTD增加，海馬突觸可塑性受損，從而破壞后代的情緒和認知功能。而AMPAR內吞抑制劑可以拮抗MSD誘導的AMPAR內吞作用，從而恢復正常突觸可塑性，減少后代行為障礙和改善其認知功能[13]。含GluR1的AMPA受體在海馬突觸可塑性、學習和記憶中起著重要的作用[3]。研究[14]結果表明,IL-1β減少AMPA受體亞基GluR1磷酸化和GluR1的表面表達，影響記憶再鞏固過程。本研究表明15月齡生理鹽水組較3月齡生理鹽水組海馬GluR1水平下降(P<0.01)，15月齡LPS組較同齡生理鹽水組海馬GluR1水平下降(P<0.01)，表明衰老會導致海馬GluR1水平下降，炎癥刺激會加速其下降水平。

Pearson相關分析表明，15月齡生理鹽水組和LPS組海馬GluR1水平與學習期游泳路程呈負相關，記憶期靶象限的游泳路程百分比呈正相關。而3月齡生理鹽水組和LPS組學習期游泳路程和記憶期靶象限的游泳路程百分比與小鼠海馬GluR1水平無相關性。這些結果提示海馬GluR1水平的降低可能與海馬依賴性的空間學習記憶能力損害有關，其機制可能是與海馬突觸傳遞和突觸可塑性的形成損害有關[15]。

綜上，孕晚期母體炎癥暴露會加速子代海馬GluR1含量下降及空間學習記憶損害。但該實驗僅采用蛋白質免疫印跡實驗，方法單一，其具體機制還有待進一步探究。