大動脈炎患者外周血單個核細胞中Toll樣受體和程序性死亡受體1的表達

田苡簫,楊云嬌，李菁

大動脈炎(Takayasu arteritis，TAK)是一種主要累及主動脈及其分支的自身免疫炎癥性疾病，病理特征為非特異性慢性肉芽腫性全層動脈炎。大動脈炎的發(fā)病可能與感染有關(guān)，外來抗原可能通過活化樹突狀細胞(dendritic cell，DC)上的Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)間接活化初始T細胞、誘發(fā)本病，程序性死亡受體1(programmed cell death-1，PD-1)可能介導(dǎo)了這一過程。本研究通過對TAK患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的TLRs、PD-1及其配體、NFκB通路相關(guān)分子等共20個目的基因的mRNA水平進行檢測，對TAK患者體內(nèi)TLRs和PD-1的功能狀態(tài)進行初步評估。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2019年4月至6月自北京協(xié)和醫(yī)院風(fēng)濕免疫科門診納入TAK患者20例，均符合1990年美國風(fēng)濕病協(xié)會診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，用1994年NIH標(biāo)準(zhǔn)評估疾病活動性，具體標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)全身癥狀，如發(fā)熱、無明確原因的肌肉骨骼癥狀；(2)紅細胞沉降率升高；(3)血管受損或炎癥癥狀，如跛行、脈搏減弱或無脈、血管雜音、血管疼痛、上(下)肢血壓不對稱；(4)典型的血管影像學(xué)特征。具有2項或2項以上新發(fā)或加重的癥狀即為活動期TAK[2]。按照性別和年齡匹配，納入健康對照10例。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

采集靜脈血10 mL，分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)[3]后提取總RNA[4]，去除基因組DNA后進行反轉(zhuǎn)錄。檢測引物的擴增效率、特異性和Cq值的線性范圍[5]，用geNorm在9個候選內(nèi)參基因中選取最合適的組合基因“琥珀酸脫氫酶復(fù)合體黃素蛋白亞基A(succinate dehydrogenase complex flavopro-tein subunit A，SDHA)-β2微球蛋白(beta-2-microglobulin，B2M)”為本研究的內(nèi)參基因，進行逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription real time quantitative poly-merase chain reaction,RT-qPCR)檢測。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)的目的基因和引物序列

RT-qPCR檢測的目的基因和引物序列見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

當(dāng)引物的擴增效率在86%～110%時，相對定量的計算方法為2-ΔΔCt法[6]；若不符合則使用Pfaffl法[7]。用Kolmogorov-Smirnov對計量變量進行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布時表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，不符合時表示為“中位數(shù)(第一四分位數(shù)，第三四分位數(shù))”。計量變量符合正態(tài)分布時用非配對t檢驗進行組間差異分析，計量變量不符合正態(tài)分布或計數(shù)變量時用Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較，分析軟件為Graphpad Prism 7.0。2個目的基因之間的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)性分析，分析軟件為SPSS Statistic 23。P<0.05認為存在統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TAK患者的實驗室參數(shù)和臨床特征

患者均為漢族(男性1例，女性19例)，其中活動期11例(活動組)，非活動期9例(非活動組)，入組患者的一般情況和臨床特征見表 2。健康對照均為漢族(男性1例，女性9例)。

2.2 目的基因表達差異分析

TAK患者與健康對照組比較，TAK活動組與非活動組患者比較結(jié)果見圖1，表達水平存在顯著差異(P<0.05)的基因見表3。PD-1 mRNA/CD28 mRNA和PD-L1 mRNA/CD28 mRNA的組間比較顯示，總TAK、TAK活動組和TAK非活動組PD-1 mRNA/CD28 mRNA比值較對照組升高(P<0.05), TAK非活動組PD-L1 mRNA/CD28 mRNA比值較對照組升高(P<0.05)。TAK活動組PD-1 mRNA/CD28 mRNA、PD-L1 mRNA/CD28比值較TAK非活動組降低(P<0.05)。

2.3 目的基因表達水平相關(guān)性分析

PD-1、PD-L1、CD28、TLR2、TLR4、CD40 mRNA水平與其他目的基因mRNA水平Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，PD-1 mRNA水平與TLRs-NFκB通路相關(guān)分子中的p50、p65、IκBα mRNA水平具有正相關(guān)性，與CD40 mRNA水平具有負相關(guān)性；PD-L1 mRNA水平與TLRs-NFκB通路相關(guān)分子中的p50、p65、CD83 mRNA水平具有正相關(guān)性(表4)。

表1 RT-qPCR檢測的目的基因和引物序列Table 1 Primer sequences for target genes of RT-qPCR

PD-1:程序性死亡受體1，PDCD1；PD-L1:程序性死亡受體1配體1，即CD274；PD-L2:程序性死亡受體配體2；CD3ζ:CD3分子ζ鏈，即CD247 molecule；TCR:T細胞受體；NR4A1:孤兒核受體亞家族4組A成員1；TLR1:Toll樣受體1；p50:核因子κB亞基1；p65:核因子κB亞基RELA原癌基因；IκBα:核因子κB抑制因子α；CCL5:C-C基序趨化因子配體5；TNF:腫瘤壞死因子；CD40L:CD40配體；B2M:β2微球蛋白；SDHA:琥珀酸脫氫酶復(fù)合體黃素蛋白亞基A

表2 大動脈炎患者的實驗室參數(shù)和臨床特征Table 2 Laboratory parameters and clinical features of patients with Takayasu Arteritis (TAK)

表3 大動脈炎患者目的基因表達差異Table 3 Differences of target genes’ expression in PBMCs from patients with Takayasu Arteritis (TAK)

*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001

圖 1在mRNA表達水平上具有統(tǒng)計學(xué)差異的目的基因

Fig1Target genes with statistical differences in mRNA abundance

A:總TAK、TAK活動組和TAK非活動組比對照組CD40 mRNA表達降低(P<0.05); B：TAK非活動組比對照組CD28 mRNA表達降低(P<0.05)，活動組TAK比非活動組CD28 mRNA表達升高(P<0.05)；C,D:與對照組相比，總TAK和TAK非活動組TLR2 mRNA、總TAK的TLR4 mRNA表達升高(P<0.05); E,F:TAK活動組比對照組p50 mRNA、p65 mRNA表達升高(P<0.05),TAK活動組比TAK非活動組p50 mRNA表達升高(P<0.05); G：與對照組相比，總TAK、TAK活動組和TAK非活動組IκBα mRNA表達升高(P<0.05); H:總TAK和TAK活動組比對照組PD-1 mRNA表達升高(P<0.05); I:總TAK和TAK非活動組比對照組TCR mRNA表達降低(P<0.05),TAK活動組比TAK非活動組TCR mRNA表達升高(P<0.05)

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，活動性TAK患者的PBMCs中p50、p65、IκBα較健康對照組上調(diào)，提示存在NFκB的活化，NFκB活化促進IκBα的合成，同時糖皮質(zhì)激素通過上調(diào)IκBα抑制NFκB的活化[8]，這可能是IκBα上調(diào)幅度高于p50和p65的原因。TAK患者PBMCs中TLR2、TLR4較健康對照組顯著上調(diào)，并與NFκB的活化呈現(xiàn)出較強的正相關(guān)性，但是，其他NFκB的上游分子CD40、TCR、CD28未有類似表現(xiàn)，提示TAK患者體內(nèi)NFκB的活化與TLRs有關(guān)。有研究顯示，在大中動脈的血管壁中，只有TLR2與TLR4普遍表達，其他TLRs呈選擇性或較低水平表達[9]，結(jié)合本研究結(jié)果，考慮TLR2與TLR4在TAK的發(fā)病機制中可能發(fā)揮作用。Kabeerdoss等[10]亦測得TAK患者PBMCs中TLR4的表達上調(diào)，與本研究結(jié)果一致。

表4 Spearman分析PD-1、PD-L1、CD28、TLR2、TLR4、CD40與其他目的基因在表達水平上的相關(guān)性Table 4 The correlations between gene expressions of PD-1, PD-L1, CD28, TLR2, TLR4 or CD40 with other target genes by Spearman Correlation Analysis

PD-1：程序性死亡受體1，PDCD1；PD-L1：程序性死亡受體1配體1，即CD274； TCR：T細胞受體；NR4A1：孤兒核受體亞家族4組A成員1；TLR1：Toll樣受體1；p50:核因子κB亞基1；p65：核因子κB亞基RELA原癌基因；IκBα：核因子κB抑制因子α；TNF：腫瘤壞死因子；CD40L：CD40配體

本研究檢測到TAK患者PBMCs中TLR2、TLR4、p50、p65和IκBα的mRNA表達上調(diào)：(1)TLR2和TLR4同時上調(diào)在炎癥中比較常見，常伴有Th17升高，例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；(2)這可能與血清高遷移率組蛋白1(high mobility group box-1，HMGB1)表達水平升高有關(guān)，HMGB1是大中血管的組分，血管破壞時釋放到血清，通過TLR2-MyD88-SP1途徑促進缺氧誘導(dǎo)的血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF，促進血栓形成)上調(diào)[11]，還可以通過激活DC及Th0細胞中的TLR2、TLR4、NFκB信號通路間接促進Th2、Th17的分化[12]；另外，小鼠頸總動脈受損時HMGB1激活TLR4，可能是驅(qū)動血管炎癥的主要抗原之一[13]。

活化的TLR2、TLR4可引起：(1)Treg上的TLR2活化會降低Treg的功能并使其偏向Th17的表型[14]，從而破壞Treg/Th17的平衡，可能與感染活化自身反應(yīng)性T細胞有關(guān)；(2)TLR2還有抑制炎癥的作用，TLR2-/-的IL1rn-/-小鼠的自發(fā)性關(guān)節(jié)炎癥狀加重[15]，可能與TLR2通過Fcγ受體抑制該途徑介導(dǎo)的炎癥有關(guān)[16]；(3)動脈外膜中DC上的TLR4被脂多糖刺激后上調(diào)CCL20，從而募集CCR6+T細胞至病變部位[17]，引起透壁性血管炎，與TAK病理變化相符[17-18]；(4)活化的TLR4促使巨噬細胞形成泡沫細胞，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生[19]。

在TAK患者的PBMCs中，PD-1 mRNA上調(diào)。PD-1、PD-L1表達水平與NFκB的活化程度存在一定程度的正相關(guān)性，提示PD-1、PD-L1表達水平與NFκB可能存在調(diào)控關(guān)系，這與文獻報道的NFκB可以上調(diào)PD-1、PD-L1的表達[20-21]相一致。CD28的活化通過提高T細胞線粒體對氧氣和葡萄糖的利用率，為T細胞接受抗原刺激之后的活化和分化提供能量[22]，而PD-1通過去磷酸化CD28阻斷該途徑、抑制T細胞活化[23]；PD-1的活化還需要配體(如PD-L1)，由此推測PD-1、PD-L1與CD28的比例可能與CD28的活化程度有關(guān)?；顒有訲AK患者與非活動組相比，PBMCs中的PD-1 mRNA/CD28 mRNA與PD-L1 mRNA/CD28 mRNA比值降低，提示PD-1和CD28的活化與大動脈炎的發(fā)病及活動性有關(guān)。PD-1的上調(diào)可能與糖皮質(zhì)激素有關(guān)[24-25]，激活PD-1或阻斷CD28的治療可能對TAK患者有效。這與一項通過阻斷CD28治療巨細胞動脈炎的研究[26]觀點一致。

TAK患者CD40表達顯著下調(diào)，活動組與非活動組間無差異，糖皮質(zhì)激素每日劑量與CD40 mRNA水平呈負相關(guān)，提示糖皮質(zhì)激素可能通過下調(diào)CD40抑制T細胞活化[27]。

綜上所述，TAK患者外周血單個核細胞存在TLR2、TLR4、PD-1的上調(diào)，調(diào)控TLRs、PD-1可能有助于控制TAK疾病活動性。