含兩性離子前體聚氨酯的合成及防污性能研究a

曹耀勻, 馬 駿, 吳碧梅, 夏枚生, 陳圣福

(1. 浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院, 浙江 杭州310027; 2. 浙江大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 舟山 316021)

1 前 言

生物醫(yī)學(xué)[1]和海洋防污[2]等領(lǐng)域一直面臨著蛋白質(zhì)等生物大分子非特異性吸附的困境。蛋白質(zhì)等在生醫(yī)材料表面吸附能導(dǎo)致炎癥、免疫等許多不良后果，嚴(yán)重影響患者的康復(fù)[3]。海洋設(shè)備表面易被蛋白質(zhì)、微生物、動植物吸附，嚴(yán)重影響海洋工程設(shè)備的正常使用[4-5]。例如，船體表面的海洋生物附著造成燃耗量大幅度增加，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失和加劇環(huán)境污染[6]。先前采用釋放抗生素雷帕霉素等用于生物防污[7]，重金屬銅等用于海洋防污[8]以抑制生物附著，但因危害環(huán)境而逐漸被取代。因此，研究環(huán)境友好型防污材料成為當(dāng)下的熱點。其中，攜有等量正負(fù)電荷的兩性離子材料具有親水性，能在材料表面形成具有能量屏障和物理阻隔能力的水合層，因而具備環(huán)境友好的防污性能[9]。然而，該材料穩(wěn)定性及防污持久性較差。在此基礎(chǔ)上，CHEN等[10]將兩性離子酯化為兩性離子前體以提高其穩(wěn)定性。當(dāng)其暴露于水環(huán)境中，材料表面附近的酯能逐漸水解轉(zhuǎn)換為具有防污性能的兩性離子。隨著表面水不斷滲透到材料內(nèi)部，侵蝕的材料表面被新水解的兩性離子不斷更換，因而長期具備防污性能。

為了制備具有優(yōu)異防污性能的含兩性離子前體材料，JI等[11]制得羧酸甜菜堿酯類似物(carboxybetaine ester，CBE)醫(yī)用敷料，但其防污性能一般。HUNG等[12]制得甲基取代叔胺型羧酸甜菜堿酯(tertiary carboxybetaine ester，TCBR)生物醫(yī)學(xué)材料，具有優(yōu)異的防污性能。這是因為縮短了兩性離子中氨基和羧基的距離，兩性離子的親水性得以增強(qiáng)。上述研究材料均是通過自由基共聚方式以共價鍵連接而制得，雖然具有良好的穩(wěn)定性，但其呈現(xiàn)體相交聯(lián)狀態(tài)，在應(yīng)用上有一定的局限性。繼而，WANG等[13]將CBE引入聚氨酯中制得涂層類材料，具有更廣闊的應(yīng)用前景。然而，其耐水性差、機(jī)械強(qiáng)度低，存在一定的缺陷。為了實現(xiàn)材料同時具有強(qiáng)效持久的防污性能和物理性能，本文設(shè)計合成以乙基取代叔胺型羧酸甜菜堿叔丁酯(tertiary ethyl carboxybetaine t-butyl，TECBT)為兩性離子前體的聚氨酯材料。TECBT水解后產(chǎn)生帶負(fù)電的COO─基團(tuán)，同時較強(qiáng)堿性的叔胺基團(tuán)易結(jié)合氫離子帶上正電荷，形成兩性離子。通過憎水基體使兩性離子前體的酯水解速度減慢[14]，增強(qiáng)材料防污的長效性與耐水性。同時將寡聚四氫呋喃(polytetrahydrofuran，PTMG)引入聚氨酯材料中，進(jìn)一步改良材料的物理性能[15]。最后采用ATR-IR、接觸角表征水解前后聚氨酯材料化學(xué)結(jié)構(gòu)、親水性的變化；并利用蛋白質(zhì)、細(xì)菌、細(xì)胞吸附實驗表征聚氨酯材料的防污性能。

2 實驗部分

2.1 實驗材料與儀器

2-(乙氨基)乙醇等原料購自TCI(日本)公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗人IgG (HRP-IgG)和TMB顯色試劑盒均購自Beyotime(上海)公司。

2.2 合成步驟

含兩性離子前體聚氨酯pTECBT-PTMG-PU的合成線路示于圖1中。最初合成兩性離子前體TECBT，接著將TECBT通過自由基聚合的方法與鏈轉(zhuǎn)移劑α-硫代甘油反應(yīng)制得雙羥基封端的低聚物pTECBT(OH)2，然后將pTECBT(OH)2與異佛爾酮二異氰酸酯 (isophorone diisocyanate，IPDI) 反應(yīng)制得異氰酸根預(yù)聚體，繼而加入PTMG異氰酸預(yù)聚體、擴(kuò)鏈劑1,4-丁二醇 (1,4-butanediol，BDO) 反應(yīng)制得pTECBT-PTMG-PU。最后添加交聯(lián)劑IPDI固化成膜。具體步驟如下：

圖1 pTECBT-PTMG-PU的合成路線圖 Fig.1 Synthetic route of pTECBT-PTMG-PU

2.2.1 兩性離子前體TECBT的合成

將2-(乙氨基)乙醇(1.1 eq.)，縛酸劑三乙胺(1.1 eq.)溶解于適量無水二氯甲烷(CH2Cl2)中，在冰浴條件下逐滴滴入溴乙酸叔丁酯(1.0 eq.)并攪拌反應(yīng)6 h。將產(chǎn)物分別用飽和Na2CO3及NaCl溶液萃取提純。每次萃取后均使用薄層層析(TLC)確保產(chǎn)物無雜質(zhì)。繼而，干燥、過濾、旋蒸制得淡黃色油狀化合物。將制得化合物溶解于適量無水CH2Cl2中，加入少許阻聚劑2,6-二叔丁基對甲酚和三乙胺(1.3 eq.)，冰浴條件下逐滴滴入甲基丙烯酰氯(1.2 eq.)并攪拌反應(yīng)12 h。萃取、干燥、過濾、旋蒸后即得TECBT，產(chǎn)率約為95%。兩性離子前體TECBT的結(jié)構(gòu)和純度通過核磁共振儀(Advance-400M，瑞士Bruker公司)進(jìn)行1H-NMR表征。

2.2.2 pTECBT(OH)2的合成

使用適量無水四氫呋喃(THF)將TECBT (3.0 eq.)，α-硫代甘油(1.0 eq.)，引發(fā)劑2,2，-二氰基-2,2，-偶氮丙烷(AIBN) (w = 0.01%)溶解。將體系用N2保護(hù)后，60 ℃ 油浴反應(yīng)20 h。冷卻至室溫后，將粗產(chǎn)物用大量正己烷多次沉淀純化，繼而置于干燥箱中42 ℃ 真空過夜干燥。

2.2.3 pTECBT-PTMG-PU的合成

將pTECBT(OH)2(1.0 eq.)和IPDI (2.5 eq.)溶于無水THF中，油浴65 ℃ 反應(yīng)2 h，得到異氰酸根封端的低分量預(yù)聚體。向體系中加入PTMG (Mn= 1 000)異氰酸根預(yù)聚體，BDO (2.0 eq.)，少許催化劑二丁錫繼續(xù)反應(yīng)4 h。所得粗產(chǎn)物純化后置于干燥箱中42 ℃ 真空過夜干燥。

將pTECBT-PTMG-PU溶于適量乙酸乙酯中，加入IPDI并混勻后，涂于自制的Teflon模具中，常溫下使溶劑自然揮發(fā)。

2.3 聚氨酯材料的表征

2.3.1 衰減全反射紅外光譜(ATR-IR)表征 聚氨酯材料的化學(xué)結(jié)構(gòu)通過ATR-IR (Vector22，德國Bruker公司)進(jìn)行表征，掃描范圍為4 000～500 cm-1，分辨率為2 cm-1，掃描次數(shù)為64次。

2.3.2 表面親水性表征 聚氨酯材料的表面親水性通過接觸角測試儀(Digidrop D-1，法國DBX公司)進(jìn)行表征，均使用1000 μL螺旋蓋注射器將10 μL純水液滴滴至待測量樣品的表面進(jìn)行測定。

2.3.3 抗非特異性蛋白質(zhì)吸附性能表征

聚氨酯材料通過酶聯(lián)免疫法(ELISA)測定抗蛋白質(zhì)吸附能力。將樣品置于較強(qiáng)的堿性環(huán)境飽和Na2CO3溶液中以加速樣品的水解，使其檢測更為便捷。具體實驗步驟如下：將聚氨酯材料和聚苯乙烯(tissue culture polystyrene，TCPS)均勻剪切成邊長約為5 mm正方形樣品片，測量并記錄各樣品邊長。繼而置于飽和Na2CO3溶液中水解不同的時間。隨后將樣品用PBS緩沖溶液充分洗滌。將洗滌后的樣品和TCPS置于1 mL濃度為1 μg?mL-1的模型蛋白質(zhì)HRP-IgG中，置于37 ℃ 水平搖床振蕩吸附25 min。充分洗滌樣品后加入500 μL的TMB顯色液。于水平搖床中振蕩顯色20 min后取出樣品，加入1 mol?L-1的HCl溶液500 μL以終止酶活性。最后，根據(jù)酶標(biāo)儀測定吸光度值(λ = 450 nm)。

2.3.4 抗細(xì)菌黏附性能表征

聚氨酯材料的抗細(xì)菌黏附性能以金黃色葡萄球菌(S. aureus)為革蘭氏陽性細(xì)菌模型，以大腸桿菌(E. coli)為革蘭氏陰性細(xì)菌模型進(jìn)行檢測。

以S. aureus為例，具體實驗步驟如下：將聚氨酯材料和TCPS片分別置于l×l06cells?mL-1的S. aureus中，常溫吸附2 h后使用Live/Dead?BackLight染色劑染色。充分洗滌后用熒光顯微鏡(Eclipse Ti-E，日本Nikon公司)在20倍鏡頭下觀察細(xì)菌在材料表面的黏附情況。

2.3.5 抗動物細(xì)胞吸附性能表征

以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)為動物細(xì)胞模型，對聚氨酯材料的抗動物細(xì)胞吸附性能進(jìn)行表征。具體實驗步驟如下：將聚氨酯材料和TCPS片分別置于l×l05cells?mL-1的HUVEC細(xì)胞中，于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h后用熒光素二乙酸(FDA)染色，在20倍鏡頭下觀察HUVEC細(xì)胞在材料表面的吸附和生長。

3 實驗結(jié)果與討論

3.1 聚氨酯材料的合成分析

3.1.1 兩性離子前體TECBT的核磁分析

實驗合成的TECBT單體的1H NMR(400 MHz, CDCl3)示于圖2中。核磁結(jié)果與歸屬結(jié)果如下：6.11 (m，1H)，5.56 (m，1H)，4.24 (t，3H)，3.33 (s，2H)，2.96 (t，2H)，2.76 (q，2H)，1.94 (s，3H)，1.49 (s，9H)，1.10 (t，3H)。由圖可知，產(chǎn)物雜質(zhì)峰較少，雜質(zhì)主要為溶劑CH2Cl2和CDCl3，表明實驗所合成的TECBT較為純凈。

3.1.2 IPDI投料量對樣品分子量及成膜效果的影響

IPDI中 ─NCO基團(tuán)能與樣品中的 ─OH基團(tuán)反應(yīng)，通過擴(kuò)大聚合物的分子量以制得具有一定物理性能的聚氨酯材料。由表1及實驗觀察可知，當(dāng)IPDI小于4 μL?0.1 g-1時，樣品分子量較小，膜片較軟較黏，難脫膜具。當(dāng)IPDI大于12 μL?0.1 g-1時，由于樣品分子量較大，膜片較硬且易裂，難溶于溶劑進(jìn)行GPC測量。當(dāng)IPDI的用量為8 μL?0.1 g-1，樣品分子量適中，呈現(xiàn)最佳的成膜和物理性能。

3.1.3 含兩性離子前體聚氨酯材料形態(tài)觀察

通過一系列反應(yīng)，選用最佳交聯(lián)劑用量，制得的氨酯材料形態(tài)示于圖3中。通過觀察可知，材料的成膜效果良好，呈透明狀，表面致密光滑。將樣品彎曲，拉伸表征說明材料具備優(yōu)異的硬度、彈性等物理性能。

圖2 TECBT的核磁譜圖(氘代氯仿) Fig.2 1H-NMR spectra of TECBT (CDCl3)

表 1 不同IPDI用量 下pTECBT-PTMG-PU 的分子量 Table 1 GPC results of pTECBT-PTMG-PU under different IPDI dosages

圖3 聚氨酯材料的形態(tài)圖 Fig.3 Digital pictures of PU

3.2 衰減全反射紅外光譜(ATR-IR)分析

以ATR-IR表征的樣品結(jié)構(gòu)變化示于圖4，其中紅色曲線表示水解前，藍(lán)色曲線表示飽和Na2CO3水解12 h后。由紅藍(lán)曲線對比可知，聚氨酯材料水解后1 640和1 388 cm-1處出現(xiàn)兩個新的吸收峰，這是因為水解后生成了COO-基團(tuán)。另外，3 401 cm-1處的吸收峰明顯變寬，這是由于樣品水解后產(chǎn)生優(yōu)異親水性的兩性離子導(dǎo)致出現(xiàn)結(jié)合水的峰。

3.3 表面親水性分析

采用接觸角表征不同飽和Na2CO3水解時間下聚氨酯材料的親水性變化。由圖5可知，未水解的聚氨酯材料接觸角為(81.5±1)°，水解3 h后接觸角為(78.8±1)°，水解6 h后接觸角為(56.4±1)°，水解12 h后接觸角為(32.4±2)°。由此可知，材料在飽和Na2CO3中水解時間越長，接觸角越小，親水性越強(qiáng)。這是因為聚氨酯材料中越來越多的兩性離子前體TECBT被水解成具有強(qiáng)烈親水性的兩性離子。由此說明，水解能增強(qiáng)聚氨酯材料的親水性。

圖4 聚氨酯材料的ATR-IR譜圖 Fig.4 ATR-IR spectra of PU

圖5 聚氨酯材料水解前后的接觸角 Fig.5 Water contact angles of PU

圖6 聚氨酯材料的相對蛋白質(zhì)吸附量與水解 時間的關(guān)系圖，以TCPS片為基準(zhǔn) Fig.6 Protein adsorption as a function of hydrolysis time of PU (normalized to TCPS)

3.4 抗非特異性蛋白質(zhì)吸附性能分析

ELISA具備很強(qiáng)的靈敏度，能清晰直觀地反應(yīng)聚氨酯材料防污性能的變化。由圖6分析可知，未水解的樣品相對蛋白質(zhì)吸附量為44.78%。飽和Na2CO3水解2 h后，吸附量快速下降至0.98%。經(jīng)過3 h水解后樣品的相對蛋白質(zhì)吸附量為0.25%，材料呈現(xiàn)最佳防污性能。并且水解12 h后，聚氨酯材料的相對蛋白質(zhì)吸附量為1.02%，仍然非常低，表明聚氨酯材料具有優(yōu)異持久的防污性能。與JI等[11]的研究相比，該材料的防污性能及長效性顯著提高。與WANG等[13]的研究相比，材料的抗蛋白吸附性能得以提高。這是因為縮短了兩性離子中氨基和羧基的距離，進(jìn)一步提高了防污性能。

3.5 抗細(xì)菌黏附性能分析

3.5.1 抗革蘭氏陽性細(xì)菌黏附性能分析

實驗采用S. aureus為革蘭氏陽性細(xì)菌模型。革蘭氏陽性細(xì)菌以膜蛋白等為黏附因子，故采用組織培養(yǎng)專用的TCPS作為對照組。圖7為TCPS和聚氨酯材料在細(xì)菌黏附染色后的熒光照片。由圖可知，S. aureus在TCPS表面大量黏附，在未水解的聚氨酯材料表面僅有少量黏附，而在水解后的聚氨酯表面沒有觀察到細(xì)胞黏附。未水解樣品中存在少量S. aureus黏附，可能是因為材料于S. aureus吸附的過程中輕微水解產(chǎn)生了對細(xì)菌吸附的抵抗力。這與聚氨酯材料的蛋白質(zhì)抗性一致(見圖6)。而水解后樣品無S. aureus吸附說明了聚氨酯材料水解后產(chǎn)生具有防污性能的兩性離子，有效抵抗了革蘭氏陽性細(xì)菌的黏附。

圖7 金黃色葡萄球菌表面吸附圖 Fig.7 S. aureus bacterial adhesion on the surfaces

3.5.2 抗革蘭氏陰性細(xì)菌黏附性能分析

實驗選用E.coli為革蘭氏陰性細(xì)菌模型。革蘭氏陰性細(xì)菌以菌毛等為黏附因子，不易在TCPS等疏水性材料表面黏附，易在聚乳酸(polylactide，PLA)等親水性材料表面黏附，故將對照組改用PLA。圖8為PLA和聚氨酯材料在細(xì)菌粘附染色后的熒光照片。由圖可知，E.coli在PLA表面大量黏附，而在未水解和水解后的聚氨酯材料表面均未觀察到細(xì)菌黏附。未水解樣品親水性較差，不能使E. coli黏附[16]，而水解后材料的防污性能有效抵抗了革蘭氏陰性細(xì)菌的黏附。

圖8 大腸桿菌表面黏圖 Fig.8 E. coli bacterial adhesion on the surfaces

3.6 抗動物細(xì)胞吸附性能分析

實驗采用HUVEC為動物細(xì)胞模型。圖9為TCPS和聚氨酯材料在細(xì)胞吸附染色后的熒光照片。由圖可知，HUVEC在TCPS表面大量吸附，而在未水解和水解后聚氨酯表面均未觀察到細(xì)胞吸附。未水解聚氨酯材料無細(xì)胞吸附可能是因為材料與細(xì)胞共培養(yǎng)的24 h內(nèi)，其輕微水解具有的防污性能就能有效抵抗細(xì)胞的吸附。水解后細(xì)胞在聚氨酯表面沒有吸附，說明了水解后聚氨酯材料能有效抵抗動物細(xì)胞的吸附。另外，水解后聚氨酯材料周邊的TCPS襯底上有HUVEC吸附生長，并且細(xì)胞呈現(xiàn)優(yōu)異生長狀態(tài)的梭形。由此表明，材料具有優(yōu)異的細(xì)胞相容性。良好的防污性能及細(xì)胞相容性使該材料在生物醫(yī)學(xué)、海洋防污等領(lǐng)域具有優(yōu)異的應(yīng)用前景[17]。

圖9 HUVEC細(xì)胞吸附圖 Fig.9 Typical microscopic images of HUVEC cells

4 結(jié) 論

(1) 本文設(shè)計合成的兩性離子前體TECBT合成簡便、純度高、產(chǎn)率佳，制得的聚氨酯材料具有優(yōu)異的成膜效果、表面致密性、彈性等物理性能。

(2) 采用ATR-IR和接觸角表征說明了聚氨酯材料水解后能形成親水性的兩性離子，具有防污性能。

(3) 防污實驗表明聚氨酯材料能強(qiáng)效長久地抵抗蛋白質(zhì)吸附。其中，飽和 Na2CO3水解 3 h 后呈現(xiàn)最佳防污效果，相對蛋白質(zhì)吸附量僅為 0.25%。同時，聚氨酯材料能有效的抗細(xì)菌黏附和動物細(xì)胞吸附，并且具有優(yōu)異的生物相容性。