多管發(fā)酵法和酶底物法檢測總大腸菌群的結(jié)果差異性

樓小平，林增飛

(寧波市自來水有限公司，浙江寧波 315000)

多管發(fā)酵法、酶底物法都是生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法中規(guī)定的檢測總大腸菌群的方法，其中多管發(fā)酵法為仲裁法。多管發(fā)酵法檢測步驟多，耗時長，一次典型的檢測需3 d；而酶底物法檢測方便，耗時短，一般能在24 h出結(jié)果，對檢測人員的專業(yè)技能要求低。因此，很多人傾向于選擇后者，但在實際工作中普遍存在困擾：兩種檢測方法的檢測結(jié)果經(jīng)常表現(xiàn)出較大的差異。本文采用兩種檢測方法檢測不同類型的樣品，對檢測結(jié)果進行了比較分析，并對造成結(jié)果差異的原因做了進一步研究和探討。

1 試驗方法與材料

1.1 試驗方法

(1)多管發(fā)酵法：《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》(GB 5750.12—2006)2.1節(jié)。

(2)酶底物法：《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法》(GB 5750.12—2006)2.3節(jié)中的51孔法。

(3)菌種鑒定：細(xì)菌16S rDNA基因測序鑒定方法，實驗室分離純化后送浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司鑒定。

(4)靈敏度測試：大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌CICC 23657、陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌 CICC 21539的新鮮培養(yǎng)物用無菌生理鹽水稀釋，然后吸取1 mL稀釋樣品分別接種到乳糖蛋白胨單倍培養(yǎng)基、MMO-MUG培養(yǎng)基試管中培養(yǎng)觀察，同時，以平板計數(shù)方法對接種量進行定量。MMO-MUG培養(yǎng)基試管制備：取MMO-MUG培養(yǎng)基1支，用90 mL無菌生理鹽水溶解混勻后分裝成10支試管，每支9 mL。

1.2 儀器與試劑

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、乳糖蛋白胨培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)、MMO-MUG培養(yǎng)基(IDEXX公司)、程控定量封口機、渦旋振蕩器、大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌CICC 23657(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)、陰溝腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌CICC 21539(中國工業(yè)微生物菌種保藏中心)。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩種方法檢測生活飲用水樣品

共檢測72個樣品，樣品來源包括管網(wǎng)水、末梢水、二次供水，結(jié)果如表1所示。

表1 生活飲用水樣品比對結(jié)果 Tab.1 Comparison Results of Drinking Water Samples

2.2 兩種方法檢測污染樣品

污染樣品檢測結(jié)果如表2所示。

表2 污染樣品比對結(jié)果 Tab.2 Comparison Results of Contaminated Water Samples

注：1～11號樣品為水廠進口水源水；12～19號樣品為城市內(nèi)河水用生理鹽水稀釋100倍

2.3 兩種方法檢測大腸埃希氏菌加標(biāo)樣品

加標(biāo)樣品以大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌CICC 23657新鮮培養(yǎng)物用無菌生理鹽水稀釋制備，結(jié)果如表3所示。

表3 大腸埃希氏菌加標(biāo)樣品比對結(jié)果Tab.3 Comparison Results of Escherichia coli Spiked Samples

2.4 靈敏度測試

靈敏度測試結(jié)果如表4所示。

表4 靈敏度測試比對結(jié)果Tab.4 Comparison Results of Sensitivity Tests

注：大腸埃希氏菌CICC 23657每種濃度平行接種5管；陰溝腸桿菌CICC 21539每種濃度平行接種3管；接種量由平板計數(shù)法進行定量(雙平板讀數(shù))；“+”表示陽性，“-”表示陰性

2.5 討論

2.5.1 不同類型樣品的檢測結(jié)果分析

對19份污染樣品檢測結(jié)果(表2)作對數(shù)處理后進行配對t檢驗，P<0.05，檢測結(jié)果有顯著性差異。對大腸埃希氏菌加標(biāo)樣品進行了兩組比對(表3)，比對一組的結(jié)果對數(shù)處理后進行配對t檢驗，P>0.05，檢測結(jié)果無顯著性差異；比對二組進行了重復(fù)性測試，兩種方法的結(jié)果均值分別為51 MPN/(100 mL)和49 MPN/(100 mL)，再次驗證了兩者結(jié)果的一致性。72份生活飲用水樣品檢測結(jié)果(表1)顯示，兩種檢測方法結(jié)果均為陰性，無法比較兩種檢測方法的結(jié)果差異。兩種方法檢測不同類型樣品，其結(jié)果的差異性表現(xiàn)有所不同，而方法的特異性、靈敏度是微生物檢測影響結(jié)果的重要因素，以下為具體分析內(nèi)容。

2.5.2 方法特異性

總大腸菌群一般是指一群能在35～37 ℃條件下24～48 h發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，主要包括埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、腸桿菌屬[1]。《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 5750.12—2006)中酶底物法對總大腸菌群的定義是指能在選擇性培養(yǎng)基上產(chǎn)生β-半乳糖苷酶的細(xì)菌群組。微生物發(fā)酵乳糖主要依靠乳糖滲透酶、β-半乳糖苷酶的參與。β-半乳糖苷酶在動物組織、植物和微生物中廣泛存在[2]。王維梅等[3]曾對β-半乳糖苷酶檢測腸桿菌的特異性進行了研究，通過3次重復(fù)檢測克雷伯氏菌，均得到了陰性結(jié)果。本實驗室從兩種方法結(jié)果差異較大的樣品中分離出兩株菌株，經(jīng)重復(fù)測試，乳糖蛋白胨培養(yǎng)24～72 h，陰性(無明顯產(chǎn)酸產(chǎn)氣)；MMO-MUG培養(yǎng)24 h，陽性，經(jīng)細(xì)菌16S rDNA基因測序鑒定為桑樹腸桿菌Enterobactermori(R18-2)、路氏腸桿菌Enterobacterludwigii(EN-119)；乳糖蛋白胨對這兩種腸桿菌未表現(xiàn)出特異性。由此可見，兩種方法對總大腸菌群的定義有區(qū)別，兩種方法檢測的目標(biāo)菌也存在一定的差異?？偞竽c菌群作為糞便污染指示菌，從來不是細(xì)菌分類學(xué)上的單一屬種，酶底物法在國際上得到廣泛應(yīng)用。

表2中，水廠進口水源水大腸埃希氏菌含量明顯比城市內(nèi)河水稀釋樣低，污染程度相對較低，酶底物法與多管發(fā)酵法檢測結(jié)果的比值相應(yīng)地比后者高，最高甚至達(dá)到了400倍，而內(nèi)河水稀釋樣最高只有6倍。王晉宇等[4]曾對長江水域地表水樣品和太湖水域地表水樣品進行比對，結(jié)果顯示長江水域地表水樣品檢測結(jié)果無統(tǒng)計意義上的差異，而太湖水域地表水樣品的檢測結(jié)果有較大的區(qū)別(多管發(fā)酵法基本未檢出)。因此，兩種方法檢測結(jié)果的差異大小可能與檢測樣品的污染程度有一定關(guān)聯(lián)，不同污染程度樣品的細(xì)菌種類組成不同。而表1中兩種方法檢測72份生活飲用水樣品的結(jié)果均為陰性，其中5份樣品的菌落總數(shù)達(dá)300～580 CFU/mL，這可能與生活飲用水樣品經(jīng)消毒處理后細(xì)菌種類組成相對簡單有關(guān)。

2.5.3 方法靈敏度

靈敏度是指從眾多菌中檢測到目標(biāo)菌的能力，參考《食品微生物檢驗方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》(SNT 3266—2012)。本試驗只考察了兩種方法培養(yǎng)基對大腸埃希氏菌CICC 23657、陰溝腸桿菌(CICC 21539)的檢測表現(xiàn)。表4在相同的接種量下(接種量用平板計數(shù)法定量，表中結(jié)果為兩個平板的讀數(shù))，乳糖蛋白胨和MMO-MUG培養(yǎng)基對大腸埃希氏菌的靈敏性未表現(xiàn)出差異，產(chǎn)生陽性結(jié)果的時間(培養(yǎng)時間為18 h以上)和陽性管數(shù)均較為一致。對于陰溝腸桿菌，在接種量為8～28 CFU時，乳糖蛋白胨在培養(yǎng)時間為18 h時就已經(jīng)有明顯的陽性結(jié)果。而MMO-MUG培養(yǎng)基在培養(yǎng)28 h后還沒有陽性結(jié)果(培養(yǎng)時間為48 h時有明顯的陽性結(jié)果)，對陰溝腸桿菌(CICC 21539)表現(xiàn)出較明顯的遲滯效應(yīng)，靈敏度弱于多管發(fā)酵法的乳糖蛋白胨。這與王晉宇等[4]的試驗結(jié)果有明顯的差異，他們發(fā)現(xiàn)陰溝腸桿菌(CICC 22927)接種量為200 MPN/100 mL以下時，多管發(fā)酵法具有明顯的發(fā)酵延遲現(xiàn)象，這是否是由于試驗所用的陰溝腸桿菌菌株不同需進一步驗證。另外，楊毓環(huán)等[5]也曾檢出乳糖發(fā)酵遲緩的產(chǎn)氣腸桿菌。在實際樣品檢測中，靈敏度還可能會受到更多因素的影響，比如不同類細(xì)菌之間的競爭。

3 結(jié)論

(1)多管發(fā)酵法和酶底物法檢測總大腸菌群結(jié)果差異的大小與樣品的細(xì)菌種類組成有關(guān)，而多管發(fā)酵法和酶底物法檢測原理的不同導(dǎo)致檢測的目標(biāo)菌有一定的差異，是兩者結(jié)果差異的根本原因。

(2)酶底物法對腸桿菌屬中的桑樹腸桿菌、路氏腸桿菌有特異性，而多管發(fā)酵法未表現(xiàn)出特異性。酶底物法對陰溝腸桿菌(CICC 21539)的靈敏性不如多管發(fā)酵法，表現(xiàn)出較明顯的遲滯效應(yīng)。

(3)酶底物法在檢測時效性、便捷性上具有不容忽視的優(yōu)點，可作為生產(chǎn)企業(yè)檢測控制手段，但如果用作產(chǎn)品合格檢驗或仲裁檢測時應(yīng)慎重，統(tǒng)一總大腸菌群定義是當(dāng)前急需解決的問題。